卷丹百合種球繁育及組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

◎ 陳 華，鄭傳奇，蘇海鋒

（1.貴州黔西南喀斯特區(qū)域發(fā)展研究院，貴州 興義 562400；2.中國科學(xué)院 重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714）

百合為單子葉植物綱百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本植物，是世界上著名的觀賞植物，資源種類豐富，應(yīng)用歷史悠久。藥用百合為百合科植物卷丹（L. lancifoliumThunb）、百合（Lilium browniiF. E. Brown var.viridulumBaker）、細(xì)葉百合（Lilium pumilumDC.）的干燥肉質(zhì)鱗葉，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性甘、微寒，歸肺、心經(jīng)，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效，常用于治療陰虛久咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢與精神恍惚等癥狀[1]。卷丹是中國百合屬中分布最廣的植物，花大色艷，抗性強(qiáng)，為少見的三倍體品種[2-3]。其化學(xué)成分主要為營養(yǎng)性物質(zhì)和生物活性成分，如氨基酸、淀粉、蛋白質(zhì)、多糖、皂苷和黃酮等[4]，是一種集觀賞、食用和藥用價值為一體的重要經(jīng)濟(jì)作物及極具開發(fā)前景的藥食兩用植物[5-6]，在藥品、食品、化妝品及保健品領(lǐng)域均具有開發(fā)利用價值。但是，由于近年來野生資源被大量采挖，而人工栽培周期較長，加之種球多為農(nóng)戶自行分栽小鱗莖，易導(dǎo)致品種退化及抗病性差等問題，嚴(yán)重影響了卷丹百合的質(zhì)量與產(chǎn)量，因此，優(yōu)質(zhì)種球繁育技術(shù)成為了當(dāng)下研究熱點。

百合種球繁育可以通過種子、組織培養(yǎng)、鱗片扦插、小鱗莖與珠芽繁殖等方法進(jìn)行[7]，尤以優(yōu)質(zhì)鱗莖無性繁殖常見，但無性繁殖存在繁殖系數(shù)小、易感染病毒及品種退化等問題，不利于卷丹百合的可持續(xù)健康發(fā)展[8-9]，而組織培養(yǎng)能提高鱗莖的繁殖系數(shù)，快速提供更多優(yōu)質(zhì)的種苗，是培養(yǎng)脫毒苗和新品種的關(guān)鍵技術(shù)[10-11]，成為目前百合快速繁育研究的熱點。

1 卷丹百合形態(tài)特征

卷丹百合為多年生球莖草本植物，鱗莖白色，直徑達(dá)8 cm以上，鱗片寬卵形；莖高達(dá)1.5 cm，質(zhì)硬，具白色綿毛與紫色條紋；葉散生，深綠色，披針形或矩圓狀披針形，5～7脈，葉先端有白毛，邊緣具乳頭狀突起，上部葉腋有深紫黑色株芽；紫色花梗，長6～9 cm，具白綿毛；花下垂，總狀花序，3～6朵或更多，橙紅色，披針形并反卷，于下部2/3處有紫黑色斑點，習(xí)稱“虎皮斑”，花徑約1 cm，外輪花被片長6～10 cm，寬1～2 cm，雄蕊向四面張開，淡紅色花絲長5～7 cm，矩圓形花藥，紫褐色花粉，圓柱形子房，花柱長4.5～6.5 cm；葉狀苞片，具白綿毛，花期7—8月，果期9—10月[12]。

2 卷丹百合種球繁育

2.1 種子繁殖

利用百合的種子播種，可以在短時間內(nèi)獲得大量的百合種球，但并不是所有百合都適合種子播種，如三倍體卷丹，因種子發(fā)芽后生長緩慢，從出苗到開花需多年時間，因此不適合采用種子撒播繁殖。常見可以種子播種繁殖的百合有王百合、野百合、麝香百合、臺百合、二倍體卷丹、青島百合、渥丹、川百合、毛百合、湖北百合及藥百合等。

