喹乙醇印跡傳感器的制備及其在喹噁啉類(lèi)藥物殘留快檢中的應(yīng)用

田景升，李東東，趙玲鈺，高文惠

（河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

喹噁啉類(lèi)藥物是通過(guò)化學(xué)合成在喹噁啉環(huán)2、3位引入不同官能團(tuán)的一類(lèi)廣譜抗菌促生長(zhǎng)劑，可有效地抑制細(xì)菌DNA合成，具有良好的抗菌和抗球蟲(chóng)作用；同時(shí)可促進(jìn)蛋白同化、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，被廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]，常見(jiàn)產(chǎn)品結(jié)構(gòu)式如圖1所示。其中喹乙醇（olaquindox，OLA）、卡巴氧（carbadox，CBX）已被證明具有不同程度的致畸性、致突變性和致癌作用[2-3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部頒布的第2638號(hào)公告及250號(hào)公告中明確指出，禁止在食用動(dòng)物中使用OLA和CBX[4-5]。由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所研制合成的乙酰甲喹（mequindox，MEQ）、喹烯酮（quinocetone，QCT），在保留傳統(tǒng)喹噁啉類(lèi)藥物抗菌活性的同時(shí)，大大降低了其毒性作用，可用于食品動(dòng)物養(yǎng)殖中，但有研究表明MEQ、QCT仍具有一定毒性[6-7]。然而仍有不法商家為擴(kuò)大藥物的作用范圍，在其他藥物中非法添加MEQ、QCT，造成其混亂使用，并且不能執(zhí)行休藥期，造成食品動(dòng)物中2 種藥物的殘留。目前對(duì)于喹噁啉類(lèi)藥物的檢測(cè)方法主要有液相色譜法[8-9]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[10]、電化學(xué)法[11]以及免疫層析法[12]等，但由于動(dòng)物源性樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，獸藥制劑之間的檢測(cè)方法差距較大，靈敏度不在同一個(gè)數(shù)量級(jí)，而且藥物成分之間存在相互干擾，會(huì)對(duì)檢測(cè)造成不利影響[13]。因此，為了有效進(jìn)行食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控，確保消費(fèi)者飲食健康，有必要建立一種快速、靈敏且抗干擾能力強(qiáng)的檢測(cè)方法對(duì)食品中喹噁啉類(lèi)藥物殘留進(jìn)行測(cè)定。

圖 1 4 種喹噁啉類(lèi)藥物結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structures of four quinoxalines

分子印跡技術(shù)的出現(xiàn)起源于免疫學(xué)，其基本原理模仿了生物界的鎖-匙原理，類(lèi)似于抗原-抗體結(jié)合[14]。模板分子與功能單體在一定的條件下混合，通過(guò)聚合的方式形成具有特異性識(shí)別的多重結(jié)合位點(diǎn)，再通過(guò)浸泡、超聲、電位誘導(dǎo)等方式將模板分子去除后，所得分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）具有與模板分子大小和形狀相匹配的三維空穴，這種印跡空穴對(duì)模板分子以及模板分子的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物具有特異選擇性[15-16]。并以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)可預(yù)測(cè)性、識(shí)別特異性和應(yīng)用廣泛性等特點(diǎn)，在環(huán)境[17]、食品[18]、藥物[19]及天然產(chǎn)物[20]等各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。將MIP對(duì)目標(biāo)物質(zhì)特異性識(shí)別的特點(diǎn)與電化學(xué)分析快速檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合研制出的分子印跡電化學(xué)傳感器（molecularly imprinted electrochemical sensor，MIECS），由聚合物膜（識(shí)別元件）和不同類(lèi)型的信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成，利用印跡分子進(jìn)入印跡膜前后電活性探針或印跡分子本身電化學(xué)信號(hào)的變化進(jìn)行檢測(cè)[21-22]。近年來(lái)，隨著傳感器在電化學(xué)領(lǐng)域的不斷發(fā)展和進(jìn)步，MIECS已應(yīng)用于各種食品[23]、環(huán)境[24]、藥物[25]等領(lǐng)域的分析檢測(cè)工作中。

