蒙藥藍(lán)刺頭對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠瘦素、β2腎上腺素受體的影響?

趙 軍，師建平，董重陽，劉 巖，常 虹，劉 晉

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的一種，隨著女性絕經(jīng)后雌激素水平的降低，骨形成與骨吸收代謝失衡，導(dǎo)致骨量減少，骨微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，嚴(yán)重者發(fā)展為脆性骨折。其發(fā)病機(jī)制是成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞維持的骨代謝失衡。其中成骨細(xì)胞起著重要作用，而目前應(yīng)用的抗骨質(zhì)疏松藥物（降鈣素、二磷酸鹽、雌激素等）多為抑制破骨細(xì)胞活性的藥物，缺乏刺激成骨細(xì)胞活性或既刺激成骨細(xì)胞又抑制破骨細(xì)胞的藥物。因此，深入研究具有以上優(yōu)勢的植物化合物防治骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制，對(duì)提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義［1］。

骨質(zhì)疏松屬蒙醫(yī)中“骨枯癥”范疇。蒙醫(yī)經(jīng)典醫(yī)籍《觀者之喜》中有“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補(bǔ)為主，補(bǔ)暖補(bǔ)精，而抑赫依過剩……”的論述。老年人屬“體熱趨于減弱，顯示赫依優(yōu)勢”的體質(zhì)［2］，此時(shí)人體內(nèi)“赫依”體素過剩，使體內(nèi)“三根、七素”平衡失調(diào)，隨著七素三根分解與吸收以及排泄功能的紊亂，精華與糟粕的分解不充分，骨之精華減少，從而發(fā)生骨枯癥［3］，使骨脆性增加而易于骨折。蒙藥藍(lán)刺頭味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解毒，殺“黏”止痛等功效，主治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創(chuàng)、瘡瘍等癥［4］。有研究顯示［5］：蒙藥藍(lán)刺頭具有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用及促進(jìn)骨形成對(duì)骨吸收、骨形成偶聯(lián)有一定調(diào)節(jié)作用，能降低骨轉(zhuǎn)換率，以此達(dá)到防治PMOP 的目的。藍(lán)刺頭可通過降低卵巢切除使雌激素水平急劇下降所致的骨高轉(zhuǎn)換率，抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨吸收-骨形成偶聯(lián)，防止骨量快速丟失，從而延緩絕經(jīng)后骨量丟失的發(fā)生發(fā)展，以此起到防治PMOP 的作用［6］。為豐富藍(lán)刺頭基于”補(bǔ)腎壯骨”（經(jīng)典雌激素通路）抗骨質(zhì)疏松機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容，本研究進(jìn)一步探討蒙藥藍(lán)刺頭對(duì)去卵巢大鼠瘦素（leptin，LEP）、股骨β2腎上腺素能受體（β2-adrenergic receptor，ADRβ2R）的調(diào)節(jié)作用，為基于蒙醫(yī)“腎主骨，治以補(bǔ)暖補(bǔ)精”理論防治骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑蒙藥藍(lán)刺頭制劑（廣州中醫(yī)藥大學(xué)技術(shù)產(chǎn)業(yè)園有限公司）；強(qiáng)骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號(hào)：20181103，規(guī)格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)：20181004，規(guī)格：0.5 mg/片）；水合氯醛（上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號(hào)：H32022265，規(guī)格：100 g/瓶）；LEP Elisa 試劑盒、兔抗大鼠ADRβ-2R 抗體、DAB 顯色試劑盒、PBS 緩沖液均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 動(dòng)物與飼養(yǎng)環(huán)境4 月齡雌性Wistar 大鼠70 只，平均體質(zhì)量（250±20.00）g，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蒙）2002-0001。實(shí)驗(yàn)室：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)樓病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。大鼠為清潔級(jí)，飼養(yǎng)條件一致，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，室溫（25±3）℃，空氣濕度55%～65%，自然光照、通風(fēng)良好、自由進(jìn)食水，養(yǎng)于專用鼠籠內(nèi)，每籠10 只，購回適應(yīng)性飼養(yǎng)7天左右。

1.3 動(dòng)物分組與模型復(fù)制將Wistar大鼠70只隨機(jī)分為藍(lán)刺頭高、中、低劑量組及強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、模型組、假手術(shù)組。PMOP 模型的復(fù)制參考文獻(xiàn)［7］進(jìn)行，假手術(shù)組不切卵巢只切除卵巢周圍少量脂肪，造?？p合創(chuàng)口后5 天將大鼠陰道脫落細(xì)胞進(jìn)行涂片并觀察［1］。方法為將蘸有PBS 緩沖液的消毒棉簽輕輕插入大鼠陰道，慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)后移出，然后將蘸有陰道脫落細(xì)胞的棉簽沿同一方向滾動(dòng)，均勻涂抹于干凈的載玻片上，迅速滴加36%甲醛溶液1滴覆蓋載玻片涂片處，固定15 min，然后浸沒于20%甲基藍(lán)染液中染色45 min，蒸餾水沖洗透明，水溶性封片劑封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的著色情況及形態(tài)。結(jié)果為假手術(shù)組大鼠陰道涂片充滿有核細(xì)胞、白細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞，而模型組中很少見上述細(xì)胞，表明造模成功，見圖1—2。

