米糠酸敗誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化對(duì)米糠清蛋白界面性質(zhì)的影響

吳曉娟，吳 偉,2,*

（1.稻谷及副產(chǎn)物深加工國家工程實(shí)驗(yàn)室，中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410111）

米糠是稻谷加工中最重要的一類副產(chǎn)物，包括豐富的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膳食纖維以及谷維素、谷甾醇、生育酚等生理活性物質(zhì)[1]。目前全球米糠年產(chǎn)量約2 930萬 t，而中國作為世界上最大的稻米生產(chǎn)國和消費(fèi)國，米糠年產(chǎn)量在1 400萬 t以上[2-3]。米糠脫脂后的蛋白質(zhì)含量高達(dá)15%～20%，是一種豐富而價(jià)廉的植物蛋白資源。米糠蛋白因其氨基酸組成合理、致敏性低以及良好的溶解性、乳化性，作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑或天然乳化劑廣泛應(yīng)用于飲料、肉制品、焙烤制品等多種食品[1]。米糠蛋白是一種混合蛋白，根據(jù)Osborne分級(jí)，可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白[4]。清蛋白是米糠蛋白中含量最高（達(dá)24%～43%）的組分，由于分子表面帶有足夠的靜電荷并且鮮有S—S交聯(lián)或聚集，是維持米糠蛋白界面性質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者[5]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)米糠清蛋白還具有非常好的抗氧化性和降血糖活性，可作為功能因子或活性成分載體應(yīng)用于特醫(yī)食品或醫(yī)藥領(lǐng)域[6]。

然而，全球每年90%的米糠都被直接用作畜禽飼料，綜合利用水平較低，嚴(yán)重限制了米糠蛋白等資源的深度開發(fā)和利用[7]。造成米糠資源綜合利用水平較低的重要原因是新鮮米糠極易酸敗變質(zhì)。新鮮米糠中含有18%～22%的脂質(zhì)，其中80%以上為不飽和脂肪酸甘油酯，同時(shí)還含有活性較強(qiáng)的脂肪水解酶、脂肪氧合酶、過氧化物酶等多種酶[7]。在米糠穩(wěn)定化之前的貯藏和加工過程中，脂肪水解酶可快速水解脂質(zhì)形成亞油酸等游離的多不飽和脂肪酸，使米糠酸值在短短幾個(gè)小時(shí)之內(nèi)快速增加；游離出來的亞油酸以及含亞油酸的脂肪酸酯在脂肪氧合酶作用下可形成脂質(zhì)氫過氧化物；脂質(zhì)氫過氧化物通過自動(dòng)氧化或酶促催化形成自由基和揮發(fā)性羰基化合物[8]。理論上，這些脂質(zhì)氧化產(chǎn)物可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化，并且有研究已證實(shí)米糠酸敗誘導(dǎo)的氧化修飾使米糠蛋白的結(jié)構(gòu)特征和體外消化性發(fā)生了極其復(fù)雜的變化[9-10]。米糠酸敗過程中蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化除了會(huì)影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，必然還會(huì)影響其界面性質(zhì)的發(fā)揮，但目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于米糠酸敗影響米糠蛋白及其主要組分界面性質(zhì)的深入研究。因此，本研究通過分析米糠貯藏過程中米糠清蛋白氧化程度和結(jié)構(gòu)特征的變化，并將這些變化與米糠清蛋白的界面性質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析，從蛋白質(zhì)氧化角度剖析米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白界面性質(zhì)的影響，為開發(fā)和應(yīng)用米糠蛋白資源提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮米糠 湖南糧食集團(tuán)長(zhǎng)沙分公司；標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白 上海生化研究所；正己烷、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FMHE-36雙螺桿擠壓中試生產(chǎn)線 湖南富馬科公司；LYNX 6000高速冷凍離心機(jī) 美國賽默飛世爾公司；FD5-4冷凍干燥機(jī) 美國金西盟公司；F4600熒光光度計(jì) 日本日立公司；Nano ZS納米粒度分析儀英國馬爾文公司；LC-20高效液相色譜儀、IR-100傅里葉紅外光譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 米糠清蛋白的制備