2.2 鱗莖繁殖

百合生長1年后，其地下部能形成新的鱗莖，繁殖時將鱗莖進(jìn)行分割，先縱切成數(shù)塊后，再分切成每2個鱗片為1個單元的小塊，鱗片上應(yīng)帶有莖盤。種植后，雙鱗片的腋芽可萌發(fā)成幼芽，莖盤能長出多個小鱗莖，在挖取老鱗莖時，收集健康無病害的小鱗莖，按株、行距5 cm×25 cm播種，即可再形成完整的植株。但是采用小鱗莖繁殖時，隨著種植年限增加，種球容易退化，根腐病、炭疽病等病害易加重，且鱗莖作種因需求量大，成本較高，不宜作為卷丹百合規(guī)?；a(chǎn)繁殖技術(shù)。

2.3 珠芽繁殖

珠芽是卷丹百合繁殖的重要器官之一，著生于莖葉腋處，病毒少。繁殖方法為：珠芽采收前，先將花蕾及早除去，便于珠芽增大，至8月上旬珠芽顏色由綠轉(zhuǎn)黑后采收，采收后的珠芽與清潔沙混合置于干燥處，9月中下旬至10月上旬移植。選擇土層深厚、排水好的沙質(zhì)壤做苗床，每平方米苗床施用1 kg左右的餅粕，再加一些草木灰做基肥，與深翻后的土壤拌勻后開行距12～15 cm的淺溝，并于床苗上挖10～15 cm寬，3～4 cm深的坑播珠芽，等長出鱗莖小球后移栽，3年后即可收獲種球[13]。此外，還有研究者對影響卷丹百合珠芽發(fā)育的因素進(jìn)行了研究，如張恪等[14]通過不同溫度積層處理卷丹百合珠芽，結(jié)果表明，5 ℃處理的珠芽發(fā)芽率高、發(fā)芽早、發(fā)芽勢強(qiáng)。張慧等[15]研究表明，添加赤霉素有利于卷丹百合珠芽生長發(fā)育。

2.4 鱗片扦插繁殖

鱗片是無性繁殖中最常用的組織及繁殖系數(shù)最高的部位，鱗片扦插是百合種球繁育的重要方式，張金云剝?nèi)【淼ぐ俸现袑喻[片，采用1 000倍液KMnO4浸泡10 min，再用150 mg·kg-1NAA浸泡2 min后，將鱗片凹面朝上扦插在配好的6種基質(zhì)中（蛭石+珍珠巖、泥炭+蛭石、沙+泥炭、沙+珍珠巖、蛭石+沙、泥炭+珍珠巖，基質(zhì)配比用量均為1∶1），結(jié)果表明泥炭+沙或泥炭+蛭石兩種混合基質(zhì)較好[7]。周秀玲等[16]采用研究6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、5-吲哚丁酸（5-IBA）、二氯苯氧乙酸（2,4-D）5種植物生長調(diào)節(jié)劑對卷丹百合埋片繁殖的影響，通過剝?nèi)≈袑喻[片，用0.3%的KMnO4溶液消毒15 min后沖洗晾干放入調(diào)節(jié)劑中浸泡2 h后扦插，發(fā)現(xiàn)2,4-D對卷丹百合鱗片繁殖和生根的效果優(yōu)于其他調(diào)節(jié)劑。徐麗萍等[17]采用蛭石、青海草炭、鋸末三種基質(zhì)，通過一定的配比，將40%福爾馬林溶液浸泡30 min后的卷丹鱗片插入基質(zhì)中，結(jié)果表明，鋸末誘導(dǎo)產(chǎn)生的小鱗莖數(shù)量最多。蔡鵬等[18]總結(jié)前人研究百合鱗片扦插的優(yōu)缺點，認(rèn)為單一的調(diào)控激素、基質(zhì)、溫度來促進(jìn)鱗片的生長，都有一定的局限性，從而設(shè)計出采用懸空海綿水培法進(jìn)行鱗片扦插育苗的方法，結(jié)果表明，懸空海綿組與盆栽組中加入活性炭高度為0.2～0.3 cm時，鱗片生長的各項指標(biāo)最優(yōu)；而在基質(zhì)相同時，懸空海綿組的鱗片生長狀況優(yōu)于盆栽組，且懸空海綿操作簡單、鱗片生長好，增殖多，是鱗片扦插育苗的一種新方法。顏范悅等[19]研究不同消毒劑對百合埋片繁殖的影響，結(jié)果表明，嘧酶胺1 000倍液+代森錳鋅800倍液與福美雙700倍液有利于百合鱗片生成較多籽球。

