分子印跡陣列固相微萃取用于檢測果蔬中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留

楚耀娟，張雪娜，向孝哲，李秀娟,*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.寧波譜尼測試技術(shù)有限公司，浙江 寧波 315040）

有機(jī)磷農(nóng)藥（organophosphorus pesticides，OPPs）的分析檢測一直都是科學(xué)工作者研究的重點(diǎn)與熱點(diǎn)[1-4]。傳統(tǒng)的色譜方法，具有靈敏度高、分離效果好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，但設(shè)備昂貴，前處理方法復(fù)雜、耗時長且往往不允許現(xiàn)場檢測。生物傳感器選擇性高，可以反復(fù)多次使用，分析速度快、儀器體積小，適合現(xiàn)場測定[5-7]，但是生物傳感器目前仍存在純化成本高、熱穩(wěn)定性差和準(zhǔn)確性不足的問題[8]。除此之外，傳感器往往是在預(yù)處理好的樣品中應(yīng)用，而且分析物僅限于一種或幾種農(nóng)藥[9-12]。因此，OPPs的常用檢測方法仍然是基于色譜法，但是樣品必須經(jīng)過一系列復(fù)雜的前處理，所以，發(fā)展操作簡單快速、高靈敏度、高選擇性、高效率、低成本的前處理技術(shù)是目前農(nóng)藥殘留檢測工作的首要任務(wù)。固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）裝置小巧便于攜帶，操作簡單，易于與多種儀器聯(lián)用而且容易實(shí)現(xiàn)分析自動化，將萃取裝置帶回實(shí)驗(yàn)室或使用便攜式儀器還可進(jìn)行現(xiàn)場測定[13-15]。

近年來，分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）被引入到SPME涂層材料中，使SPME在食品、藥物和生物樣品等[16-20]復(fù)雜基質(zhì)中對目標(biāo)分子和結(jié)構(gòu)類似物具有更高的選擇性和靈敏性，并且具有良好的物理和化學(xué)穩(wěn)定性[21]。但是傳統(tǒng)的SPME萃取頭固定相體積有限，樣品容量有限，影響方法的靈敏度和分析通量。增加涂層的厚度是提高SPME涂層萃取量的有效方法之一，但該方法在提高萃取量的同時，也延長了達(dá)到萃取平衡所需的時間，從而影響整體分析效率。用多根萃取頭代替單一萃取頭的SPME裝置是一種很好的選擇，可以在不影響SPME優(yōu)勢的情況下提高靈敏度。Lee等[22]同時使用4 根萃取頭（50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS））從單個樣品的頂空萃取香氣成分，以提高香氣物質(zhì)的靈敏度。結(jié)果表明，萃取化合物的總峰面積隨萃取頭數(shù)量的增加而增加。Hu Yuling等[23]建立在線管內(nèi)SPME方法，以PEEK管為在線萃取單元，將氧氟沙星和磺胺二甲嘧啶2 種分子印跡萃取頭裝在PEEK管內(nèi)，同時萃取兩類抗生素藥物，發(fā)現(xiàn)這種裝置可以同時富集復(fù)雜樣品中的目標(biāo)分析物。這些研究表明，在不增加涂層厚度的情況下利用多根萃取頭組裝在一起，構(gòu)建外觀與傳統(tǒng)SPME裝置相同的分子印跡陣列SPME裝置，不僅可以增加萃取容量，還可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系多目標(biāo)物并行處理，降低方法的檢出限，提高分析通量。