參照Wu Xiaojuan等[9]的方法，將新鮮米糠粉碎過450 μm篩，在溫度25 ℃、相對(duì)濕度85%下存放0～10 d得到不同酸敗程度的米糠。然后用雙螺桿擠壓中試生產(chǎn)線對(duì)米糠進(jìn)行穩(wěn)定化處理。穩(wěn)定化條件：米糠含水量16%，進(jìn)料速率15 kg/h，第2區(qū)至第6區(qū)溫度分別為70、120、120、70 ℃和60 ℃。穩(wěn)定化后再次將米糠粉粹過450 μm篩，并立即用正己烷按料液比1∶4（g/mL）對(duì)米糠粉末進(jìn)行脫脂處理，回收米糠毛油（酸值4～40 mg/g）和脫脂米糠。參考Adebiyi等[4]的方法，將脫脂米糠與去離子水按料液比1∶8（g/mL）混合，40 ℃攪拌萃取2 h，然后將懸浮液在4 ℃、8 000 r/min離心20 min，分離沉淀和上清液。將上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至4.0，靜置20 min后在4 ℃、8 000 r/min離心20 min得到蛋白沉淀，水洗沉淀3 次，然后將蛋白沉淀分散于去離子水中，再用2 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，冷凍干燥得到米糠清蛋白。

1.3.2 羰基含量的測(cè)定

參照Wu Xiaojuan等[9]的方法，采用2,4-二硝基苯肼反應(yīng)測(cè)定米糠清蛋白的羰基含量，以22 000 L/（mol·cm）的摩爾消光系數(shù)計(jì)算羰基含量。同時(shí)以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用考馬斯亮藍(lán)法確定溶液中清蛋白的含量。

1.3.3 游離巰基和二硫鍵含量的測(cè)定

參考Huang Youru等[11]的方法，采用5,5’-二硫代二硝基苯甲酸比色法測(cè)定米糠清蛋白的總巰基和游離巰基含量，總巰基與游離巰基含量之差的1/2即為二硫鍵含量。同樣采用考馬斯亮藍(lán)法確定溶液中清蛋白的含量。

1.3.4 高效液相排阻色譜分析

將米糠清蛋白樣品配制成10 mg/mL的溶液，采用高效液相色譜儀進(jìn)行分析，色譜柱型號(hào)TSKgel SW G4000 SWXL（300 mm×7.8 mm，8 μm），以含有0.05 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.2）作為流動(dòng)相，流速1 mL/min，柱溫25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.3.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參照Wu Xiaojuan等[9]的方法對(duì)米糠清蛋白進(jìn)行還原性的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，樣品緩沖液中含有0.05 g/mLβ-巰基乙醇。采用質(zhì)量濃度分別為12.5 g/100 mL分離膠和4 g/100 mL濃縮膠，每個(gè)泳道上樣10 μL，電流恒定25 mA。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Sun Weizheng等[12]的方法對(duì)米糠清蛋白進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜掃描分析。將2 mg蛋白樣品與200 mg KBr研磨成粉末，混合均勻，用壓片機(jī)壓片，在波數(shù)400～4 000 cm-1、分辨率4 cm-1條件下累計(jì)掃描64 次。

1.3.7 熒光光譜分析

參照Wu Xiaojuan等[9]的方法，先對(duì)米糠清蛋白進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜分析，樣品質(zhì)量濃度0.1 mg/mL，采用熒光光譜儀在激發(fā)波長(zhǎng)295 nm掃描300～500 nm之間的發(fā)射光譜（掃描速率10 nm/s）。然后，測(cè)定米糠清蛋白的表面疏水性，配制5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度（0.005～0.50 mg/mL）的蛋白溶液，取4 mL不同質(zhì)量濃度蛋白溶液，分別加入50 μL 8 mmol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)390 nm、發(fā)射波長(zhǎng)470 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度，以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，米糠清蛋白的表面疏水指數(shù)即曲線初始階段的斜率。