3 百合組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究

3.1 培養(yǎng)條件

不同研究者的培養(yǎng)條件有差異，如田山君等[20]培養(yǎng)野生卷丹的條件為：光照培養(yǎng)箱內(nèi)以白天45 ℃、夜間26 ℃交替處理1個月，光照強(qiáng)度為1 500 Lx，培養(yǎng)出來的卷丹百合長勢較優(yōu)。鐘燦等[10]對卷丹百合鱗莖進(jìn)行離體再生研究的培養(yǎng)條件為溫度（26±1）℃、光 強(qiáng) 2 000 Lx、 濕 度 80%、 光 照 時 間 14 h·d-1， 培育出的卷丹百合長勢較好。陳貴華等[21]對卷丹百合鱗片組織培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為3 000 Lx，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時長14 h·d-1。通過總結(jié)發(fā)現(xiàn)，卷丹百合培養(yǎng)條件范圍為光照強(qiáng)度2 000～3 000 Lx，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照時間14～16 h·d-1，相對濕度70%～80%時，均能培育出長勢較好的卷丹百合。

3.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇

百合培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有MS、B5、N6以及White等培養(yǎng)基，卷丹百合以MS培養(yǎng)基報道較多，在初代培養(yǎng)及增殖培養(yǎng)中，都以MS為主，而生根培養(yǎng)則是以1/2 MS較多，如源朝政[22]研究表明適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.2 mg的大分子中性氨基酸（LNAA），趙春曉等、BO等研究表明1/2 MS+0.1 mg的LNAA為最適合生根的培養(yǎng)基[23-24]。

3.3 外植體的選擇及消毒方法

3.3.1 外植體的選擇

研究表明，百合組織培養(yǎng)的外植體可以選擇種子、珠芽、鱗片、葉片、莖段及花藥等，因百合鱗片內(nèi)部存儲有大量的營養(yǎng)物質(zhì)及水分，容易誘導(dǎo)出不定芽，因此以百合鱗片為最優(yōu)。有研究表明，卷丹百合中層鱗片分化率最強(qiáng)，分化率順序為中層鱗片＞內(nèi)層鱗片＞外層鱗片[25]。

3.3.2 消毒方法

百合組織培養(yǎng)過程中，污染是阻礙培養(yǎng)進(jìn)展以及造成經(jīng)濟(jì)損失的重要因素，百合組織培養(yǎng)污染以真菌與細(xì)菌污染為主，污染后培養(yǎng)基表面出現(xiàn)霉變、有黏液、形成發(fā)酵泡沫等[26]。因此，消毒劑及消毒時間研究是卷丹百合組織培養(yǎng)的重要部分。

卷丹百合外植體消毒常用自來水沖洗后，用75%酒精預(yù)滅菌30～60 s，再加0.1% HgCl2滅菌8～15 min。也有文獻(xiàn)報道，卷丹百合外植體消毒不用HgCl2而用NaClO，或HgCl2與NaClO同時用，如田山君研究表明用75%的乙醇浸泡30 s后，再用10% NaClO消毒20 min，可達(dá)到40%的最低污染率[20]；鐘燦研究用8%NaClO消毒15 min配合0.1% HgCl2消毒15～20 min后，消毒效果較好，鱗片成活率高[10]。

