雙波長瑞利光散射技術(shù)檢測糕點(diǎn)類食品中的甜蜜素

江 虹，陳明朗

（長江師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 408100）

甜蜜素是一種人工合成添加劑，具有增強(qiáng)食品甜味的功能，它的甜度是蔗糖的30～50 倍，鑒于此，食品業(yè)在較多市售飲料及某些焙烤食品中均添加甜蜜素作為甜味型添加劑。隨著食品毒理學(xué)研究方法的發(fā)展，人們對食品添加劑可能對人體造成的慢性毒性、致畸、致癌、致突變等作用有了新的認(rèn)識，并引起人們的高度重視。美國和日本已禁止使用甜蜜素作為食品甜味添加劑，中國、歐盟及新西蘭等國則對食品中添加甜蜜素作出嚴(yán)格規(guī)定。我國GB 2760—2014《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定各種飲料中的甜蜜素不得超過0.65 g/kg，焙烤食品蛋糕及面包中的甜蜜素不得超過1.6 g/kg，餅干中的甜蜜素不得超過0.65 g/kg等?？梢?，對食品中甜蜜素含量進(jìn)行研究有著重要意義。近年來，國內(nèi)外對食品中甜蜜素檢測進(jìn)行了大量的研究工作，主要方法有高效液相色譜法[1-4]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5-15]、電化學(xué)法[16-19]、分光光度法[20-21]、氣相色譜法[22-25]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[26]等。高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的前處理工作相對較為繁瑣，日常運(yùn)行費(fèi)用較高；電化學(xué)法要求特殊電極，對實(shí)驗(yàn)條件要求較高；分光光度法的靈敏度不高，選擇性欠佳。采用雙波長瑞利光散射（dual-wavelength Rayleigh light scattering，DWO-RLS）技術(shù)研究食品中甜蜜素的檢測方法，RLS技術(shù)是近年新發(fā)展起來的一種簡便、高靈敏（可達(dá)納克級）的檢測技術(shù)，已廣泛用于生物大分子、無機(jī)物及有機(jī)物的分析中，尤其在藥物分析中應(yīng)用甚多[27-29]，而在食品分析中相對較少[30]。本實(shí)驗(yàn)以燦爛綠作探針，借助燦爛綠與甜蜜素反應(yīng)生成具有2 個(gè)強(qiáng)散射峰的締合物，建立了簡便、快速測定甜蜜素的DWORLS方法，目前尚鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。該法用于食品中低脂蛋糕、面包及餅干中甜蜜素的測定，結(jié)果滿意。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低脂類蛋糕（1#、2#）、餅干（3#、4#、5#、6#）及面包（7#、8#、9#、10#）（脂肪＜15%） 重慶市售；甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.3%） 中國食品藥品檢定研究院；燦爛綠（分析純） 上海邁瑞爾化學(xué)技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris，分析純） 上海吉至生化科技有限公司；HCl（分析純） 重慶川東（化工）集團(tuán)有限公司；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-2500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司；TD5A-WS離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-200VDE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；pHS-3C精密酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司；EL104電子天平 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取甜蜜素0.020 12 g，加水溶解后定容至100 mL，即配成1.00×10-3mol/L貯備液，取貯備液稀釋100 倍，配成1.00×10-5mol/L操作液，于冰箱4 ℃保存。燦爛綠溶液：稱取適量燦爛綠，用水溶解后配成1.00×10-4mol/L。Tris-HCl溶液：pH 3.0～9.8（用pH計(jì)測定0.20 mol/L Tris和0.10 mol/L HCl的混合液）。

1.3.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取低脂蛋糕、餅干及面包樣品各2 g左右（精確至±0.000 1 g）于小燒杯中，加適量水，水浴中溫?zé)帷嚢?，浸?0 min，加10 mL無水乙醇（沉淀蛋白），攪拌、熱水浴中超聲20～30 min，4 500 r/min離心5～10 min，上清液用水定容至100 mL，待用。

1.3.3 RLS強(qiáng)度的測定

取10 mL具塞比色管，準(zhǔn)確加入0.00～2.50 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 9.27 Tris-HCl溶液及3.00 mL燦爛綠溶液，用水稀至刻度。待反應(yīng)20 min后，在熒光分光光度計(jì)（λex=λem=220 nm，Ex=2.5 nm，Em=5.0 nm）上掃描RLS光譜，用DWO-RLS（341 nm+470 nm）法測定溶液的RLS強(qiáng)度IRLS（體系）、I0（試劑空白）及RLS增強(qiáng)強(qiáng)度ΔIRLS（341+470）（ΔIRLS=IRLS-I0）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)掃描3 次，平行測定3～5 份，各數(shù)據(jù)以平均值表示，用Excel作數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，Origin制圖，Word中插入表格制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜蜜素與燦爛綠的RLS光譜特征