1.3.8 Zeta電位和溶解度測(cè)定

參考Arte等[13]的方法，將米糠蛋白（1∶100，g/mL）溶解于0.01 mol/L pH 7.0磷酸鹽緩沖液中，在室溫下磁力攪拌2 h，然后10 000 r/min離心20 min收集上清液，采用納米粒度分析儀測(cè)定上清液的Zeta電位。通過微量凱氏定氮法測(cè)定米糠清蛋白樣品的總氮含量以及上清液的可溶性氮含量，計(jì)算溶解度。

1.3.9 乳化性和乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參考Molina等[14]的方法，取15 mL米糠清蛋白溶液（1 mg/mL）和5 mL大豆油混合，10 000 r/min均質(zhì)2 min形成乳狀液，取20 μL乳狀液與5 mL 0.1%十二烷基硫酸鈉混合均勻，以0.1%十二烷基硫酸鈉為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度（A0），乳狀液靜置30 min，采用相同方法測(cè)定吸光度（A30）。按式（1）、（2）計(jì)算乳化性和乳化穩(wěn)定性：

式中：C為清蛋白溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度/（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)/%。

1.3.10 起泡能力和起泡穩(wěn)定性測(cè)定

參考Kamara等[15]的方法，將200 mg米糠清蛋白加入20 mL磷酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH 7.0），10 000 r/min均質(zhì)30 s，重復(fù)3 次，測(cè)量均質(zhì)后的液面體積V0，靜置30 min后再次測(cè)量液面體積V1。按式（3）、（4）計(jì)算起泡能力和起泡穩(wěn)定性：

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin 7.5和SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用表示。采用方差分析法進(jìn)行顯著性分析，采用Pearson雙變量進(jìn)行數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白氧化程度的影響

羰基、游離巰基和二硫鍵含量是衡量各種來源蛋白氧化程度的通用指標(biāo)。如表1所示，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白羰基含量逐漸增加，游離巰基含量逐漸減少，二硫鍵含量則先增加后減少。Wu Xiaojuan等[9]關(guān)于米糠酸敗影響米糠蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究發(fā)現(xiàn)，米糠蛋白在酸敗過程中呈現(xiàn)類似的氧化變性趨勢(shì)。該研究還對(duì)米糠貯藏過程中的脂質(zhì)水解酸敗和氧化酸敗程度進(jìn)行詳細(xì)分析，當(dāng)新鮮米糠在溫度25 ℃、相對(duì)濕度85%下貯藏0～10 d，酸值由4.31 mg/g上升到38.72 mg/g，過氧化值由1.42 mmol/kg上升到7.79 mmol/kg，丙二醛含量由6.22 μg/g上升到28.99 μg/g[9]。將米糠清蛋白氧化程度與米糠酸敗程度進(jìn)行相關(guān)性分析（表2），米糠清蛋白羰基含量與米糠酸值和過氧化值呈顯著（P＜0.05）正相關(guān)，與丙二醛含量呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)；游離巰基含量與米糠酸值和過氧化值呈顯著（P＜0.05）負(fù)相關(guān)，與丙二醛含量呈極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)。大量關(guān)于蛋白質(zhì)氧化改性的研究已證實(shí)，脂質(zhì)氫過氧化物、自由基、活性醛等多種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物都可與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)[16-18]。其中，丙二醛是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中最易生成的揮發(fā)性羰基化合物，可與蛋白質(zhì)分子的伯胺基發(fā)生加成反應(yīng)，也可與賴氨酸、組氨酸殘基等親核側(cè)鏈基團(tuán)生成席夫堿，使蛋白質(zhì)羰基含量增加[18]。丙二醛還可與半胱氨酸巰基形成穩(wěn)定的加合物，致使游離巰基含量下降[18]。相比于羰基和游離巰基含量，米糠清蛋白二硫鍵含量與米糠過氧化值和丙二醛含量的相關(guān)性不顯著，這可能是由于巰基氧化是一個(gè)極其復(fù)雜的過程。游離巰基通常先與自由基反應(yīng)生成亞磺酰自由基，再與分子氧結(jié)合形成硫醇自由基，然后繼續(xù)氧化形成二硫鍵，而二硫鍵又可以進(jìn)一步氧化生成亞磺酸、磺酸等，這就導(dǎo)致清蛋白的二硫鍵含量隨著米糠酸敗程度的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)[19]?？偟膩碚f，米糠酸敗過程中清蛋白的氧化修飾主要是由脂質(zhì)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)發(fā)生的，并且次級(jí)氧化產(chǎn)物活性醛類在這一過程中發(fā)揮了重要作用。

