食品中己烯雌酚的檢測(cè)方法

王 瑤，周建華，張鴻雁，邴 欣

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250103）

食品中己烯雌酚的檢測(cè)方法

王 瑤1，周建華1，張鴻雁1，邴 欣2，*

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南250014；2.山東省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，山東濟(jì)南250103）

己烯雌酚是人工合成的雌激素，主要添加在飼料中，能引起人體內(nèi)激素失調(diào)等疾病。綜述了己烯雌酚的理化性質(zhì)、存在的危害、測(cè)定方法等，重點(diǎn)介紹了己烯雌酚的定性和定量測(cè)定方法，為我國(guó)食品檢測(cè)方法的研究提供借鑒的依據(jù)。

己烯雌酚，雌激素，食品，測(cè)定方法

己烯雌酚（Diethylstilbestrol）是一種人工合成的雌性激素類(lèi)藥物，常當(dāng)做性激素調(diào)節(jié)動(dòng)物的生理功能，還被用作動(dòng)物飼料添加劑，以促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。國(guó)內(nèi)外研究表明，己烯雌酚可以破壞機(jī)體的遺傳物質(zhì)，導(dǎo)致基因突變，引發(fā)腫瘤。由于己烯雌酚的濫用，對(duì)動(dòng)物性食品中己烯雌酚的殘留檢測(cè)引起了國(guó)內(nèi)外的高度重視。目前己烯雌酚的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、酶聯(lián)免疫分析法、電化學(xué)法和熒光測(cè)定法等。

1 己烯雌酚的理化性質(zhì)

己烯雌酚別名丙酸己烯雌酚、女性素、人造求偶素等，分子式C18H20O2，相對(duì)分子質(zhì)量268.35，化學(xué)名稱(chēng)（E）-4，4’-（1，2-二乙基-1，2-亞乙烯基）雙苯酚。己烯雌酚是一種無(wú)色結(jié)晶或白色結(jié)晶性粉末，幾乎無(wú)臭、無(wú)味。有兩種幾何異構(gòu)體，其中反式作用較強(qiáng)，用于醫(yī)藥。熔點(diǎn)169～172℃，紫外最大吸收波長(zhǎng)為242nm。幾乎不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、脂肪油、稀氫氧化鈉溶液。Coats[1]通過(guò)模型生態(tài)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，己烯雌酚在環(huán)境中降解很慢，能夠在生物體中積累，造成對(duì)環(huán)境的污染和對(duì)生物體的危害。己烯雌酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 己烯雌酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of diethylstilbestrol

2 己烯雌酚的存在及危害

己烯雌酚是人工合成的非甾體雌激素，屬于雌激素及孕激素類(lèi)藥物。它在促進(jìn)動(dòng)物蛋白質(zhì)的合成代謝、提高動(dòng)物日增重和減少脂肪等方面效果明顯[2]，另外具有增加瘦肉率、治療胎衣不下、排出死胎以及提高飼料轉(zhuǎn)化率等功能而廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)[3]。將其添加到飼料里可以提高產(chǎn)崽率或催情作用，同時(shí)通過(guò)飼喂會(huì)使己烯雌酚殘留在動(dòng)物的內(nèi)臟以及肌肉組織中[4]。它存在于動(dòng)物源性食品中，如果在肝臟、雞肉、蛋、奶中殘留，被人食用后能夠損傷肝臟，引起少兒的發(fā)育早熟、男性女性化、破壞機(jī)體遺傳物質(zhì)、導(dǎo)致基因突變[5]以及人體內(nèi)激素失調(diào)，女性乳腺癌、卵巢癌等疾病[6]。