雖然分子印跡技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)分子的選擇性識(shí)別，但傳統(tǒng)的MIP制備技術(shù)仍存在吸附能力低、擴(kuò)散阻力大、傳質(zhì)速率慢等不足，因此對(duì)分子印跡技術(shù)的改進(jìn)以提高其靈敏度仍是目前的研究熱點(diǎn)。研究表明，使用復(fù)合功能單體制備的MIP比僅單一功能單體具有更好的選擇性[26-27]。復(fù)合功能單體含有不同種類(lèi)的功能基團(tuán)，模板分子與官能團(tuán)之間經(jīng)過(guò)聚合之后會(huì)形成多種識(shí)別位點(diǎn)，可以增強(qiáng)MIP的選擇性，同時(shí)由于MIP中功能單體之間形成了不同種類(lèi)的聚合結(jié)構(gòu)交聯(lián)在一起，可以提高M(jìn)IP的穩(wěn)定性。另外采用石墨烯[28]、納米銀[29]、納米金[30]等材料對(duì)工作電極進(jìn)行修飾，可以增大電極比表面積、增強(qiáng)電極的導(dǎo)電性能。

目前，基于納米石墨烯與納米銀溶膠作為修飾材料、并采用復(fù)合型功能單體制備的OLA分子印跡電化學(xué)傳感器的制備鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以O(shè)LA為模板分子，鄰氨基苯酚（o-aminophenol，OAP）和間苯二酚（resorcinol，RC）為復(fù)合功能單體，通過(guò)電化學(xué)分析結(jié)合紫外光譜法篩選功能單體并優(yōu)化二者比例，采用滴涂的方式制備納米石墨烯與納米銀溶膠修飾電極，通過(guò)電聚合的方法得到MIP膜，成功制備OLA分子印跡電化學(xué)傳感器，并應(yīng)用于食品中喹噁啉類(lèi)藥物快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、豬肉、鰈魚(yú)、鮮蝦 市購(gòu)。

OLA（純度98%）、CBX（純度98%）、MEQ（純度98%）、QCT（純度99%）、鄰苯二胺（o-phenylenediamine，OPD）（純度99%）、對(duì)巰基苯胺（4-aminothiophenol，4-ATP）（純度98%）、RC（純度99%）、OAP（純度98%）、石墨烯（純度＞99.5%）、殼聚糖（chitosan，CS）（脫乙酰度≥95%）美國(guó)阿拉丁試劑有限公司；硝酸銀（純度≥99.8%）、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、鐵氰化鉀、濃硫酸、檸檬酸三鈉、乙酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純） 成都欣正通化工有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660E型電化學(xué)工作站、三電極系統(tǒng)（CHI104玻碳電極、CHI115鉑絲電極、CHI111 Ag/AgCl電極）上海辰華儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檸檬酸三鈉還原制備納米銀溶膠

根據(jù)Lee等[31]的報(bào)道，通過(guò)改進(jìn)最常用的檸檬酸三鈉還原的方法制備納米銀溶膠。將0.008 g硝酸銀固體加水溶解后定容至50 mL，超聲混勻；將配制好的硝酸銀溶液，加熱攪拌至微沸時(shí)迅速加入1.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，保持沸騰并持續(xù)攪拌，當(dāng)溶液顏色變?yōu)榱咙S色時(shí)停止加熱，冷卻至室溫，得到納米銀溶膠，密封避光保存。

1.3.2 石墨烯修飾劑的制備

取0.02 g石墨烯加入10 mL DMF，經(jīng)攪拌、超聲分散后與20 g/L的CS-1% CH3COOH溶液等體積混合，磁力攪拌30 min制得石墨烯修飾劑，密封冷藏保存。

1.3.3 紫外光譜法考察功能單體及與模板分子的比例

1.3.3.1 模板分子與不同功能單體的紫外光譜測(cè)定

配制5 mmol/L OLA溶液、10 mmol/L功能單體（OAP、RC、OPD、4-ATP）乙腈溶液。取OLA溶液及4 種功能單體乙腈溶液各50 μL分別定容至10 mL；另外固定OLA溶液50 μL，分別配制OLA與4 種不同功能單體濃度比為1∶2的混合溶液，以及將4 種功能單體兩兩組合分別與OLA溶液配制成濃度比為1∶2∶2的混合溶液，將上述溶液用乙腈定容至10 mL；將上述溶液超聲30 min，冷藏環(huán)境中靜置11 h，進(jìn)行紫外掃描。