表 1 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白氧化程度的影響Table 1 Effects of rice bran rancidity on the oxidation extent of rice bran albumin

表 2 米糠清蛋白氧化程度與米糠酸敗程度的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between oxidation extent of rice bran albumin and rancidity extent of rice bran

2.2 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白氧化聚集和交聯(lián)行為的影響

脂質(zhì)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化過程中通常會(huì)促使蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)，形成可溶性聚集體[16-18]。如圖1A所示，新鮮米糠在波長(zhǎng)280 nm處有2 個(gè)強(qiáng)吸收峰和1 個(gè)弱吸收峰，對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間分別為12.05、11.33 min和5.6 min，前者主要是米糠蛋白及其亞基等小分子物質(zhì)產(chǎn)生的特征吸收峰，后者是少量天然的米糠蛋白聚集體產(chǎn)生的特征吸收峰[9]。由圖1B可知，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白聚集體對(duì)應(yīng)的峰面積百分比逐漸增加（由1.04%增加到3.91%），表明米糠氧化酸敗產(chǎn)物誘導(dǎo)清蛋白發(fā)生了氧化聚集。保留時(shí)間12.05 min的峰面積百分比先減小后增加，11.33 min的峰面積百分比先增加后減少，均在貯藏時(shí)間第5天達(dá)到極值，表明米糠酸敗過程中清蛋白發(fā)生氧化聚集的同時(shí)還伴隨少量氧化分解。這歸因于米糠酸敗產(chǎn)生的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物極其復(fù)雜，不同氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化聚集的作用差異較大。目前相關(guān)研究表明脂質(zhì)氫過氧化物、丙烯醛和丙二醛誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化聚集的能力較強(qiáng)，而過氧自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化聚集的能力較弱，并且高濃度的丙二醛和過氧自由基還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)主肽鏈斷裂，形成較小的多肽片斷[18-19]。

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳是分析蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的主要方法，也是表征蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)的重要手段。如圖1C所示，新鮮米糠制備的清蛋白亞基主要分布在15～20、24、40～50 ku和60 ku，另外在22 ku和37 ku還有極淺的條帶，這應(yīng)該是少量殘余谷蛋白的堿性亞基和酸性亞基[20]。隨著米糠酸敗程度的增加，分離膠頂部顏色逐漸加深，表明米糠氧化酸敗產(chǎn)物誘導(dǎo)清蛋白發(fā)生了氧化交聯(lián)。米糠貯藏第10天時(shí)，24 ku和60 ku附近的條帶也明顯加深，同樣表明清蛋白發(fā)生了一定程度的氧化分解，形成新的多肽片斷。結(jié)合前面巰基氧化的結(jié)果推斷，二硫鍵和非二硫鍵共同參與了米糠酸敗過程中清蛋白的氧化交聯(lián)反應(yīng)，由于巰基氧化形成二硫鍵的過程是可逆反應(yīng)，二硫鍵共價(jià)交聯(lián)的聚集體可能會(huì)部分降解。

圖 1 米糠酸敗誘導(dǎo)米糠清蛋白氧化聚集和交聯(lián)Fig. 1 Oxidative aggregation and cross-linking of rice bran albumin induced by rice bran rancidity