本實(shí)驗(yàn)分別以水胺硫磷、二嗪農(nóng)為模板分子，聚乙二醇為功能單體，采用溶膠-凝膠法制備2 種MIP萃取頭，構(gòu)建分子印跡陣列SPME裝置。前期研究[24-25]已經(jīng)證實(shí)了這2 種MIP萃取頭分別對模板分子及其結(jié)構(gòu)類似物具有良好的選擇性、熱穩(wěn)定性（約350 ℃）和化學(xué)穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)將重點(diǎn)研究分子印跡陣列SPME裝置的選擇性以及萃取性能，并將其應(yīng)用于蔬菜和水果中常見的5 種OPPs的萃取，擬建立果蔬中多種OPPs殘留的檢測方法，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)中OPPs的高通量分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果、馬鈴薯均購自當(dāng)?shù)爻?。丙酮、乙酸乙酯、無水硫酸鈉、聚乙二醇20000（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水胺硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%）百靈威科技有限公司；二嗪農(nóng)、喹硫磷、甲基對硫磷和甲基嘧啶磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL，1 mL） 中國計(jì)量科學(xué)研究院。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-6890A型氣相色譜（gas chromatography，GC）儀山東魯南瑞虹化工有限公司；N2000色譜數(shù)據(jù)工作站浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司；SE-54毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm） 蘭州中科安泰分析科技有限公司；CAN型氮?dú)鈿錃庖惑w機(jī) 武漢科林普豐儀有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿(mào)有限公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TG-16G型離心機(jī)上海安亭儀器有限公司；自制SPME手柄；商用SPME手柄、商用50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB和85 μm聚丙烯酸酯（polyacrylate，PA）萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及溶液配制

樣品預(yù)處理：分別取100 g樣品可食部分切碎，加入50 mL超純水，高速勻漿，放置于棕色瓶中，密封，置于4 ℃冰箱保存。

揮干標(biāo)準(zhǔn)溶液中的溶劑，用甲醇配制農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各物質(zhì)質(zhì)量濃度分別為二嗪農(nóng)、甲基嘧啶磷、喹硫磷均為0.005 mg/mL；甲基對硫磷質(zhì)量濃度為0.01 mg/mL；水胺硫磷質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，置于4 ℃冰箱保存。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液根據(jù)需要用甲醇稀釋。

1.3.2 陣列SPME裝置及對比裝置的研制

水胺硫磷分子印跡萃取頭（isocarbophos molecularly imprinted polymers，I-MIP）、二嗪農(nóng)分子印跡萃取頭（diazinon molecularly imprinted polymers，D-MIP）和非分子印跡萃取頭（non-imprinted polymers，NIP）參照文獻(xiàn)[24,26]制備，涂層厚度約為32 μm。選擇2 種印跡萃取頭各兩根，安裝在自制陣列手柄上，構(gòu)建分子印跡陣列SPME裝置。為考察該陣列裝置的萃取性能，分別構(gòu)建裝有厚度32 μm I-MIP、D-MIP及NIP萃取頭的單根SPME裝置，及裝有2 種印跡萃取頭的雙根SPME裝置（D-IMIP）。各裝置均在GC進(jìn)樣口中于N2保護(hù)下250 ℃老化2 h，280 ℃老化0.5 h，然后在醋酸-甲醇（1∶9，V/V）溶液中洗脫，重復(fù)操作直至解吸萃取頭時無明顯雜峰。

諾亞方舟是虛構(gòu)的故事，第一，是由在事實(shí)上的不可能作證明；第二是它是承繼的亞述大洪水故事的傳說?！赌ξ魑褰?jīng)》后面的書目記錄了以色列對亞述文明的傳承：如戴麗所譯《兩河流域神話：創(chuàng)世、洪水、吉加美士史詩等》、阿斯曼所著《埃及人摩西：西方一神教對埃及的記憶》、克羅斯所著《迦南神話與希伯來史詩》，等等。

1.3.3 SPME程序及GC條件

SPME萃取在10 mL萃取小瓶中進(jìn)行，采用頂空萃取方式，樣品量為4 mL，NaCl加入量為0.4 g/mL，70 ℃萃取40 min后于GC進(jìn)樣口250 ℃解吸8 min。分子印跡陣列萃取頭性能評價時，5 種OPPs加標(biāo)質(zhì)量濃度為甲基對硫磷50 μg/L，水胺硫磷250 μg/L，二嗪農(nóng)、甲基嘧啶磷和喹硫磷的質(zhì)量濃度均為12.5 μg/L。高質(zhì)量濃度加標(biāo)水平各物質(zhì)質(zhì)量濃度為上述值的5 倍。