目前世界上許多國(guó)家已經(jīng)規(guī)定己烯雌酚在家畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中禁用。我國(guó)于1999、2002年先后兩次制定法規(guī)禁止DES及其鹽、酯制劑用于所有食品動(dòng)物的所有用途[7-9]。然而，由于巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，濫用己烯雌酚的現(xiàn)象依然存在。因此加強(qiáng)對(duì)飼料產(chǎn)品中己烯雌酚的監(jiān)測(cè)可以保障食品安全工作的順利開(kāi)展，從而保護(hù)人的健康與安全。

3 己烯雌酚的測(cè)定方法

3.1 高效液相色譜法

近幾年，高效液相色譜法大量用于食品和飼料中己烯雌酚的測(cè)定，該法已經(jīng)成功地應(yīng)用于肉制品、奶粉、海產(chǎn)品和飼料中己烯雌酚含量的測(cè)定，使用較廣泛的是甲醇和磷酸二氫鈉溶液為流動(dòng)相，采用熒光或紫外檢測(cè)器檢測(cè)，該法有較好的精密度和準(zhǔn)確度。

萬(wàn)美梅等[10]建立了動(dòng)物組織中己烯雌酚的高效液相色譜檢測(cè)方法，流動(dòng)相為乙腈和磷酸二氫銨，己烯雌酚濃度在0.2～100ng/g范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9995。各組織不同添加濃度的平均回收率均為80%，批內(nèi)變異系數(shù)小于3.60%，批間變異系數(shù)小于3.72%，檢測(cè)限為0.2ng/g。張彩虹[11]用甲醇二次提取畜禽肉及內(nèi)臟中己烯雌酚，按常規(guī)取樣5g時(shí)最小檢出濃度0.24mg/kg，加標(biāo)回收率分別為98.7%～104.3%和99.6%～101.7%，精密度小于5%，相關(guān)系數(shù)為0.9996。劉虹等[12]建立測(cè)定奶粉中己烯雌酚的高效液相色譜法，測(cè)定己烯雌酚的線性范圍0.5～200g/mL，相關(guān)系數(shù)為0.9995，平均回收率92.2%，檢出限為0.06μg。林紅英等[13]建立了鰻魚(yú)肉中己烯雌酚的高效液相色譜檢測(cè)方法，平均回收率可達(dá)84%以上，相對(duì)偏差小于15%，最低檢測(cè)限為10μg/kg。

Xu等[14]通過(guò)高靈敏的高效液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)水產(chǎn)品中己烯雌酚的含量。通過(guò)在濃硫酸中的磺化反應(yīng)和水解作用，把己烯雌酚轉(zhuǎn)變成能夠發(fā)射出熒光的物質(zhì)，并用高效液相色譜的方法進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)下限是0.1μg/kg，回收率超過(guò)86%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于6.2%。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用常被用于己烯雌酚含量的確證，分析過(guò)程包括提取、樣品預(yù)處理和帶有四級(jí)離子捕獲質(zhì)譜分析器的電噴霧質(zhì)譜定性的反相高效液相分離過(guò)程。色譜條件：流動(dòng)相為乙腈-水，流速0.2mL/min，進(jìn)樣體積10μL，柱溫35℃。在0.1～500μg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性，相關(guān)系數(shù)為0.999。在1、5、20mg/kg 3個(gè)添加水平，平均回收率75.2%～97.6%，日內(nèi)變異系數(shù)為2.1%～6.3%，日間變異系數(shù)為3.2%～9.7%，檢測(cè)限為10μg/kg[16]。常碧影等[17]建立了液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定飼料中己烯雌酚的分析方法，最低檢出限0.5ng，回收率平均92.86%，平均變異系數(shù)5.64%，適合多種動(dòng)物各種飼料品種中己烯雌酚的測(cè)定。

3.2 氣相色譜

只要己烯雌酚在分離柱溫度范圍內(nèi)可揮發(fā)或可轉(zhuǎn)化為可揮發(fā)物質(zhì)，氣相色譜就可用于測(cè)定己烯雌酚。宮向紅等[15]建立了水產(chǎn)品中己烯雌酚的氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法，當(dāng)添加水平在0.5～1.0μg/kg時(shí)，回收率大于75%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.7%，相關(guān)系數(shù)為0.999。