2.3 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 傅里葉變換紅外光譜分析

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成與酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）的振動(dòng)頻率密切相關(guān)。參考Sun Weizheng等[12]方法對(duì)米糠清蛋白的酰胺I帶吸收光譜進(jìn)行Gaussian擬合發(fā)現(xiàn)，新鮮米糠制備的清蛋白具有10 個(gè)特征吸收峰（圖2A）。1 611 cm-1是由氨基酸側(cè)鏈（尤其是酪氨酸殘基等）產(chǎn)生的特征吸收峰[12,21]。1 618 cm-1特征吸收峰由β-折疊平行排列產(chǎn)生，1 630、1 639、1 674～1 694 cm-1特征吸收峰則由β-折疊反平行排列產(chǎn)生[12,22]。1 655 cm-1強(qiáng)吸收峰由α-螺旋結(jié)構(gòu)的C＝O伸縮振動(dòng)產(chǎn)生[23]。1 647 cm-1特征吸收峰是由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)產(chǎn)生[21]。1 666 cm-1特征吸收峰是由β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)產(chǎn)生[12]。隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，氨基酸側(cè)鏈、β-折疊結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的特征吸收峰都發(fā)生了紅移，并且在1 661 cm-1產(chǎn)生新的特征吸收峰，這一特征吸收峰通常被認(rèn)為是隨機(jī)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[23]。

圖 2 不同酸敗程度米糠制備的清蛋白傅里葉變換紅外光譜分析Fig. 2 Fourier transform infrared analysis of rice bran albumin prepared from rice bran with different degrees of rancidity

如圖2B所示，新鮮米糠制備的清蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲和氨基酸側(cè)鏈的占比分別為20.09%、45.13%、18.93%、14.24%和1.62%。隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量逐漸減少，無規(guī)卷曲和氨基酸側(cè)鏈含量增加。當(dāng)貯藏第10天，米糠清蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角相對(duì)含量分別減少到17.49%、38.24%、14.88%，而無規(guī)卷曲和氨基酸側(cè)鏈相對(duì)含量分別增加到27.41%和1.98%。Zhou Feibai等[21]采用亞油酸/脂肪氧合酶構(gòu)建的模擬氧化酸敗體系研究蛋白質(zhì)氧化改性時(shí)發(fā)現(xiàn)，豬肌原纖維蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)類似的β-折疊向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，并認(rèn)為這與蛋白質(zhì)氧化聚集體的形成有關(guān)。此外，α-螺旋/β-折疊可以在一定程度上反映蛋白質(zhì)柔性的變化程度，α-螺旋/β-折疊的數(shù)值越大，蛋白質(zhì)分子的柔性越小[24]。不同酸敗程度米糠制備的清蛋白α-螺旋/β-折疊分別為0.445、0.446、0.448、0.453和0.457，表明米糠酸敗過程中清蛋白的柔韌性逐漸降低，結(jié)構(gòu)變得更加致密，這可能也與蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)和聚集有關(guān)。

2.3.2 熒光光譜分析

圖 3 不同酸敗程度米糠制備的清蛋白熒光光譜分析Fig. 3 Fluorescence spectral analysis of rice bran albumin prepared from rice bran with different degrees of rancidity

如圖3A所示，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著（P＜0.05）下降，這是因?yàn)樯彼釟埢哂休^低的單電子氧化勢(shì)能，極易被自由基等氧化形成犬尿氨酸，產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象[19]。隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的最大熒光峰位藍(lán)移，從359 nm藍(lán)移到357 nm，表明米糠清蛋白中色氨酸殘基微環(huán)境的非極性增強(qiáng)，結(jié)合前面液相色譜和凝膠電泳結(jié)果推斷，這應(yīng)該是帶有色氨酸殘基的部分疏水性側(cè)鏈被脂質(zhì)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)形成了結(jié)構(gòu)致密的聚集體，從而避開外部極性環(huán)境造成的[19]。

如圖3B所示，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的表面疏水性顯著（P＜0.05）下降。這一方面可能是因?yàn)樽杂苫⒒钚匀╊惖戎|(zhì)氧化產(chǎn)物極易與蛋白質(zhì)疏水性側(cè)鏈基團(tuán)反應(yīng)，導(dǎo)致其表面疏水性下降[19]；另一方面可能歸因于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（二硫鍵、二酪氨酸、疏水作用力等）形成的氧化交聯(lián)或聚集體，屏蔽了米糠清蛋白中的疏水位點(diǎn)[9]。