1.3.3.2 不同比例功能單體與模板分子紫外光譜測(cè)定

取1.3.3.1節(jié)配制的OLA、OAP、RC溶液，固定OLA溶液50 μL，分別配制模板分子與2 種功能單體濃度比為1∶1∶1～1∶6∶6的6 種不同梯度的混合溶液，用乙腈定容至10 mL，超聲30 min，冷藏環(huán)境中靜置11 h，用紫外光譜掃描不同的混合溶液。

1.3.4 OLA分子印跡電化學(xué)傳感器的制備

1.3.4.1 電極預(yù)處理

玻碳電極按參考文獻(xiàn)[32]方法進(jìn)行預(yù)處理。

1.3.4.2 OLA分子印跡電化學(xué)傳感器的制備

用石墨烯修飾劑/納米銀溶膠復(fù)合物對(duì)預(yù)處理電極進(jìn)行修飾，滴涂到電極表面，用紅外燈烘干，得到石墨烯/AgNO3修飾電極；將修飾電極置于聚合液（5 mmol/L OLA、20 mmol/L OAP、20 mmol/L RC）中，在-0.2～1.2 V電位下循環(huán)伏安（cyclic voltammetry，CV）掃描25 圈得到電聚合膜，將聚合后的電極浸入10 mL乙醇-0.4 mol/L NaOH溶液（3∶1，V/V）中洗脫20 min去除模板分子，制得OLA分子印跡電化學(xué)傳感器，即得到帶有特異識(shí)別空穴的MIP膜。非印跡電極（non-molecularly imprinted electrochemical sensor，NIECS）作為對(duì)照，除不添加模板分子OLA外，其他與印跡電極制備方法一致。

1.3.4.3 電化學(xué)檢測(cè)條件

1.3.5 樣品處理

取2 g（±0.01 g）樣品（雞蛋、豬肉、鰈魚(yú)、鮮蝦）置于50 mL離心管中，分2 次提取，先加入10 mL乙腈溶液，依次進(jìn)行振蕩、超聲、離心（4 000 r/min）10 min，靜置后從離心管中取出上清液，將剩余殘?jiān)俅渭尤? mL乙腈二次提取，將2 次上清液合并，用乙腈定容至20 mL，待測(cè)[32-33]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Origin 2018軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及圖形處理，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3 次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 石墨烯修飾條件的選擇與優(yōu)化

表 1 石墨烯在不同分散劑中分散效果Table 1 Dispersibility of graphene in different dispersants

比較不同分散劑對(duì)石墨烯的分散效果以及在電極表面的附著與分布效果，結(jié)果如表1所示。單獨(dú)使用CS-1% CH3COOH溶液作為分散劑時(shí)，石墨烯的分散顆粒大小不均一；DMF單獨(dú)分散石墨烯時(shí)，因受其物理特性影響，修飾液在電極表面附著效果不佳。因此，實(shí)驗(yàn)采用分散效果穩(wěn)定的DMF將石墨烯分散后，所得分散液再與附著性良好的CS-1% CH3COOH溶液等體積混合得到石墨烯修飾劑。將適量石墨烯修飾劑滴涂到電極表面，修飾效果較好。

為使石墨烯修飾劑在電極表面穩(wěn)定修飾且不影響石墨烯的導(dǎo)電作用，實(shí)驗(yàn)固定分散劑用量，對(duì)石墨烯用量進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)比較不同石墨烯用量（5、10、20、30、40 mg）所修飾電極的電流響應(yīng)，以考察石墨烯用量對(duì)修飾效果的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著石墨烯用量增加，CV曲線(xiàn)氧化還原峰電流強(qiáng)度明顯增加，說(shuō)明電極經(jīng)石墨烯修飾可提高其電導(dǎo)性；在石墨烯用量為20 mg時(shí)，峰電流最高，這時(shí)氧化與還原峰電流比接近1∶1；當(dāng)石墨烯用量超過(guò)20 mg，電流強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，其原因是石墨烯用量超出了所用分散劑的分散能力，致使修飾劑中的石墨烯產(chǎn)生團(tuán)聚而降低其電導(dǎo)性，另外石墨烯用量過(guò)多還會(huì)使修飾膜厚度增加影響電流響應(yīng)。