燦爛綠與甜蜜素的反應(yīng)原理：燦爛綠在溶液中以陽離子形式存在，而甜蜜素在溶液中，分子上的Na+離去后以環(huán)己基氨基磺酸根陰離子形式存在。帶正電荷的燦爛綠與帶負(fù)電荷的甜蜜素以靜電引力結(jié)合生成二元離子締合物，使RLS顯著增強(qiáng)，并產(chǎn)生具有2 個(gè)強(qiáng)的特征瑞利散射峰的新光譜，在2 個(gè)特征散射峰處，甜蜜素濃度與RLS增強(qiáng)強(qiáng)度有一定的線性關(guān)系，可用于甜蜜素的定量分析。

圖 1 甜蜜素與燦爛綠的RLSFig. 1 Rayleigh light scattering spectra of cyclamate and brilliant green

從圖1可知，甜蜜素溶液和燦爛綠溶液自身的RLS信號均十分微弱（曲線1和曲線2）。當(dāng)在燦爛綠的堿性溶液（pH 9.27 Tris-HCl溶液）中加入不同濃度的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液后，二者互相反應(yīng)生成離子締合物，新物質(zhì)的生成使RLS顯著增強(qiáng)，并產(chǎn)生具有2 個(gè)強(qiáng)的特征散射峰的新RLS光譜（曲線3～8），最大RLS峰位于341 nm，次大RLS峰位于470 nm，在296、452、463、484 nm及494 nm等多處出現(xiàn)小的RLS峰。在2 個(gè)強(qiáng)散射峰處，隨著加入的甜蜜素溶液濃度的增大，體系的RLS強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，且呈良好的線性關(guān)系，因此，若選擇341 nm或470 nm作為測定波長，均可用單波長瑞利光散射（single wavelength Rayleigh light scattering，SWO-RLS）法測定甜蜜素的含量，且有高的靈敏度。采用DWO-RLS（341 nm+470 nm）法測定時(shí)，因散射強(qiáng)度具有加和性，可大幅提高方法的測定靈敏度（約為SWO-RLS法的2 倍）。故實(shí)驗(yàn)選用DWO-RLS法定量測定甜蜜素。

2.2 適宜條件的確定

2.2.1 Tris-HCl溶液pH值及用量

取1.00 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液、2.00 mL燦爛綠溶液，按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，考察1.00 mL不同pH值的Tris-HCl溶液在用SWO-RLS法和DWO-RLS法測定時(shí)對甜蜜素-燦爛綠體系ΔIRLS的影響（n=3）。從圖2可知，當(dāng)pH＜7時(shí)，ΔIRLS值很小，說明溶液pH值不合適，甜蜜素與燦爛綠基本不反應(yīng)或少量反應(yīng)；當(dāng)pH＞7時(shí)，隨著pH值的逐漸增大，ΔIRLS隨之增大，當(dāng)pH 9.27時(shí)，ΔIRLS達(dá)最大，之后有所下降；這說明甜蜜素與燦爛綠反應(yīng)的最適pH值為pH 9.27，pH值大于或小于9.27，不利于甜蜜素與燦爛綠的完全反應(yīng)，因此，ΔIRLS有所下降。隨即考察pH 9.27 Tris-HCl溶液用量對體系ΔIRLS的影響（n=3），結(jié)果表明，適宜用量為1.00 mL。從圖2還可知，用DWORLS法測定的靈敏度比單波長法高。

圖 2 溶液酸度對ΔIRLS的影響Fig. 2 Effect of solution acidity on ΔIRLS

2.2.2 燦爛綠濃度

取1.00 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 9.27 Tris-HCl溶液，按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，考察SWO-RLS法和DWO-RLS法測定時(shí)燦爛綠濃度對甜蜜素-燦爛綠體系ΔIRLS的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)燦爛綠濃度為3.00×10-5mol/L時(shí)，ΔIRLS達(dá)最大，當(dāng)燦爛綠濃度為0.50×10-5～3.00×10-5mol/L范圍時(shí)，隨著濃度增大，體系的ΔIRLS隨之增大；當(dāng)燦爛綠濃度為3.00×10-5～4.00×10-5mol/L范圍時(shí)，隨著濃度增加，體系ΔIRLS不斷下降。原因是當(dāng)燦爛綠濃度低于3.00×10-5mol/L時(shí)，因用量不夠，甜蜜素反應(yīng)不完全；當(dāng)燦爛綠濃度大于3.00×10-5mol/L時(shí)，用量過多導(dǎo)致自聚作用增強(qiáng)，影響其與甜蜜素的完全反應(yīng)。從圖3還可知，用DWO-RLS法測定的靈敏度比SWO-RLS法高。