3.3 酶聯(lián)免疫分析法

以上介紹的檢測(cè)己烯雌酚的各種方法往往需要復(fù)雜昂貴的儀器，而且需要經(jīng)過(guò)繁瑣的前處理，很難達(dá)到快速、簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求。酶聯(lián)免疫分析方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便和快速等優(yōu)點(diǎn)。這些豐富的分析研究成果對(duì)于監(jiān)測(cè)和安全使用己烯雌酚起到了十分重要的作用。

Wang等[18]用試劑盒進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)測(cè)定己烯雌酚的殘留。Wang等[19]運(yùn)用多克隆抗體進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫方法測(cè)定己烯雌酚，己烯雌酚的檢測(cè)下限是0.01ng/mL，IC50值為1.02ng/mL，回收率為86%～120.2%。Wang等[20]又用單克隆抗體通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)測(cè)定己烯雌酚，IC50值為9.8ng/mL，檢測(cè)下限是2.3ng/mL，檢測(cè)的線性范圍是2～42ng/mL。Xu等[21]運(yùn)用競(jìng)爭(zhēng)的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)對(duì)己烯雌酚進(jìn)行了定量測(cè)定，對(duì)雞肉和肝臟組織進(jìn)行了檢測(cè)，IC50值為2.4ng/mL，檢測(cè)下限是0.07ng/mL。Goldstein P等[22]為了定量檢測(cè)組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞中的己烯雌酚的濃度，將KLH和半抗原偶聯(lián)制備抗己烯雌酚抗體，應(yīng)用改良的酶聯(lián)免疫方法對(duì)己烯雌酚進(jìn)行研究。

胡鯤等[23]用國(guó)外進(jìn)口試劑盒測(cè)定中華鱉肌肉中己烯雌酚殘留量，檢測(cè)下限是0.0125μg/kg，平均回收率為74.8%，變異系數(shù)為1.763%～3.084%。王文[24]等建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析方法，該方法的最低檢測(cè)限為0.04ng/mL。廖敏等[6]通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)和對(duì)蝦樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，試劑盒在加標(biāo)濃度為1.00μg/kg和2.00μg/kg時(shí)，對(duì)蝦和羅非魚(yú)樣品的加標(biāo)回收率為78.80%～93.30%。邴愛(ài)英[25]等用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，該方法的檢測(cè)靈敏度為0.125ng/mL，可定量檢測(cè)范圍是0.25～15.60ng/mL。Degand[26]用酶聯(lián)免疫法測(cè)定牛尿液中己烯雌酚含量，最低檢測(cè)限是0.09ng/mL，完全滿(mǎn)足歐盟對(duì)己烯雌酚允許的最大殘留量為2μg/kg的要求。

3.4 電化學(xué)法

己烯雌酚分子中的酚羥基具有電化學(xué)活性，在多壁碳納米管修飾玻碳電極上出現(xiàn)靈敏的氧化峰。而在同樣的條件下，己烯雌酚在裸玻碳電極上的電化學(xué)活性卻低得多，因此可用電化學(xué)方法測(cè)定己烯雌酚。

王術(shù)皓等[27]建立了一種測(cè)定己烯雌酚的電化學(xué)酶免疫分析新方法，此方法測(cè)定的己烯雌酚線性范圍是1.0～500ng/mL，檢出限為0.4ng/mL。孫延一等[28]制作了碳納米管修飾電極，并研究己烯雌酚在該電極上的電化學(xué)行為。峰電流與己烯雌酚濃度在1×10-8～2×10-6mol/L有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限為2.5×10-9mol/L。1×10-6mol/L己烯雌酚溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%。吳翠敏[29]在玻碳電極上，在pH=9.0的磷酸鹽緩沖溶液中，己烯雌酚對(duì)Luminol（發(fā)光試劑）的電化學(xué)發(fā)光有一定的抑制作用，己烯雌酚濃度在1.5×10-6～2.5× 10-5mol/L范圍內(nèi)與發(fā)光減少值分段呈良好的線性關(guān)系，檢出限為5.0×10-7mol/L。對(duì)5.0×10-5mol/L己烯雌酚平行測(cè)定10次，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.28%。

