超聲波輔助雙水相體系提取橡實仁多酚的研究

馬立然，黃 亮，2，*，李安平，2，謝碧霞

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004；2.糧油深加工及品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南長沙410004）

超聲波輔助雙水相體系提取橡實仁多酚的研究

馬立然1，黃 亮1，2，*，李安平1，2，謝碧霞1

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南長沙410004；2.糧油深加工及品質(zhì)控制湖南省重點實驗室，湖南長沙410004）

采用超聲波輔助雙水相體系提取橡實仁多酚，通過單因素實驗和正交實驗對提取條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明：丙酮體積分數(shù)對多酚得率有顯著影響，硫酸銨用量、超聲時間、料液比在考察的范圍內(nèi)對多酚得率影響不顯著；橡實仁多酚的最佳提取條件為：丙酮體積分數(shù)80%，硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時間25min，料液比（W/V）1∶45；在此條件下進行了驗證實驗，得到橡實仁多酚的平均得率為3.3033mg/g，RSD為0.7674%，表明提取結(jié)果穩(wěn)定性極好。

雙水相體系，超聲提取，橡實仁，多酚

橡實是泛指除大量栽培種植板栗以外的殼斗科Fagaceae植物種子的總稱[1]。殼斗科植物一般為落葉或常綠喬木，鮮為灌木。我國是世界橡子的主要產(chǎn)地之一[2]。橡實營養(yǎng)豐富，淀粉含量一般在50%以上，蛋白質(zhì)、脂肪、VB含量都高于五谷，果仁碾制成的橡子粉是純綠色食品[3]。橡實殼和橡實仁均含有多酚類物質(zhì)[4-5]，具有抗氧化[6]、抑菌、抗動脈硬化、抗癌變和防治心腦血管疾病[7]等功效，已經(jīng)得到越來越多人的關(guān)注和研究。傳統(tǒng)的提取方法如溶劑浸提法，不僅提取不完全，耗時，而且溶劑浪費嚴重。超聲波提取法具有空化效應(yīng)、粉碎作用，對植物細胞有破壞現(xiàn)象，能使所提取物質(zhì)很好地溶于溶劑中，具有提取時間短，產(chǎn)率高，無需加熱等優(yōu)點[8]。雙水相萃取分離技術(shù)是一種新型的分離技術(shù)，因其分離條件溫和、成相時間短、適合大規(guī)模操作、生物親和性好等優(yōu)點[9]已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于食品化工、重金屬離子、植物有效成分的分離[10-12]。本文采用超聲波輔助丙酮-硫酸銨雙水相體系提取分離橡實仁中多酚，并通過正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橡實 大葉青岡，采自湖南衡山，于40℃干燥箱中干燥并粉碎通過100目篩；沒食子酸、磷酸氫二鈉 國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀 天津市博迪化工有限公司；酒石酸鉀鈉 湘中化學試劑有限公司；硫酸亞鐵 廣東省臺山市化工廠；硫酸銨 天津市大茂化學試劑廠；丙酮 湖南匯虹試劑有限公司；無水乙醇 安徽安特生物化學有限公司；以上試劑均為分析純。

101-型電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司；FZ101微型植物試樣粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；AR1140電子分析天平 奧豪斯（上海）公司；R201D-Ⅱ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司；5510E-DTH超聲波清洗器 美國必能信公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多酚含量的測定 采用酒石酸亞鐵法進行測定。

1.2.2 標準曲線的繪制 準確稱取50mg沒食子酸，用蒸餾水溶解，定容至100mL，搖勻，制備成0.5mg/mL的沒食子酸標準溶液。用移液管分別移取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于50mL容量瓶中，加蒸餾水至5mL和酒石酸亞鐵溶液5mL，充分混合，再加pH7.5磷酸鹽緩沖液至刻度，靜置15min，以試劑空白溶液作參比，在540nm處測定吸光度。以沒食子酸標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=18.449x-0.0211，R2=0.9988（圖1）。式中：y-吸光度，x-沒食子酸標準液質(zhì)量濃度，mg/mL。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.2.3 丙酮-硫酸銨雙水相體系 丙酮-硫酸銨形成雙水相體系參照文獻[13-14]。在丙酮中加入硫酸銨，通過改變丙酮體積分數(shù)和鹽的用量來控制雙水相的形成。

1.2.4 橡實仁中多酚的提取與含量測定 準確稱取1.0g橡實仁粉末于具塞錐形瓶中，加入一定量的丙酮溶液和硫酸銨形成雙水相體系，浸泡30min，超聲提取一定時間，趁熱真空抽濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，上層丙酮相用30%乙醇定容至100mL，按照1.2.2的方法在540nm處測定吸光度，根據(jù)下式計算多酚得率。

式中：C-多酚質(zhì)量濃度（mg/mL），V-提取液的體積（mL），M-樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素實驗

