高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定醬腌菜中三氯蔗糖含量的不確定度評估

◎ 黃 宇，趙 嵩，張月松，汪 強

（馬鞍山市食品藥品檢驗中心，安徽 馬鞍山 243000）

三氯蔗糖，又稱為蔗糖素，在高溫下甜度不變[1-2]，甜味純正，其甜度約為蔗糖的600倍，是以蔗糖為原料的功能性甜味劑[3-4]，可有效減少肥胖人群和糖尿病患者對糖的攝入，被廣泛用于各類食品中[5]。有研究表明，腸道菌群的失調(diào)與消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病有一定的聯(lián)系[6]。腸道屏障和腸道內(nèi)環(huán)境及其代謝物的相互作用形成腸道穩(wěn)態(tài)，當(dāng)三氯蔗糖進入腸道后，腸道微生物豐度降低和結(jié)構(gòu)改變，促炎因子水平升高，腸道免疫屏障受損，無法有效抵制大量產(chǎn)生的腸道細菌毒素和病原體，致使腸道穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致機體持續(xù)的炎癥和腸道組織損傷。同時，經(jīng)過三氯蔗糖干預(yù)的腸道微生物組中耐藥基因增加，耐藥基因增加相應(yīng)耐藥細菌也將繁殖，最終可能導(dǎo)致更惡劣的腸道環(huán)境[7-8]，因此，三氯蔗糖在食品中的使用仍須嚴(yán)格控制。2019年12月，安徽省市場監(jiān)督管理局發(fā)布了本年度第51期食品抽檢信息，在466批次樣品中檢出6批次不合格樣品，涉及甜味劑項目不合格樣品3批次，其中三氯蔗糖不合格2批次，且不合格樣品均為醬腌菜。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）規(guī)定腌漬的蔬菜中三氯蔗糖最大使用量為0.25 g·kg-1。當(dāng)檢測結(jié)果在限量值附近時，檢測結(jié)果對醬腌菜是否合格有直接影響。不確定度評定是評價測量方法的合理性與科學(xué)性的有效手段之一，當(dāng)不合格樣品在復(fù)檢時，不確定度也是評價測得值的準(zhǔn)確度、可信度的定量指標(biāo)。

本研究按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》（GB 22255—2014）中高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法檢測醬腌菜中三氯蔗糖含量，根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006—2019）建立數(shù)學(xué)模型，系統(tǒng)分析不確定度來源，通過對影響樣品檢測結(jié)果的不確定度進行評定，為當(dāng)樣品含量在限值附近的結(jié)果判定提供參考，對檢驗檢測過程的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配G4260B蒸發(fā)光散射檢測器，美國Agilent科技公司）；ME204E/02梅特勒-托利多電子天平（分度值：0.1 mg，瑞士Mettler TOLEDO公司）；GL-21M高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Arium-pro超純水發(fā)生器（德國Sartorius公司）；A100250多管渦旋儀（月旭科技（上海）股份有限公司）；N-EVAP 5085氮吹儀（美國Organomation公司）；HLB固相萃取柱（200 mg/6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）。

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.77%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；甲醇、乙腈、正己烷（色譜純，美國TEDIA公司）；0.45 μm有機系濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

醬腌菜為市售五香蘿卜條。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g（精確至0.000 1 g）于100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液：用5 mL吸量管分別吸取0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL三氯蔗糖中間液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度為20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.2 樣品前處理

稱取1.5 g（精確至0.000 1 g）醬腌菜樣品于50 mL離心管中，加入5 mL水渦旋振蕩3 min后加入15 mL甲醇，繼續(xù)渦旋20 min，以3 000 r·min-1離心10 min后，將上清液移入50 mL離心管中，沉淀物加入5 mL甲醇水溶液（75∶25，V∶V），渦旋振蕩30 s，以3 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)提取2次，合并上清液。上清液于沸水浴中氮吹至1 mL左右時，加入9 mL水，渦旋超聲波處理10 min。向離心管中加入10 mL正己烷，振搖2 min后以3 000 r·min-1離心10 min，棄去正己烷層。取全部上清液移入已活化好的固相萃取柱中，控制液體流速不超過每秒1滴，用1 mL水淋洗，排干柱中液體，加入3 mL甲醇洗脫，洗脫液于氮吹儀中氮吹近干，加入1.0 mL乙腈水溶液（11∶89，V∶V）溶解，溶液過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.3 儀器條件

色譜條件：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），月旭科技（上海）股份有限公司；柱溫：35 ℃；流動相：乙腈+水（11∶89，V∶V）；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)計算原理，可得醬腌菜的三氯蔗糖含量測定的數(shù)學(xué)模型[9]，定量結(jié)果按以下公式計算：

式（1）中：X為樣品中三氯蔗糖的含量，g·kg-1；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線查得樣品進樣液中三氯蔗糖的濃度，μg·mL-1；V為樣品定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；R為回收率；1 000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源的分析

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定醬腌菜中的三氯蔗糖的不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線變動性、樣品前處理、樣品測量重復(fù)性、樣品加標(biāo)回收等環(huán)節(jié)。

2.2 不確定度的分量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A)主要由標(biāo)準(zhǔn)品純度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a1)，標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a2)和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)組成。

（1）標(biāo)準(zhǔn)品純度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a1)。由三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書所得純度為99.77%，擴展不確定度為U=0.77%（k=2），標(biāo)準(zhǔn)品純度不確定度按正態(tài)分布計算，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a2)。使用萬分之一天平，按照純度換算稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.100 2 g。根據(jù)該天平檢定證書，在0～50 g稱量范圍內(nèi)，最大允許誤差為0.000 5 g，按照矩形分布計算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的玻璃器皿引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)主要由玻璃器皿的容量允差產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V)和溫度對體積的影響產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(T)組成。從《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）獲得容量器皿的允差δ，按照三角分布處理，取則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