3.4 細(xì)胞分裂素與植物生長素

一定量的細(xì)胞分裂素及植物生長素有利于卷丹百合鱗片誘導(dǎo)出不定芽，并能促進(jìn)不定芽的增殖及生根。常用的細(xì)胞分裂素有6-BA和噻苯?。═DZ），植物生長素有NAA、2,4-D、IAA和3-吲哚丁酸（IBA）。卷丹百合組織培養(yǎng)過程中，常用6-BA與NAA配合使用，認(rèn)為6-BA在不定芽的誘導(dǎo)及增殖中起主要作用，而NAA則促進(jìn)根的分化。如蔣瑤等[27]研究表明，卷丹最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA；增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg·L-1NAA。符勇耀等[28]研究表明卷丹外層鱗片在 MS+1.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖中進(jìn)行組培效果最佳；不定芽在MS+2.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗 糖 中增殖效果最好?？v觀國內(nèi)外近年來的文獻(xiàn)，卷丹百合組培時細(xì)胞分裂素與植物生長素的量有所差異，各研究者所得出的結(jié)論各不相同，但是6-BA應(yīng)用濃度范圍在 0.5～ 3.0 mg·L-1，NAA 濃度在 0.1～ 1.0 mg·L-1時均能培育出小鱗莖，且有較高的分化率。

3.5 組培苗的移栽

幼苗根長至5 cm左右時，可以進(jìn)行室外移栽，但移栽之前要放置于溫室內(nèi)進(jìn)行煉苗，方法為：將生根的培養(yǎng)瓶移到室外遮蔭棚內(nèi)進(jìn)行強(qiáng)光閉瓶煉苗5～15 d，遮蔭度為60%左右，然后松開培養(yǎng)瓶蓋培養(yǎng)1 d，再部分開蓋培養(yǎng)2 d，最后完全揭去瓶蓋放置5 d左右后，將苗用自來水徹底沖洗附著的培養(yǎng)基，假植到已滅菌的基質(zhì)中?；|(zhì)種類對百合移栽的存活率有很大的影響，可以選擇的基質(zhì)有蛭石、沙土、泥炭土、腐殖土∶鋸末=1∶1的混合基質(zhì)土等。趙春曉等[23]統(tǒng)計卷丹再生植株在3種不同基質(zhì)（營養(yǎng)土∶珍珠巖=1∶1、園土∶珍珠巖=1∶1、營養(yǎng)土∶園土∶珍珠巖=1∶1∶1）中的成活率，結(jié)果營養(yǎng)土∶園土∶珍珠巖=1∶1 ∶1時，存活率最高（85%），且再生植株顏色較綠，葉片大。張旭紅[29]研究了21種野生百合再生體系的建立，將卷丹組培苗植于河沙∶草炭=1∶2的混合基質(zhì)中，2個月后其成活率達(dá)90%以上，且植株生長健壯，長勢一致。

4 結(jié)語

卷丹不僅是三大食用百合之一，而且還是入藥典的三大百合之一，具有潤肺止咳、清心安神的功效，其適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，是極具開發(fā)價值的藥食同源的經(jīng)濟(jì)作物。但是在傳統(tǒng)的栽培模式中，容易導(dǎo)致品種退化、抗病性差等問題，因此，研究卷丹百合種球繁育技術(shù)及組織培養(yǎng)技術(shù)是提高百合的品質(zhì)與產(chǎn)量的重要手段。

組織培養(yǎng)技術(shù)可以效地解決優(yōu)良種源性狀穩(wěn)定和快速繁殖的難題，是規(guī)模化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、無毒種苗的有效途徑。目前，據(jù)不完全統(tǒng)計，已有200多種藥用植物經(jīng)過組織培養(yǎng)技術(shù)成功獲得了植株苗，提高了藥材的質(zhì)量與產(chǎn)量，經(jīng)濟(jì)效益和社會效益顯著[30]。組織培養(yǎng)優(yōu)點明顯，但是也存在缺點，如組培成本相對較高、移栽成活率較低等，而鱗片扦插在生產(chǎn)中常用，不僅成本低且操作方便。因此，可以考慮利用組培苗培育原種后，再用其鱗莖進(jìn)行扦插繁殖，這樣不僅能提高繁殖速度還能節(jié)約成本，是一種健康可持續(xù)的育種方法之一，后續(xù)研究者可以往此方面作深一步的研究。