圖1 假手術(shù)組（甲基藍(lán)染色，×400）

圖2 模型組（甲基藍(lán)染色，×400）

1.4 藥物干預(yù)及標(biāo)本采集正常飼養(yǎng)90 天后灌胃給藥。藍(lán)刺頭高、中、低劑量組依據(jù)人鼠體質(zhì)量比例及人鼠代謝速率比折算后分別以27.5000、13.7500、6.8750 mg/mL 的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量。強(qiáng)骨膠囊23.4375 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL，均按成人劑量的有效量給藥；模型組和假手術(shù)組灌胃相應(yīng)體積的0.9%氯化鈉溶液。同時(shí)將各組大鼠給藥濃度換算為按大鼠體質(zhì)量每克每天灌胃0.02 mL。處死前1 天停止給食，腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，心內(nèi)采血約6～10 mL于離心管內(nèi)，以3 000 r/min離心5 min后分離血清，檢測血清LEP；處死大鼠剖取雙側(cè)完整股骨，分離附著的肌肉組織，保留完整骨膜，標(biāo)記股骨，測定右側(cè)股骨離體骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁體積/組織體積（bone trabecula volume/tissue volume，BV/TV）；用4%甲醛溶液浸泡左側(cè)股骨、大鼠子宮，室溫保存10天，檢測骨ADRβ2R表達(dá)及子宮重量/體質(zhì)量（uterus weight/body weight，UW/BW）。

1.5 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)測定采用顯微CT 分析大鼠右側(cè)股骨BMD、BV/TV及子宮UW/BW。

1.6 血清LEP 表達(dá)水平測定運(yùn)用酶聯(lián)儀檢測各孔吸光度（OD）值，實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 股骨頭ADRβ2R表達(dá)測定采用免疫化學(xué)組織法檢測左側(cè)股骨頭ADRβ2R表達(dá)。

1.7.1 大鼠左側(cè)股骨脫鈣方法將大鼠左側(cè)股骨于4%甲醛固定液中固定10天后，用EDTA脫鈣液連續(xù)脫鈣20天，以能將針頭刺入骨皮質(zhì)為宜；然后采用免疫組織化學(xué)法檢測股骨頭中ADRβ2R的表達(dá)。

1.7.2 蠟塊的制備及免疫組化染色常規(guī)包埋、染色（由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心協(xié)助完成）。每組大鼠取5 張切片，每張切片隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組染色情況，采用醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)測定鏡下細(xì)胞光密度值。ADRβ2R以細(xì)胞質(zhì)、膜染成淡黃色或棕黃色為陽性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)變化顯微CT 掃描大鼠右側(cè)股骨近心端，結(jié)果顯示：1）與假手術(shù)組比較，模型組BMD、BV/TV及UW/BW降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；藍(lán)刺頭高、低劑量組BMD、BV/TV 降低明顯（P＜0.05），而UW/BW 升高明顯（P＜0.05）；2）與模型組比較，藍(lán)刺頭中劑量組及己烯雌酚組BMD、BV/TV 及UW/BW 升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而藍(lán)刺頭高、低劑量組升高不顯著（P＞0.05）；3）藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間BMD、BV/TV 比較差異不明顯（P＞0.05），UW/BW比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠組織形態(tài)計(jì)量學(xué)比較（±s）

表1 各組大鼠組織形態(tài)計(jì)量學(xué)比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 血清LEP 水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LEP升高顯著（P＜0.01），藍(lán)刺頭高、低劑量組升高（P＜0.05）；與模型組比較，藍(lán)刺頭中劑量組LEP 降低明顯（P＜0.01），己烯雌酚組LEP 降低（P＜0.05），藍(lán)刺頭高、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間LEP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清LEP含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清LEP含量比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R表達(dá)與假手術(shù)組比較，模型組ADRβ2R表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，藍(lán)刺頭中劑量組ADRβ2R降低明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），藍(lán)刺頭高、低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與藍(lán)刺頭高、低劑量組比較，藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組ADRβ2R 降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組比較，ADRβ2R 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R光密度值比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