圖 2 石墨烯修飾劑用量的優(yōu)化Fig. 2 Optimization of graphene dosage

2.2 還原劑和納米銀溶膠的優(yōu)化

圖 3 檸檬酸三鈉用量（A）和納米銀溶膠質(zhì)量濃度（B）的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of trisodium citrate dosage (A) and nanosized silver sol concentration (B)

由于還原劑用量會(huì)直接影響納米銀溶膠形成的速度，實(shí)驗(yàn)首先優(yōu)化還原劑檸檬酸三鈉的用量。分別考察0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL的1%檸檬酸三鈉溶液，對(duì)修飾效果的影響。如圖3A所示，隨著檸檬酸三鈉用量增加，電極經(jīng)納米銀溶膠修飾前后其電流響應(yīng)增幅逐漸增大，當(dāng)檸檬酸三鈉用量為1.5 mL時(shí)，響應(yīng)電流增幅幾乎達(dá)到最大，繼續(xù)增加還原劑用量響應(yīng)電流增幅趨于穩(wěn)定，說(shuō)明1.5 mL的檸檬酸三鈉可使所配制的硝酸銀溶液中的銀離子充分還原，且當(dāng)檸檬酸三鈉為1.5 mL時(shí)修飾在電極上效果最佳，因此實(shí)驗(yàn)確定檸檬酸三鈉的用量為1.5 mL。考察質(zhì)量濃度分別為0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 g/L的納米銀溶膠對(duì)修飾效果的影響。如圖3B所示，修飾電極的峰電流響應(yīng)信號(hào)隨著AgNO3溶液質(zhì)量濃度逐漸增加而增大；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.16 g/L時(shí)，峰電流值達(dá)到最大。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)0.16 g/L后，納米銀粒子的還原達(dá)到飽和，峰電流不再增加。綜上，納米銀溶膠的最佳質(zhì)量濃度為0.16 g/L。

2.3 OLA分子印跡電化學(xué)傳感器制備條件的優(yōu)化

2.3.1 功能單體的選擇和模板分子與功能單體的比例優(yōu)化

圖 4 OLA與OAP-RC及其混合體系的紫外吸收光譜Fig. 4 Ultraviolet absorption spectra of OLA, OAP-RC and their mixed system

OLA作為喹噁啉氧化物類(lèi)物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)上含有羰基、胺基、羥基等極性基團(tuán)較多，因此考慮采用氫鍵作用力這種非共價(jià)鍵的形式組裝模板分子與功能單體。使用紫外光譜法結(jié)合電化學(xué)分析，在4 種含有極性基團(tuán)的常用功能單體及其兩兩組合的6 種復(fù)合型功能單體中進(jìn)行篩選。通過(guò)測(cè)定OLA與不同功能單體之間紫外吸光度理論值與實(shí)測(cè)值之差ΔA，考察各功能單體與OLA之間氫鍵作用力的大小。單一功能單體與OLA的ΔA分別為OAP：0.352 2、RC：0.349 3、OPD：0.232 8、4-ATP：0.347 1。復(fù)合功能單體與OLA的ΔA分別為OAP-RC：1.182 4、OAP-OPD：1.177 6、OAP-4-ATP：1.180 5、RC-OPD：1.176 6、RC-4-ATP：1.142 3、OPD-4-ATP：1.031 5。比較上述結(jié)果可知OLA與OAP-RC之間的ΔA最大，結(jié)果如圖4所示，因此可判斷OLA與OAP-RC之間的作用力最大。因此實(shí)驗(yàn)選擇OAP-RC為最佳復(fù)合功能單體。

圖 5 模板分子與功能單體比例的優(yōu)化Fig. 5 Optimization of ratio of template molecules to functional monomers

聚合體系中模板分子與功能單體之間的比例是影響MIP膜上印跡識(shí)別位點(diǎn)的關(guān)鍵因素之一，若功能單體濃度過(guò)低會(huì)減少印跡位點(diǎn)的形成，降低MIP膜的選擇性和傳感器的抗干擾能力；濃度過(guò)高則會(huì)使功能單體無(wú)規(guī)則締合，降低檢測(cè)靈敏度[34]。因此需要對(duì)功能單體與模板分子比例進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)采用紫外光譜法進(jìn)行掃描，當(dāng)最大吸收波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸光度趨于平緩時(shí)，說(shuō)明模板分子與功能單體之間的作用趨于穩(wěn)定，此時(shí)平緩區(qū)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)作為最佳比例。由圖5可知，當(dāng)OLA與OAP、RC的比例在1∶4∶4之前吸光度的變換穩(wěn)定上升，在濃度比超過(guò)1∶4∶4后吸光度變化趨于平緩。由此推斷二者的最佳比為1∶4∶4。