1.2.5.1 丙酮體積分數(shù)和硫酸銨用量的選擇 固定料液比1∶30（g/mL），超聲時間15min，分別在丙酮體積分數(shù)為50%、60%、70%，不同硫酸銨用量的條件下提取，測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.2 超聲時間的選擇 固定料液比1∶30（g/mL），丙酮體積分數(shù)70%，硫酸銨用量0.16g/mL，分別在超聲時間為5、10、15、20、25、30min的條件下提取，測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.5.3 料液比的選擇 固定超聲時間25min，丙酮體積分數(shù)70%，硫酸銨用量0.16g/mL，分別在料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50的條件下提取，測定吸光度，計算多酚得率。

1.2.6 正交實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇丙酮體積分數(shù)、硫酸銨用量、超聲時間、料液比為考察因素，采用四因素三水平進行正交實驗，正交實驗因素水平表如表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 橡實仁多酚提取工藝的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 丙酮體積分數(shù)與硫酸銨用量對多酚得率的影響 由圖2可以看出，不同丙酮體積分數(shù)的雙水相體系，隨著硫酸銨用量的增加，多酚得率增加，當加入的硫酸銨達到一定量時，多酚得率開始下降。當丙酮體積分數(shù)分別為50%、60%、70%時，多酚得率達到最大值硫酸銨用量分別為0.22、0.18、0.16g/mL，此時，多酚得率分別為2.3856、2.4127、2.4344mg/g。

物質(zhì)在雙水相體系中的萃取分離行為受分配定律支配。在丙酮-硫酸銨形成的雙水相體系中，上相富含丙酮，下相富含無機鹽，橡實仁多酚易溶于有機溶劑，根據(jù)相似相溶原理，多酚進入富含丙酮的上相中。雙水相的形成是一個丙酮與硫酸銨爭奪水分子的過程。當加入的丙酮量小時，分相所需硫酸銨的量較大。隨著硫酸銨濃度進一步增加，鹽對水的束縛能力增強，奪取了水分子，丙酮被釋放出來，從而使上相中丙酮的體積分數(shù)增加，下相中丙酮的體積分數(shù)減少，進而影響到上相的極性，必然影響到多酚在上相中的分配。由圖2可知，選取丙酮體積分數(shù)為70%，硫酸銨用量為0.16g/mL為最佳提取條件。

圖2 不同丙酮體積分數(shù)和（NH4）2SO4用量對多酚得率的影響Fig.2 Effect of amount of（NH4）2SO4on the yield of polyphenols in different acetone concentration

2.1.2 超聲時間對多酚得率的影響 由圖3可以看出：多酚得率隨著時間延長而增大，這是因為超聲時間延長，可以使多酚充分地溶解到丙酮相中。達到25min時達到最大值，說明多酚已溶解完全，超過25min后多酚得率下降，可能是由于多酚的不穩(wěn)定性，在氧氣和光照條件下發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)導致多酚得率下降。因此，提取時間不宜過長，選擇25min為最適宜超聲時間。

圖3 超聲時間對多酚得率的影響Fig.3 Effect of length of extraction time on the yield of polyphenols

2.1.3 料液比對多酚得率的影響 由圖4可以看出：隨著料液比的增加，多酚得率逐漸上升，在料液比1∶40時達到最大值，隨后下降?？赡苁怯捎陔S著料液比的增加，其他可以溶于丙酮的成分溶出，影響到了測定結(jié)果。同時，料液比過大造成溶劑的浪費，也給后續(xù)的濃縮純化等工作帶來困難。因此選擇料液比1∶40為最佳提取料液比。

圖4 料液比對多酚得率的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols

2.2 正交實驗優(yōu)化提取工藝的結(jié)果與分析

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

在單因素實驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）的正交實驗，統(tǒng)計分析得到的數(shù)據(jù)，通過極差和方差分析確定橡實仁多酚的最佳提取條件，結(jié)果見表2和表3。

表3 橡實仁多酚正交實驗結(jié)果方差分析表Table 3 The variance analysis of the orthogonal experiment for polyphenols of acorn seed

由表2和表3可以看出，極差R值：RA＞RC＞RD＞RB，影響橡實仁多酚得率因素主次順序為A＞C＞D＞B，即丙酮體積分數(shù)對多酚得率影響最大，超聲提取時間次之，其次是料液比，硫酸銨用量對多酚得率影響最??；丙酮體積分數(shù)對多酚得率有顯著性差異，其他因素在考察范圍內(nèi)影響較小。

綜合極差分析和方差分析得出，橡實仁多酚提取的最佳工藝組合是A3B2C2D3，即丙酮體積分數(shù)80%、硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時間25min，料液比（W/V）1∶45，橡實仁多酚得率為3.3033mg/g。

2.3 驗證實驗

為了檢驗正交實驗所得出結(jié)果的可靠性，采用上述最佳提取條件A3B2C2D3進行提取實驗，做三次平行，多酚得率分別為3.2799、3.3015、3.3286mg/g，多酚平均得率為3.3033mg/g，相對標準偏差RSD（Relative Standard Deviation）為0.7674%，表明優(yōu)化得到的最佳提取工藝參數(shù)可靠和準確，具有可行性和參考應(yīng)用價值。