圖3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R表達(dá)情況（免疫組化染色，×400）

3 討論

交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨量調(diào)控具有重要作用。交感神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布于外周組織器官，骨小梁和成骨細(xì)胞附近有交感神經(jīng)纖維，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上都具有ADRβ2R［8］。骨組織能通過神經(jīng)骨骼信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨骼系統(tǒng)微循環(huán)營養(yǎng)環(huán)境，通過交感神經(jīng)末梢直接釋放神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)骨代謝。近年研究發(fā)現(xiàn)LEP 對(duì)骨代謝有至關(guān)重要的調(diào)控作用。LEP 介導(dǎo)的交感神經(jīng)活動(dòng)能抑制骨組織形成［9］，LEP 可透過大腦血腦屏障作用于下丘腦神經(jīng)細(xì)胞，刺激興奮外周交感神經(jīng)系統(tǒng)，成骨細(xì)胞表面的ADRβ2R 介導(dǎo)其發(fā)揮作用，ADRβ2R 被激活后可促進(jìn)LEP 和白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）等破骨因子的表達(dá)［10］，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和分化，導(dǎo)致骨量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，從而抑制骨形成［11-12］。成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞上均存在ADRβ2R，β2受體激動(dòng)劑可刺激骨髓破骨細(xì)胞生成而增強(qiáng)人和大鼠成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性［13］，導(dǎo)致骨量下降；相反，抑制該受體會(huì)促進(jìn)骨形成，增加骨量。ADRβ2R 拮抗劑能刺激成骨細(xì)胞上ADRβ2R，能下調(diào)成骨細(xì)胞分化，降低核心結(jié)合因子α1 的表達(dá)［14］；外周交感神經(jīng)系統(tǒng)通過骨組織表面ADRβ2R抑制骨形成。

LEP 是一種能引起攝食減少、體內(nèi)能耗增加的抗肥胖因子，近來研究表明它同樣參與了骨形成的調(diào)節(jié)［15］。LEP 在中樞抑制骨形成。LEP 抑制骨形成的中樞神經(jīng)通路與硫葡萄糖敏感的神經(jīng)元有關(guān)，與LEP 抑制食欲效應(yīng)的促黑色素和促阿黑皮素原途徑無關(guān)，交感神經(jīng)系統(tǒng)參與了該途徑［16］。LEP在外周促進(jìn)骨形成。骨細(xì)胞有LEP受體表達(dá)，LEP 可直接作用于成骨細(xì)胞，促進(jìn)其分化和成熟。LEP是骨重建的重要調(diào)節(jié)劑。

本研究中與模型組比較，己烯雌酚組治療效果顯著，大鼠BMD、BV/TV、UW/BW均增加（P＜0.01）；藍(lán)刺頭高、低劑量組增加不顯著（P＜0.01）；藍(lán)刺頭中劑量組治療效果與強(qiáng)骨膠囊組相似。說明在骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)變化方面，藍(lán)刺頭防治模型大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有效，中劑量組表現(xiàn)明顯。模型組血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），說明大鼠在人為去卵巢術(shù)后體內(nèi)LEP 含量增高，股骨ADRβ2R 表達(dá)上升，骨破壞作用增強(qiáng)。藍(lán)刺頭低、高劑量組與模型組相比，血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達(dá)均未見明顯差異（P＞0.05），說明在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)刺頭可抑制去卵巢大鼠血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達(dá)，從而起到一定的骨保護(hù)作用。

“腎主骨生髓”是中醫(yī)腎臟生理功能的一個(gè)重要組成部分，同時(shí)也是蒙醫(yī)“骨枯癥”的重要內(nèi)容。蒙醫(yī)認(rèn)為人年幼時(shí)發(fā)病以巴達(dá)干為主，青壯年以稀日為主，老年以赫依為主。骨是蒙醫(yī)“三元”氣（赫）所存之區(qū)，所以骨骼的生長和功能取決于腎氣的盛衰。老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補(bǔ)為主，補(bǔ)暖補(bǔ)精。因此，無論中醫(yī)還是蒙醫(yī)，“補(bǔ)腎壯骨”治法均應(yīng)貫穿始終，而蒙藥藍(lán)刺頭是蒙醫(yī)補(bǔ)腎常用藥。本研究中大鼠去卵巢后血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達(dá)均明顯增高，而蒙藥藍(lán)刺頭能降低LEP 和股骨頭ADRβ2R，效果與己烯雌酚、強(qiáng)骨膠囊相當(dāng)，能顯著提高去卵巢大鼠骨密度及骨形態(tài)學(xué)指標(biāo)，起到骨保護(hù)作用。這種效應(yīng)可能通過蒙藥藍(lán)刺頭下調(diào)LEP 和ADRβ2R 表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞生成和分化，進(jìn)一步促進(jìn)骨形成，增加骨量有關(guān)。這為蒙藥藍(lán)刺頭依據(jù)“腎主骨，治以補(bǔ)暖補(bǔ)精”理論防治PMOP 提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但詳細(xì)機(jī)制和作用通道還需進(jìn)一步研究。