2.3.2 聚合電解質(zhì)及其pH值的選擇

圖 6 不同電解質(zhì)聚合峰電流曲線(xiàn)Fig. 6 Polymerization peak current curves of different electrolytes

實(shí)驗(yàn)選取PBS、醋酸鈉、氯化鉀、氯化銨4 種常用的聚合電解質(zhì)溶液，在相同聚合條件下，使復(fù)合功能單體OAP-RC和模板分子OLA分別在4 種電解質(zhì)溶液（pH 7.0）中進(jìn)行電聚合，通過(guò)CV測(cè)量在不同電解質(zhì)溶液中聚合后印跡電極的電流響應(yīng)，以研究不同聚合電解質(zhì)溶液對(duì)聚合過(guò)程產(chǎn)生的影響。如圖6曲線(xiàn)a所示，PBS作為電解質(zhì)溶液時(shí)，響應(yīng)峰電流最高，峰電位較小，且洗脫模板分子后效果最佳，可形成較多穩(wěn)定的印跡位點(diǎn)，因此實(shí)驗(yàn)選擇PBS作為最佳電解質(zhì)溶液。

圖 7 電解質(zhì)pH值的優(yōu)化Fig. 7 Optimization of electrolyte pH

電解質(zhì)溶液pH值會(huì)影響模板分子與功能單體之間的相互作用，進(jìn)而對(duì)聚合反應(yīng)產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)考察pH 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的PBS溶液對(duì)聚合反應(yīng)影響，結(jié)果由圖7所示，當(dāng)pH 7.0時(shí)，聚合后響應(yīng)峰電流最大，成膜最穩(wěn)定，聚合效果最好。綜上所述，最佳聚合電解質(zhì)溶液為PBS（pH 7.0）。

2.3.3 聚合電位和聚合圈數(shù)的選擇

根據(jù)模板分子和功能單體相互作用的成膜電位，考察-0.2～1.4、-0.2～1.2、-0.2～1.0、0～1.2、0～1.4 V 5 種不同電位范圍對(duì)聚合效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0～1.4、0～1.2、-0.2～1.0 V電位范圍進(jìn)行聚合后，所形成的聚合物膜不穩(wěn)定，在洗脫過(guò)程中出現(xiàn)了不同程度的脫落現(xiàn)象；當(dāng)電位在-0.2～1.2 V范圍時(shí)聚合物膜穩(wěn)定，洗脫效果良好；進(jìn)一步擴(kuò)大電位范圍至-0.2～1.4 V時(shí)，出現(xiàn)模板分子洗脫困難的現(xiàn)象，其原因是電位過(guò)高會(huì)加強(qiáng)模板分子與功能單體之間作用力的強(qiáng)度，使得模板分子難以洗脫；所以選擇-0.2～1.2 V的電位范圍作為最佳聚合電位。

圖 8 聚合圈數(shù)的優(yōu)化Fig. 8 Optimization of number of polymerization circles

聚合物膜的薄厚，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生直接影響[35]。聚合物膜過(guò)薄，所形成印跡位點(diǎn)較少、選擇性低、抗干擾能力弱且膜不穩(wěn)定易脫落；聚合物膜過(guò)厚會(huì)使模板分子被包埋在MIP膜內(nèi)，造成洗脫困難等影響，降低傳感器靈敏度。因此聚合過(guò)程中常通過(guò)調(diào)整掃描圈數(shù)實(shí)現(xiàn)控制聚合物膜厚度的目的，結(jié)果如圖8所示，隨著聚合圈數(shù)的增加，響應(yīng)電流不斷增大，在聚合20 圈時(shí)響應(yīng)峰電流最高，繼續(xù)增加聚合圈數(shù)，響應(yīng)電流降低。亦即聚合20 圈時(shí)，聚合物膜所形成的印跡位點(diǎn)較多；超過(guò)20 圈后模板分子因聚合物膜過(guò)厚而出現(xiàn)被包埋而難以洗脫的現(xiàn)象，導(dǎo)致無(wú)法形成更多的印跡位點(diǎn)，降低了靈敏度。綜上，確定聚合圈數(shù)為20 圈。