SE-54毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；GC以高純氮?dú)鉃檩d氣，柱頭壓為0.03 MPa，氫氣0.02 MPa，空氣0.04 MPa，尾吹0.02 MPa；不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度250 ℃；氮磷檢測器溫度270 ℃，銣珠電流3.2 A。柱室升溫程序：初溫80 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升到100 ℃，以5 ℃/min升到120 ℃，再以8 ℃/min升到180 ℃，保持2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 2 種分子印跡涂層的選擇性

表 1 2 種印跡涂層的選擇性Table 1 Selectivity of two kinds of MIP-coated fibers

印跡因子（imprinting factor，IF）是MIP萃取頭與NIP萃取頭對目標(biāo)物所得萃取峰面積的比值。IF大于1.0，說明MIP萃取頭對目標(biāo)物具有一定的選擇性；IF越大，表示選擇性越強(qiáng)，識別效果越好[27]。如表1所示，I-MIP涂層對其模板分子水胺硫磷IF為1.50，D-MIP對其模板分子二嗪農(nóng)IF為1.66，與其他類似方法制備的溶膠-凝膠MIP涂層相似[26,28]。對于D-MIP，由于甲基嘧啶磷與二嗪農(nóng)的結(jié)構(gòu)相似，均含有嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)、磷脂基團(tuán)，IF較高為1.61；對于I-MIP，除喹硫磷以外，其他物質(zhì)的IF都較接近，主要原因是這些物質(zhì)結(jié)構(gòu)較為相似?？傮w來看，這2 種MIP萃取頭對OPPs都表現(xiàn)出一定的萃取選擇性。

2.2 萃取能力

2.2.1 自制陣列SPME裝置和商用萃取頭萃取率比較

圖 1 陣列SPME裝置、NIP及3 種商用萃取頭對OPPs萃取率比較Fig. 1 Comparison of extraction efficiencies of five pesticides with array-SPME device, NIP fiber and three commercial fibers

從圖1可以看出，陣列SPME裝置對5 種有機(jī)磷的萃取效果遠(yuǎn)大于NIP及3 種商用SPME萃取頭。由于溶膠-凝膠材料具有優(yōu)異的性能，即使NIP涂層的厚度只有32 μm，遠(yuǎn)低于商業(yè)萃取頭的厚度，也顯示出很好的萃取能力。

2.2.2 不同SPME裝置對農(nóng)藥萃取率的比較

圖 2 不同萃取裝置萃取率比較Fig. 2 Comparison of extraction abilities of different devices

如圖2所示，除水胺硫磷和二嗪農(nóng)外，其他3 種有機(jī)磷的響應(yīng)值隨著萃取頭根數(shù)增加，均有不同程度的增大，與Lee等[22]的研究結(jié)果類似。對于2 種模板分子，2 根萃取頭裝置表現(xiàn)出很高的萃取能力，萃取率遠(yuǎn)優(yōu)于單根萃取頭，但萃取頭由2 根增加到4 根，裝置對二者的萃取量并沒有顯著增加，原因可能是從單根增加到2 根后，裝置已經(jīng)將樣品中的絕大多數(shù)目標(biāo)物萃取出來，再增加萃取頭數(shù)量時，響應(yīng)值增加不明顯。

圖 3 高質(zhì)量濃度時2 種SPME裝置萃取率比較Fig. 3 Comparison of extraction efficiencies of two SPME devices for high spiked levels

2.2.3 各裝置對非結(jié)構(gòu)類似物的萃取率

選取4 種與模板分子結(jié)構(gòu)差異較大的物質(zhì)間二甲苯、2-辛醇、癸醛和辛酸乙酯作為參照物，評價裝置的選擇性。結(jié)果見圖4。I-MIP與NIP對這些參照物的萃取效果相當(dāng)，說明MIP涂層對4 種參照物是非特異性識別萃取，但隨著萃取頭數(shù)目的增加，萃取率顯著增加。