圖 3 燦爛綠濃度對ΔIRLS的影響Fig. 3 Effect of brilliant green concentration on ΔIRLS

2.2.3 試劑加入順序

取1.00 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 9.27 Tris-HCl溶液和3.00 mL 燦爛綠溶液，按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，考察這幾種物質(zhì)的不同加入順序在用SWORLS法和DWO-RLS法測定時(shí)對甜蜜素-燦爛綠體系ΔIRLS的影響。結(jié)果表明，ΔIRLS相對最大（ΔIRLS（341）=422，ΔIRLS（470）=346，ΔIRLS（341+470）=768），靈敏度最高的試劑加入順序?yàn)樘鹈鬯厝芤?、Tris-HCl溶液、燦爛綠溶液。故實(shí)驗(yàn)按此最佳試劑加入順序進(jìn)行。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間及穩(wěn)定性

按選定的各物質(zhì)的最佳條件及試劑的最佳加入順序，加入1.00 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液、1.00 mL pH 9.27 Tris-HCl溶液和3.00 mL燦爛綠溶液，按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，用DWO-RLS法考察甜蜜素與燦爛綠的反應(yīng)在0～100 min內(nèi)生成的新物質(zhì)對ΔIRLS的影響。實(shí)驗(yàn)表明，20 min內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，ΔIRLS逐漸增大，到20 min達(dá)最大（ΔIRLS（341+470）=824）；20 min后，隨著反應(yīng)時(shí)間的不斷延長，ΔIRLS不再增大，基本處于同一平臺。故實(shí)驗(yàn)選在20 min后測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)參數(shù)

按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，配制0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。用SWO-RLS法和DWO-RLS法測定各溶液的ΔIRLS（341）、ΔIRLS（470）及ΔIRLS（341+470），作ΔIRLS-ρ標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)見表1?？梢姡肈WO-RLS測定的靈敏度比SWO-RLS法更高。DWO-RLS檢測樣品的定量限分別為1.05 mg/100 g（蛋糕）、0.974 mg/100 g（餅干）和0.994 mg/100 g（面包）。

表 1 甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)參數(shù)Table 1 Calibration curve equations, detection wavelengths, LOD and LOQ for cyclamate detected by different RLS methods

2.4 共存物質(zhì)的影響

按1.3.3節(jié)RLS強(qiáng)度的測定方法，考察相對誤差≤±5%時(shí)，某些共存物質(zhì)對測定0.201 mg/L甜蜜素的干擾情況，見表2。結(jié)果顯示，氨基酸、糖類及常見絕大多數(shù)陰、陽離子不干擾甜蜜素的測定。故本方法有良好的選擇性。

表 2 共存物質(zhì)的影響Table 2 Effect of coexistent substances

2.5 樣品分析

2.5.1 樣品測定結(jié)果

移取1.3.2節(jié)已制備的各待測液0.30 mL代替1.3.3節(jié)中的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)操作液，并按1.3.3節(jié)方法加入其他試劑溶液，用水定容至10 mL。在選定的熒光儀條件下掃描RLS光譜，用DWO-RLS法測定341 nm和470 nm波長處待測液的甜蜜素含量（各平行測定5 份），計(jì)算出原食品樣中甜蜜素含量，并與國標(biāo)法（GB 1886.37—2015《食品添加劑 環(huán)己基氨基磺酸鈉（又名甜蜜素）》）測定結(jié)果對照，結(jié)果見表3。

表 3 樣品分析結(jié)果Table 3 Analytical results of samples

2.5.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表 4 樣品加標(biāo)回收率（n=5）Table 4 Recoveries for spiked samples (n= 5)

按1.3.2節(jié)方法稱取已粉碎、混勻的各食品樣2 g左右（精確至±0.000 1 g），加適量水后，再加入0.50～2.50 mL范圍的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)貯備液，后續(xù)操作按1.3.2節(jié)樣品處理方法制備各待測液。取該待測液0.30 mL，按1.3.3節(jié)方法測定甜蜜素含量，并計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（各平行測定5 份），以判斷新方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見表4。樣品的加標(biāo)回收率（n=5）為97.3%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）為1.1%～2.6%，說明本方法具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

3 結(jié) 論

依據(jù)甜蜜素與燦爛綠的締合反應(yīng)，采用DWO-RLS法測定低脂食品中的甜蜜素，具有方法簡便、操作簡單及有很高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)，方法選擇性良好，準(zhǔn)確度和精密度符合定量分析要求，樣品處理安全、簡單，測定成本低，易于普及，適于糕點(diǎn)類食品的批量分析。