2.4 分子印跡膜的聚合過(guò)程

圖 9 MIP膜的電聚合曲線(xiàn)Fig. 9 Electro-polymerization curve of MIP membrane

實(shí)驗(yàn)采用CV法進(jìn)行電聚合，由圖9可以看出，MIP形成過(guò)程不可逆。聚合第1圈時(shí)氧化峰出現(xiàn)在0.347 V，且峰電流達(dá)到263 μA；當(dāng)聚合第2圈后，峰電流值迅速降低，隨著聚合圈數(shù)的增加，峰電流逐漸降低并趨近于0，表明此時(shí)形成了致密穩(wěn)定且不導(dǎo)電的聚合物膜。將聚合后的電極放置于探針離子溶液中表征，由于電子轉(zhuǎn)移受到聚合膜的阻礙，幾乎沒(méi)有氧化還原峰電流出現(xiàn)，再將分子印跡膜置于洗脫劑中洗脫去除模板分子后，得到帶有印跡空穴的MIP膜。

2.5 模板分子洗脫條件的選擇與優(yōu)化

圖 10 NaOH濃度（A）和洗脫時(shí)間（B）對(duì)洗脫效果的影響Fig. 10 Optimization of NaOH concentration (A) and elution time (B)

選取0.5 mol/L H2SO4-50%甲醇（1∶1，V/V）、0.5 mol/L HCl-50%甲醇（1∶1，V/V）、0.5 mol/L H2SO4-50%乙醇（1∶1，V/V）、0.5 mol/L HCl-50%乙醇（1∶1，V/V）、乙醇-0.4 mol/L NaOH溶液（3∶1，V/V）作為洗脫劑，將聚合好的電極分別置于上述洗脫劑中浸泡洗脫20 min后表征發(fā)現(xiàn)，在酸性溶液中難以破壞模板分子與功能單體間的氫鍵，致使OLA不易被洗脫，形成的印跡空穴較少，峰電流響應(yīng)信號(hào)弱；當(dāng)電極置于堿性溶液中洗脫后表征出現(xiàn)了氧化還原峰電流，表明此時(shí)模板分子已從聚合物膜中洗脫形成印跡空穴。為了獲得更好的洗脫效果，優(yōu)化了洗脫液中的NaOH濃度。由圖10A所示，隨著NaOH濃度的增加，洗脫后氧化峰電流逐漸增大，當(dāng)濃度超過(guò)0.4 mol/L時(shí)，洗脫模板分子后峰電流異常增大，這是由于NaOH濃度過(guò)高破壞了分子印跡膜而使其脫落。因此，選擇乙醇-0.4 mol/L NaOH溶液（3∶1，V/V）作為最佳洗脫劑。由圖10B可以看出，隨著洗脫時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，洗脫后的電極響應(yīng)峰電流逐漸增大，當(dāng)洗脫時(shí)間達(dá)到20 min后，峰電流值趨于穩(wěn)定，因此模板分子的最佳洗脫時(shí)間為20 min。

2.6 傳感器吸附性能考察

2.6.1 靜態(tài)吸附曲線(xiàn)

圖 11 靜態(tài)吸附曲線(xiàn)Fig. 11 Static adsorption curves

將MIECS與NIECS分別在不同濃度的OLA標(biāo)準(zhǔn)溶液中靜態(tài)吸附10 min后，表征吸附后響應(yīng)電流值，如圖11所示。吸附后MIECS的電流變化遠(yuǎn)高于NIECS，其原因是MIECS特異吸附OLA后，其上的印跡空穴被OLA占據(jù)，阻礙了探針離子穿過(guò)聚合物膜發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使吸附前后電流響應(yīng)產(chǎn)生較大的變化；而NIECS吸附前后的電流變化很小，可見(jiàn)NIECS對(duì)OLA的吸附量很小，說(shuō)明NIECS未形成大小形狀與OLA互補(bǔ)的印跡空穴，不能產(chǎn)生特異性吸附作用，而僅以物理吸附的方式吸附少量OLA。

2.6.2 吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

圖 12 吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig. 12 Adsorption kinetic curves