3.5 熒光測(cè)定法

基于己烯雌酚與濃硫酸反應(yīng)后的水解產(chǎn)物的熒光性質(zhì)，可建立一種測(cè)量己烯雌酚的熒光光度分析方法。潘祖婷等[30]研究了不同環(huán)境介質(zhì)對(duì)產(chǎn)物熒光性質(zhì)的影響，在0～4.5×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與濃度之間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996，檢測(cè)限為2.0×10-8mol/L。

4 結(jié)論

由于己烯雌酚的濫用，國(guó)內(nèi)外開(kāi)始高度重視食品中己烯雌酚的檢測(cè)。己烯雌酚在動(dòng)物體內(nèi)代謝快，在組織中濃度低，因此其檢測(cè)方法應(yīng)準(zhǔn)確、靈敏、特異和精確[10]。己烯雌酚的定性以及定量測(cè)定方法的研究涉及樣品處理方法、檢測(cè)器靈敏度、雜質(zhì)干擾等諸多因素的影響。根據(jù)實(shí)際需要，可選用適宜的測(cè)定方法。目前我國(guó)應(yīng)盡快制定己烯雌酚的含量測(cè)定的國(guó)標(biāo)方法，為我國(guó)食品安全等行業(yè)的發(fā)展提供借鑒的依據(jù)。

[1]Coats JR，Metcalf RL，Lu PY，et al.Model ecosystem valuation oftheenvironm ental impacts of the veterin ary drug phenothiazine，sulfamethazine，clopidol and diethylstilbestrol[J].Environ Health Perspect，1976（18）：167-179.

[2]Lone KP.Natural sex steroids and their xenobiotic analogs in animal production：growth，carcass quality，pharmaco kinetics，metabolism，mode of action，residues，methods and epidemiology [J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1997，37（2）：193-209.

[3]倫麗麗，董英，王云，等.己烯雌酚完全抗原及其單抗的制備與分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（10）：67-69.

[4]賈濤.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)飼料中己烯雌酚的探討[J].飼料廣角，2010（5）：38-40，43.

[5]李凱年，姜荃.國(guó)外對(duì)食品藥物殘留控制的發(fā)展趨勢(shì)[J].世界農(nóng)業(yè)，2003（5）：44-46.

[6]廖敏，錢(qián)莉.酶聯(lián)免疫法：水產(chǎn)品中己烯雌酚檢測(cè)新招[J].農(nóng)業(yè)技術(shù)與裝備，2009（10）：28-29.

[7]動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，1999.

[8]動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量[S].中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部，2002.

[9]Becker J.Artificial hormones European register[J].Nature，1981，289：215.

[10]萬(wàn)美梅，陳杖榴，劉雅紅，等.動(dòng)物組織中己烯雌酚殘留的高效液相色譜/電化學(xué)檢測(cè)方法研究[J].中國(guó)獸藥雜志，2004，38（7）：4-6.

[11]張彩虹.高效液相色譜法測(cè)定己烯雌酚的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2006，6（2）：328-329.

[12]劉虹，謝承恩.高效液相色譜法測(cè)定奶粉中己烯雌酚[J].檢測(cè)技術(shù)，2006，12（6）：374-375.

[13]林紅英，蔣天梅，沈子龍.鰻魚(yú)肉中己烯雌酚殘留量的高效液相色譜法測(cè)定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22（4）：456-459.

[14]Xu YJ，Geng JP，Zhang XZ，et al.Determination of diethylstilbestrol in aquatic products by high performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].Chinese Journal of Chemistry，2010，28（1）：86-90.