2.4 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白界面性質(zhì)的影響

2.4.1 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白溶解度和Zeta電位的影響

如圖4A所示，在pH 7.0條件下，新鮮米糠制備的清蛋白溶解度為64.0%，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的溶解性逐漸下降，表明米糠氧化酸敗產(chǎn)物還會(huì)誘導(dǎo)米糠清蛋白產(chǎn)生不溶性的氧化聚集體。Wu Wei等[25]關(guān)于蛋白質(zhì)氧化改性的研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中丙烯醛是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化交聯(lián)產(chǎn)生不溶性聚集體的主要化合物。

如圖4B所示，在pH 7.0條件下，米糠清蛋白羧基去質(zhì)子化，使蛋白質(zhì)分子表面帶負(fù)電荷。新鮮米糠制備的清蛋白溶液Zeta電位絕對(duì)值為11 mV，通過負(fù)的靜電斥力使蛋白質(zhì)溶液體系穩(wěn)定。隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，Zeta電位絕對(duì)值顯著（P＜0.05）降低，結(jié)合前面研究結(jié)果推斷，這可能是因?yàn)檠趸宦?lián)形成的可溶性和不溶性聚集體阻礙了蛋白質(zhì)羧基解離，從而使蛋白質(zhì)分子間的靜電斥力減弱。

圖 4 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白溶解度（A）和Zeta電位（B）的影響Fig. 4 Effects of rice bran rancidity on the solubility (A) and zeta potential (B) of rice bran albumin

2.4.2 米糠酸敗對(duì)米糠清蛋白乳化性質(zhì)和起泡性質(zhì)的影響

圖 5 不同酸敗程度米糠制備的清蛋白乳化性質(zhì)和起泡性質(zhì)Fig. 5 Emulsifying properties and foaming properties of rice bran albumin prepared from rice bran with different degrees of rancidity

如圖5A、B所示，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，乳化性由65.20 m2/g下降到50.10 m2/g，乳化穩(wěn)定性由8.77 min下降到5.05 min。目前大量研究已證實(shí)，較高濃度的羥基自由基、過氧自由基等自由基類氧化劑會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的乳化性質(zhì)下降，較高濃度的13-氫過氧化十八碳二烯酸也會(huì)導(dǎo)致谷物蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性下降，并認(rèn)為是由于氧化聚集行為使蛋白質(zhì)的溶解性、持水性、持油性下降所致[12,19,26]?？梢姡卓匪釘∵^程中清蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性的下降是脂質(zhì)氫過氧化物、自由基等氧化劑協(xié)同作用的結(jié)果。

米糠蛋白的起泡性取決于蛋白質(zhì)分子在氣-液界面通過構(gòu)象變化和分子間作用力快速形成黏彈性蛋白膜的能力，起泡穩(wěn)定性則取決于已形成的穩(wěn)定蛋白膜抵抗重力和機(jī)械應(yīng)力的能力[5]。如圖5C、D所示，隨著米糠貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，米糠清蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，起泡能力由55.84%下降到39.90%，起泡穩(wěn)定性由67.80%下降到53.50%。尤翔宇等[19]研究發(fā)現(xiàn)較高濃度（＞3 mmol/L）的過氧自由基會(huì)導(dǎo)致米糠蛋白起泡性和起泡穩(wěn)定性下降，并認(rèn)為是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成的不溶性聚集體阻礙了蛋白質(zhì)分子在氣-液界面形成黏彈性好的連續(xù)蛋白膜。

2.4.3 米糠清蛋白氧化程度、結(jié)構(gòu)特征、界面性質(zhì)之間的相關(guān)性分析

表 3 不同酸敗程度米糠制備的清蛋白氧化程度、結(jié)構(gòu)特征與界面性質(zhì)之間的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between oxidation markers, structural characteristics and interfacial properties of rice bran albumin prepared from rice bran with different degrees of rancidity