將MIECS與NIECS分別在0.1 mmol/L的OLA標(biāo)準(zhǔn)溶液中進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，每2 min測(cè)定一次電流響應(yīng)，結(jié)果如圖12所示。MIECS隨著吸附時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化峰電流逐漸減小，吸附10 min后峰電流不再下降，表明MIECS上的印跡空穴幾乎全部被OLA占據(jù)，阻礙了探針離子的氧化還原，此時(shí)MIECS吸附至飽和；相比之下NIECS的電流變化較為緩慢，直至吸附14 min后變化趨于平緩，說(shuō)明NIECS對(duì)OLA的吸附能力遠(yuǎn)小于MIECS，進(jìn)一步驗(yàn)證了NIECS未形成形狀大小與OLA互補(bǔ)的印跡空穴。

2.7 傳感器的印跡效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)通過(guò)SWV表征MIECS的印跡效應(yīng)。由圖13可以看出，石墨烯與納米銀溶膠修飾電極后氧化峰電流達(dá)到最大，曲線(xiàn)a表明電極修飾效果良好；聚合后的電極幾乎沒(méi)有出現(xiàn)氧化峰，曲線(xiàn)d表明此時(shí)功能單體之間以及模板分子與功能單體相互作用，在修飾電極表面形成了一層近乎絕緣的聚合物膜；當(dāng)電極置于洗脫劑中浸泡洗脫模板分子后，再一次出現(xiàn)氧化峰響應(yīng)信號(hào)，曲線(xiàn)b說(shuō)明此時(shí)模板分子已被去除得到印跡空穴，進(jìn)而可使探針離子在電極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移；將洗脫模板分子后的電極重新置于模板分子OLA標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附后發(fā)現(xiàn)，氧化峰電流值再次降低，曲線(xiàn)c表明部分模板分子又重新占據(jù)到印跡空穴表面，阻礙了電子轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果分析，該傳感器具有良好的印跡效應(yīng)。

圖 13 不同電極在探針溶液中的SWV曲線(xiàn)Fig. 13 SWV curves of different electrodes in probe solution

2.8 傳感器的選擇性

圖 14 印跡傳感器的選擇性Fig. 14 Selectivity of the sensor

實(shí)驗(yàn)對(duì)模板分子OLA在內(nèi)的4 種喹噁啉類(lèi)藥物以及與喹噁啉類(lèi)結(jié)構(gòu)相差較大的氯霉素作為干擾物質(zhì)對(duì)印跡傳感器的選擇性進(jìn)行考察。將制備好的印跡電極分別置于0.1 mmol/L的5 種目標(biāo)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液中浸泡進(jìn)行吸附性實(shí)驗(yàn)，并采用SWV法對(duì)吸附前后的氧化峰電流變化值進(jìn)行測(cè)定。通過(guò)圖14中氧化峰電流變化值可以看出，傳感器對(duì)模板分子OLA的氧化峰電流變化值最大，對(duì)其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物CBX、MEQ、QCT的氧化峰電流變化值有所降低，對(duì)干擾物質(zhì)幾乎沒(méi)有峰電流響應(yīng)。其原因是CBX、MEQ、QCT與MIP膜上印跡空穴的大小、形狀、識(shí)別位點(diǎn)不能完全契合，相比于OLA進(jìn)入印跡空穴的量有所減少，因此吸附前后的氧化峰電流變化值小于OLA；而氯霉素的結(jié)構(gòu)與OLA相差較大，難以進(jìn)入印跡空穴，故其氧化峰電流變化值小。該結(jié)果表明傳感器對(duì)4 種喹噁啉類(lèi)藥物均具有特異識(shí)別作用，其中對(duì)OLA的選擇性最高，表明該傳感器抗干擾能力強(qiáng)。

2.9 印跡傳感器的分析性能與應(yīng)用

2.9.1 線(xiàn)性關(guān)系與檢出限

圖 15 4 種不同濃度的目標(biāo)物質(zhì)線(xiàn)性關(guān)系Fig. 15 Linear relationship curves of four target analytes at different concentrations