圖 4 不同萃取裝置對參照物的萃取率Fig. 4 Comparison of extraction efficiencies of reference materials using different SPME devices

2.3 萃取動力學(xué)

如圖5a所示，對于單根非印跡萃取頭，大多數(shù)目標(biāo)物在萃取時間為60 min時接近萃取平衡。如圖5b所示，對于陣列SPME裝置，萃取時間達(dá)到40 min后，OPPs均增加緩慢，萃取時間為50 min時，5 種農(nóng)藥萃取量略有波動但基本穩(wěn)定。與單根非印跡萃取頭相比，陣列SPME裝置達(dá)到平衡所需時間縮短，這可能是由于陣列SPME裝置萃取率大于單根非印跡萃取頭，大大增加了傳質(zhì)速率，加快了萃取平衡。對于陣列裝置，萃取時間40 min與50 min萃取量差別不大，考慮到分析時間和分析通量的問題，選擇萃取時間為40 min。對于單根非印跡萃取頭，50 min時萃取量比40 min增加明顯，但是即使是50 min的萃取量也比陣列裝置的小得多。綜合考慮，所有實(shí)驗(yàn)的萃取時間均為40 min。

圖 5 單根非印跡萃取頭（a）和陣列SPME裝置（b）對5 種農(nóng)藥的萃取時間曲線Fig. 5 Extraction time profiles of five pesticides with single NIP fiber (a)and array-SPME device (b)

2.4 方法評價

表 2 線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和精密度Table 2 Linear ranges, correlation coefficients, and precision of the proposed method and its comparison with other methods in detection limits

在蘋果基質(zhì)中，在分子印跡陣列SPME裝置最優(yōu)條件下，采用頂空SPME與GC聯(lián)用的方法測定5 種OPPs的線性范圍、檢出限和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，如表2所示。陣列SPME裝置對OPPs有較高的萃取率，方法的線性范圍寬，線性相關(guān)系數(shù)好，5 種OPPs的檢出限低（0.002 8～0.043 6 μg/kg），連續(xù)5 次重復(fù)操作所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～11.7%，檢出限低于其他方法。方法的檢出限遠(yuǎn)低于GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》。

以回收率評價方法的準(zhǔn)確度，用本研究建立的方法檢測市場上購買的果蔬，均未檢出OPPs殘留。在樣品中添加OPPs，考察方法的回收率和精密度。分別在蘋果和馬鈴薯基質(zhì)中添加高、中、低3 個水平的加標(biāo)量，測定其加標(biāo)回收率，2 種基質(zhì)、3 個加標(biāo)水平下的回收率在78.7%～122.8%之間，表明本方法具有良好的可靠性，結(jié)果見表3、圖6。

表 3 加標(biāo)蘋果和馬鈴薯樣品回收率Table 3 Recoveries for five pesticides in spiked apple and potato samples

圖 6 單根非印跡萃取頭和陣列SPME裝置與GC聯(lián)用檢測蘋果中加標(biāo)農(nóng)藥譜圖Fig. 6 SPME-GC chromatograms of spiked apple samples using single NIP extraction fiber and array-SPME device

3 結(jié) 論

本研究構(gòu)建一種分子印跡陣列SPME裝置，用于選擇性萃取果蔬樣品中的痕量OPPs多殘留。與傳統(tǒng)的分子印跡SPME裝置相比，該裝置增加了萃取容量，提高了方法的靈敏度，降低了檢出限，增加了分析通量，準(zhǔn)確度高，選擇性和重復(fù)性好，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系多目標(biāo)物并行處理。該分子印跡陣列SPME裝置為在復(fù)雜基質(zhì)中對多目標(biāo)物進(jìn)行分離測定提供新思路。