通過對(duì)米糠清蛋白氧化程度、結(jié)構(gòu)特征和界面性質(zhì)之間進(jìn)行相關(guān)性分析，進(jìn)一步探索米糠酸敗誘導(dǎo)的氧化修飾對(duì)米糠清蛋白界面性質(zhì)的影響。如表3所示，米糠清蛋白的乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力和起泡穩(wěn)定性與其羰基含量、α-螺旋/β-折疊呈極顯著（P＜0.01）負(fù)相關(guān)，與游離巰基含量、表面疏水性、Zeta電位絕對(duì)值、溶解度呈極顯著（P＜0.01）正相關(guān)。α-螺旋/β-折疊反映了蛋白質(zhì)分子的柔性程度，而柔性對(duì)蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)具有顯著影響。王健等[27]關(guān)于大豆蛋白的改性研究發(fā)現(xiàn)，大豆分離蛋白的柔性與乳化性和乳化穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)，Li Rui等[28]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)柔性不僅與乳化性質(zhì)呈顯著正相關(guān)，還與起泡能力和起泡穩(wěn)定性呈顯著正相關(guān)。較好的柔性有利于蛋白質(zhì)在油-水界面或氣-液界面的初始吸附和結(jié)構(gòu)重排[27]。蛋白質(zhì)界面性質(zhì)與其表面疏水性和溶解性的相關(guān)性也被多項(xiàng)研究證實(shí)，這是因?yàn)楸砻媸杷鶊F(tuán)的暴露和溶解度的增加同樣可以促進(jìn)蛋白質(zhì)在油-水界面或氣-液界面吸附[29-30]。Zeta電位是維持蛋白質(zhì)膠體分散體系穩(wěn)定性的主要因素。Hu Zhenying等[31]研究發(fā)現(xiàn)Zeta電位絕對(duì)值的降低會(huì)導(dǎo)致溶液穩(wěn)定性下降，促進(jìn)液滴凝聚，降低蛋白質(zhì)的乳化活性?？梢?，米糠酸敗過程中米糠清蛋白的氧化交聯(lián)或聚集降低了蛋白質(zhì)分子的柔性和表面疏水性，并導(dǎo)致蛋白溶液Zeta電位下降，在這些變化的共同影響下，米糠清蛋白的界面性質(zhì)持續(xù)下降。

3 結(jié) 論

米糠酸敗會(huì)誘導(dǎo)米糠清蛋白發(fā)生羰基化和巰基氧化反應(yīng)。通過對(duì)米糠清蛋白氧化程度和米糠酸敗程度之間進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，米糠清蛋白的氧化修飾主要是由脂質(zhì)氧化產(chǎn)物誘導(dǎo)發(fā)生的，并且次級(jí)氧化產(chǎn)物活性醛類在這一過程中發(fā)揮了重要作用。米糠酸敗過程中，米糠清蛋白會(huì)通過二硫鍵和非二硫共價(jià)鍵交聯(lián)形成可溶性的氧化聚集體，在氧化交聯(lián)的同時(shí)還伴隨少量氧化分解。米糠酸敗誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化會(huì)促使米糠清蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生復(fù)雜變化，主要表現(xiàn)為二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量減少，無規(guī)卷曲和氨基酸側(cè)鏈含量增加，同時(shí)維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的疏水作用力減弱。米糠清蛋白的結(jié)構(gòu)變化會(huì)極大地影響其界面性質(zhì)。隨著米糠酸敗程度增加，米糠清蛋白溶液的Zeta電位和蛋白質(zhì)溶解度下降，乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力和起泡穩(wěn)定性等界面性質(zhì)也隨之下降?？偟膩碚f，米糠氧化酸敗產(chǎn)物誘導(dǎo)米糠清蛋白通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（二硫鍵、非二硫共價(jià)鍵、疏水作用力等）形成可溶性和不可溶的聚集體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子柔性和表面疏水性下降，分子間靜電斥力減弱，進(jìn)而對(duì)米糠清蛋白的界面性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響。