3 結(jié)論

3.1 本實驗考察了丙酮體積分數(shù)、硫酸銨用量、超聲時間、料液比對多酚得率的影響，通過正交實驗的數(shù)據(jù)處理可知，丙酮體積分數(shù)對多酚得率的影響有顯著性差異，其他因素在考察的范圍內(nèi)對多酚得率影響較小。各因素對多酚得率的影響主次順序為丙酮體積分數(shù)＞超聲時間＞料液比＞硫酸銨用量。

3.2 超聲波輔助雙水相體系提取橡實仁多酚的最佳工藝條件為：丙酮體積分數(shù)80%，硫酸銨用量0.16g/mL，超聲時間25min，料液比（W/V）1∶45，在此條件下橡實仁多酚的平均得率為3.3033mg/g。

3.3 本實驗采用超聲波輔助雙水相體系提取多酚，可縮短提取時間，提取效果好，提取率高，條件溫和，可以獲得高活性的生物活性物質(zhì)。并且多酚在丙酮-硫酸銨雙水相體系中分配于丙酮相中，其他水溶性雜質(zhì)等則分配于鹽水相中，在提取的同時達到了多酚與雜質(zhì)的分離，有效地提高了純度。因此，在天然產(chǎn)物活性成分的提取分離領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

[1]胡芳名，李建安.湖南省主要橡子資源綜合開發(fā)利用的研究[J].中南林學院學報，2000，20（4）：41-45.

[2]白坤，趙智星，景曉輝.橡子資源的開發(fā)和產(chǎn)品加工技術(shù)[J].現(xiàn)代商貿(mào)工業(yè)，2000（5）：50-51.

[3]魏練平，毛非鴻，蔣立科，等.橡子營養(yǎng)成分及其加工利用的初步研究[J].安徽農(nóng)學通報，2007，13（9）：137.

[4]鄭菲，黃亮，李安平，等.響應(yīng)面法優(yōu)化橡實殼中多酚提取工藝條件[J].食品與機械，2011（1）：49-51.

[5]謝碧霞，謝濤.我國橡實資源的開發(fā)利用[J].中南林學院學報，2002，22（3）：37-41.

[6]Chiou J W.The antioxdant activity and the chemical structure of sclected components of acorns and their potential use as inhibitors of milk oxidation[J].Diss Abstr Int B，1990，50（11）：4836.

[7]張志健，王勇.我國橡子資源開發(fā)利用現(xiàn)狀與對策[J].氨基酸和生物資源，2009，31（3）：10-14.

[8]Guo X W.A method to extract chemical components from Chinese herbs-ultrasonic method[J].Natural Product Research and Development，1999，11（3）：37-40.

[9]Josefine P，Hansolof J.Aqueous polymer two-phase systems formed by new thermoseparating polymers[J].Bioseparation，2000（9）：105-116.

[10]Vania G L，Aparecida B M，Igorgose B S，et al.Separation of Cd and Ni from Ni-Cd batteries by an environmentally safe methodology employing aqueous two-phase systems[J].Journal of Power Sources，2009，193：908-913.

[11]Chethanas S，Chetan A N，Raghavarao KSMS.Aqueous two phase extraction for purification and concentration of betalains [J].Journal of Food Engineering，2007，81：679-687.

[12]江詠，李曉璽，李琳，等.雙水相萃取技術(shù)的研究進展及應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技，2007，28（10）：235-238.

[13]高強，崔巖巖，陳火林，等.丙酮-硫酸銨雙水相體系分離純化紅花紅色素[J].化學研究與應(yīng)用，2007，19（6）：679-682.

[14]王志華，馬會民，馬泉莉，等.雙水相萃取體系的研究[J].應(yīng)用化學，2001，18（3）：173-175.

Study on the extraction of polyphenols from acorn seed using ultrasound-assisted two-phase aqueous system

MA Li-ran1，HUANG Liang1，2，*，LI An-ping1，2，XIE Bi-xia1
（1.College of Food Science and Energy，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory of Deeply Processing and Quality Control of Cereals and Oils，Changsha 410004，China）

Polyphenols from acorn seed was extracted by ultrasound-assisted two-phase aqueous system and through one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods to optimize extracting condition.The results indicated that acetone concentration had significant influence on the yield of polyphenols，the influence of amount of（NH4）2SO4and ultrasonic time and material-solvent ratio on the yield of polyphenols wasn't significant under the test range.The optimum conditions for the extraction of polyphenols were as follows，acetone concentration 80%，amount of（NH4）2SO40.16g/mL，ultrasonic time 25min，material-solvent ratio 1∶45（W/V）. Under the optimum conditions，through duplicated experiment the yield of polyphenols was 3.3033mg，RSD was 0.7674%，it indicated that the extraction rate of polyphenols was extremely stable.

two-phase aqueous system；ultrasonic extraction；acorn seed；polyphenols

TS201.2

B

1002-0306（2012）03-0191-04

2011－05－03 *通訊聯(lián)系人

馬立然（1983-），女，碩士，研究方向：食品科學。

國家林業(yè)科技公益項目（200804033）。