[15]宮向紅，徐英江，張秀珍，等.氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中的己烯雌酚[J].食品科學(xué)，2009，30（2）：168-169.

[16]閆小峰，孫志文.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中的己烯雌酚[J].檢測(cè)分析，2010（11）：38-40.

[17]常碧影，張萍，袁漢成，等.LC-MC測(cè)定飼料中己烯雌酚方法的研究[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器，2003（1）：38-41.

[18]Wang W，Li J，Xu T.Detection kit for enzyme linked immunosorbentassay applied for diethylstilbestrolresidue analysis[P].China.CN1967247-A，2007-05-23.

[19]Wang WJ，Ling Y，Xu T，et al.Development of an indirect competitive ELISA based on polyclonal antibody for the detection of diethylstilbestrol in water samples[J].Chinese Journal of Chemistry，2007，25（8）：1145-1150.

[20]Wang WJ，Li J，Zhao JX，et al.Development of monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay to the estrogen diethylstilbestrol[J].Chinese Journal of Chemistry，2006，24（12）：1758-1765.

[21]Xu CL，Chu XG，Peng CF，et al.Comparison of enzymelinked immunosorbent assay with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of diethylstilbesterol residues in chicken and liver tissues[J].Biomedical Chromatography，2006，20（10）：1056.

[22]Goldstein P.Biologicalresponse and quantitation of diethylstilbestrol via enzyme-linked-immunosorbent-assay[J]. Acs Symposium Series，1991，451：280-292.

[23]胡鯤，楊先樂(lè)，張菊.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)中華鱉肌肉中己烯雌酚[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，11（3）：199-202.

[24]王文，李季，張國(guó)中，等.己烯雌酚多克隆抗體的制備研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（增刊）：245-250.

[25]邴愛(ài)英，成連貴，褚新星，等.己烯雌酚酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，19（6）：1159-1161.

[26]Degand G，Schmitz P，Maghuin-Rogister G.Enzyme immunoassay screening procedure for the synthetic anabolic estrogens and androgens diethylstilbestrol nortestosterone，methyltestosterone and trenbolonein bovine urine[J].J Chromatogr，1989（489）：235-243.

[27]王術(shù)皓，莊惠生，王傳濤，等.電化學(xué)免疫分析方法測(cè)定飼料中的己烯雌酚[J].持久性有機(jī)污染物論壇，2006：347-350.

[28]孫延一，吳康兵，胡勝水.己烯雌酚在多壁碳納米管修飾電極上的電化學(xué)行為及其電化學(xué)測(cè)定[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38（5）：364-367.

[29]吳翠敏.己烯雌酚在玻碳電極上的電化學(xué)發(fā)光法研究[J].海峽藥學(xué)，2005，17（2）：46-48.

[30]潘祖亭，姚禮峰，馬紅燕.己烯雌酚熒光性質(zhì)的研究及其分析應(yīng)用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，43（6）：701-705.

Review on detection methods of diethylstilbestrol in food

WANG Yao1，ZHOU Jian-hua1，ZHANG Hong-yan1，BING Xin2，*
（1.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan 250014，China；2.Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality，Jinan 250103，China）

Diethylstilbestrol is an artificial synthetic estrogen，mainly added in fodder，and can cause an imbalance of human body hormone.The physicochemical property，presence，the harm to human health and detection methods of diethylstilbestrol were reviewed.Qualitative and quantitative detection methods of diethylstilbestrol were introduced in detail，which could offer a helpful reference for further study of detection methods of diethylstilbestrol in food.

diethylstilbestrol；estrogen；food；detection methods

TS207.3

A

1002-0306（2012）03-0373-03

2011－02－28 *通訊聯(lián)系人

王瑤（1986-），女，碩士，研究方向：食品安全檢測(cè)。

山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（2009KYZ05）；第四十七批博士后基金（20100471569）。