實(shí)驗(yàn)在最優(yōu)條件下，分別配制了OLA、CBX、MEQ、QCT的不同濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.003 μmol/L～0.8 mmol/L），通過(guò)SWV法4 種目標(biāo)物質(zhì)在其不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液中吸附前后的峰電流變化值進(jìn)行測(cè)定。以氧化峰電流變化值（ΔI）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)值（-lgC）為橫坐標(biāo)作圖考察該傳感器對(duì)4 種目標(biāo)物的線(xiàn)性關(guān)系。由圖15可以看出，模板分子及其結(jié)構(gòu)類(lèi)似物均在一定濃度范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，如表2所示，模板分子OLA的線(xiàn)性方程為ΔI=-1.344 9lgC+12.766，R2=0.999 1，檢出限為1.0×10-9mol/L。結(jié)果表明該MIECS能夠滿(mǎn)足4 種喹噁啉類(lèi)藥物的檢測(cè)需求。

表 2 4 種目標(biāo)物的線(xiàn)性關(guān)系及檢出限Table 2 Linear calibration and detection limits of four target analytes

2.9.2 回收率與精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最優(yōu)條件下，分別在3 個(gè)添加水平下進(jìn)行樣品加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。OLA樣品加標(biāo)平均回收率在89.05%～100.86%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）在1.03%～3.11%之間（n=5），表明該快速檢測(cè)方法回收率與精密度良好。

表 3 樣品加標(biāo)回收率和精密度（n=5）Table 3 Recoveries and precision for spiked samples (n= 5)

2.9.3 重復(fù)性與穩(wěn)定性結(jié)果

實(shí)驗(yàn)平行制備3 支印跡傳感器通過(guò)SWV連續(xù)洗脫吸附20 次，考察傳感器的重復(fù)性。對(duì)模板分子OLA標(biāo)準(zhǔn)溶液洗脫吸附后，該3 支傳感器的峰電流響應(yīng)信號(hào)RSD分別為1.57%、1.64%、1.91%，表明電極重復(fù)性良好；將制備好的3 支印跡電極置于4 ℃保存，分別放置1、2、3 周后再對(duì)電極進(jìn)行測(cè)定，峰電流響應(yīng)信號(hào)RSD分別為1.37%、2.58%、3.09%，表明電極具有良好的穩(wěn)定性。

2.9.4 實(shí)際樣品檢測(cè)及該快檢方法與其他文獻(xiàn)比較

針對(duì)小樣本量樣品（雞蛋、豬肉、鰈魚(yú)、鮮蝦）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為實(shí)際樣品中未檢出上述4 種喹噁啉類(lèi)藥物。

以喹噁啉類(lèi)藥物中OLA的檢測(cè)為例，將OLA印跡傳感器檢測(cè)方法與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道的OLA檢測(cè)方法進(jìn)行比較，由表4可知，該方法檢出限低，線(xiàn)性范圍寬。而且該方法抗干擾能力強(qiáng)，檢測(cè)快速，滿(mǎn)足實(shí)際樣品的檢測(cè)要求。

表 4 該方法與其他測(cè)定OLA的方法比較Table 4 Comparison of this method with other methods for the determination of OLA

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)基于檸檬酸三鈉還原硝酸銀制備納米銀溶膠結(jié)合納米石墨烯修飾工作電極，有效提高了其電導(dǎo)性；以O(shè)LA為模板分子，通過(guò)紫外光譜法結(jié)合電化學(xué)分析篩選OAP-RC作為復(fù)合型功能單體，并對(duì)其在聚合體系中所占配比進(jìn)行考察；采用電聚合法制備MIP膜，優(yōu)化制備條件：以PBS（pH 7.0）作為支持電解質(zhì)溶液，在-0.2～1.2 V電位下聚合20 圈；在乙醇-0.4 mol/L NaOH溶液（3∶1，V/V）中洗脫20 min去除模板分子后，成功制備OLA分子印跡電化學(xué)傳感器；對(duì)該傳感器的印跡效果和選擇性進(jìn)行考察，該傳感器印跡效果好，且可特異性識(shí)別喹噁啉類(lèi)藥物，有較強(qiáng)的抗干擾能力；該方法對(duì)喹噁啉類(lèi)藥物線(xiàn)性范圍寬，檢出限在1.0×10-9～2.7×10-8mol/L之間，OLA樣品加標(biāo)回收率為89.05%～100.86%，RSD不高于3.11%。該傳感器具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，選擇性好，可快速測(cè)定實(shí)際樣品中喹噁啉類(lèi)藥物殘留。