由于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制需進行多次重復(fù)測定，而每次所用的容量瓶不可能保持完全相同，可認為容量瓶的體積誤差和讀數(shù)誤差已隨機化（有正有負），其不確定度分量可忽略，不再評定。溫度對體積的影響主要包括溫度對溶液體積和容量器皿的體積膨脹變化，容量器皿一般為硼硅酸鹽玻璃，膨脹系數(shù)為1×10-5℃-1，忽略不計。溫度對溶液體積的膨脹影響是指實驗室使用標(biāo)準(zhǔn)溶液與溫度配制時，溫度間變動而產(chǎn)生的影響，該實驗標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，因此，不存在溫度對體積的影響產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

（4）分度吸量管移液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V1)。根據(jù)1.2.1方法配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取標(biāo)準(zhǔn)溶液用的5 mL分度吸量管（A級），其體積允差為±0.025 mL，按三角分布處理，計算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

5次移取標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可近似用其均方根計算：

（5）100 mL容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V2)。使用的100 mL容量瓶（A級），其體積允差為±0.10 mL，計算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對于2.2.1（4）中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可忽略。

（6）10 mL容量瓶定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(V3)。使用的10 mL容量瓶（A級），其體積允差為±0.020 mL，計算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

使用5個10 mL容量瓶引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可近似用其均方根計算為：

相對于2.2.1（4）中的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可忽略。

由以上數(shù)據(jù)可得三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在配制過程中玻璃器皿產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(a3)=2.51×10-2。

因此，三氯蔗糖在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 樣品前處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(B)

待測試樣制備過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來自樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b1)和待測試樣定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b2)。

（1）樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b1)。準(zhǔn)確稱取1.5 g待測樣品，根據(jù)所用天平檢定證書，最大允許誤差為0.0005 g，按照矩形分布計算得出：

（2）待測試樣定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(b2)。使用1 mL單標(biāo)管吸取初始流動相定容，所用1 mL單標(biāo)管容量允差為±0.007 mL，按照三角分布計算得出：

因此，樣品前處理引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 樣品測量重復(fù)性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C)

按照1.2的實驗方法處理樣品，得到6次獨立測試的結(jié)果依次為 0.227 g·kg-1、0.214 g·kg-1、0.232 g·kg-1、0.208 g·kg-1、0.201 g·kg-1、0.215 g·kg-1，平均值為x-為0.216 g·kg-1。根據(jù)貝塞爾公式計算得出測量重復(fù)性引入的不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線變動性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(D)

按照2.2的實驗方法，對5個不同濃度的三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液進行3次測定，擬合出以I=a+bC形式的一元一次方程，根據(jù)公式（2）計算待測溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液測定結(jié)果表

式（2）中：SR為殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差；C0為待測樣品溶液濃度平均值的對數(shù)值；b為斜率；a為截距；P為樣品測定次數(shù)；n為工作曲線校準(zhǔn)點測量次數(shù)；C-為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點濃度對數(shù)的平均值。

由表1數(shù)據(jù)，根據(jù)蒸發(fā)光檢測器原理得出醬腌菜中三氯蔗糖含量，利用最小二乘法擬合線性方程及統(tǒng)計結(jié)果，見表2。

根據(jù)表2中的數(shù)據(jù)，計算得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線變動性引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

表2 三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液線性方程及統(tǒng)計結(jié)果表

2.2.5 回收率測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(R)

準(zhǔn)確稱取6份1.5 g空白樣品，按照最大使用量0.25 g·kg-1向其中加入三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)1.2的實驗方法測定其加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。其6次加標(biāo)回收率分別為：92.2%、98.4-%、90.2%、90.0%、93.8%、96.6%，平均加標(biāo)回收率R為93.53%，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=3.42%，則回收率引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

采用t檢驗法對回收率進行顯著性實驗確定其在計算公式中是否使用。由《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）附錄查知，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，自由度ν為5時，t0.95(5)=2.57。本實驗n=6，自由度ν=5，計算得出：

當(dāng)t≥2.57時，則回收率有非常顯著性差異，因此該實驗需要使用回收率校正結(jié)果為0.231 g·kg-1。

2.3 相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(x)

樣品中三氯蔗糖測定結(jié)果相對合成不確定度為：

2.4 不確定度結(jié)果報告

假設(shè)測量過程中的誤差屬于正態(tài)分布，取置信區(qū)間P=95%，包含因子k=2，則醬腌菜中的三氯蔗糖含量測定相對擴展不確定度為：

Urel=k×urel(x)=2×3.71×10-2=7.42%

該實驗測得樣品中三氯蔗糖含量為擴展不確定度為：

U=742%×0.231=0.017 1 g·kg-1

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測量醬腌菜中三氯蔗糖含量的結(jié)果表示為C=（0.231 0±0.0171）g·kg-1（k=2，P=95%）。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、樣品重復(fù)測定和樣品加標(biāo)回收對三氯蔗糖含量測定的不確定度貢獻最大。樣品前處理和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合對最終結(jié)果影響較小，因此在實驗中，樣品處理和加標(biāo)實驗應(yīng)保證各項操作的正確性和一致性。配制標(biāo)曲時應(yīng)選擇較高精密度的器皿，注意其最佳使用量程，減少誤差。當(dāng)使用精密儀器，應(yīng)選擇合適的實驗條件，注意各項操作規(guī)范，保證儀器設(shè)備的穩(wěn)定性，降低不確定度，提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確質(zhì)量。