腦紅蛋白和缺氧誘導(dǎo)因子-1α在牦牛后腦的表達(dá)與定位研究

杜曉華，米曉鈺，王海芳，溫永強(qiáng)，李 喬，劉 霞*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

腦紅蛋白(neuroglobin, NGB)是德國(guó)科學(xué)家Burmester等[1]在2000年首次發(fā)現(xiàn)的存在于脊椎動(dòng)物體內(nèi)的一種新型攜氧球蛋白?，F(xiàn)有研究表明，脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺氧極其敏感[2]，而NGB具有可逆性結(jié)合氧及清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物的功能，在腦低氧適應(yīng)性中發(fā)揮著重要作用，對(duì)其功能的深入探討也為缺血缺氧性疾病(如新生兒缺血缺氧性腦病)的研究和治療帶來了新的思路和方法[3-6]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是一種可在缺氧條件下發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的重要調(diào)節(jié)因子，在腦缺血缺氧的反應(yīng)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵調(diào)控作用[7]。有研究表明，在缺血缺氧性腦損傷中，HIF-1α可以促進(jìn)NGB生成[8]，也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)元(HN33)中使用shRNA介導(dǎo)HIF-1α低表達(dá)或慢病毒載體介導(dǎo)HIF-1α過表達(dá)，均會(huì)影響NGB的表達(dá)水平[9]，但迄今為止，NGB和HIF-1α之間的確切關(guān)聯(lián)機(jī)制仍未得到直接證實(shí)。牦牛(Bosgrunniens)是分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的牛種之一，對(duì)高寒低氧環(huán)境具有極強(qiáng)的適應(yīng)性[10]。后腦(hindbrain)作為哺乳動(dòng)物腦組織分區(qū)的重要組成部分，具有調(diào)節(jié)呼吸和循環(huán)活動(dòng)，控制機(jī)體運(yùn)動(dòng)、平衡及骨骼肌群共濟(jì)調(diào)節(jié)等功能[11]，其主要區(qū)域包括延髓、腦橋和小腦(小腦又分為小腦半球皮質(zhì)、小腦半球白質(zhì)、蚓前葉、蚓后葉、蚓小葉)，其中，延髓和腦橋主要控制機(jī)體運(yùn)動(dòng)、呼吸及心血管活動(dòng)等；小腦主要接受與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的信息及所有感覺信息，由于小腦內(nèi)部具有廣泛的傳入、傳出聯(lián)系，因此，小腦各區(qū)域又可與延髓、腦橋等區(qū)域進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)，共同完成后腦執(zhí)行的相關(guān)活動(dòng)。在牦牛長(zhǎng)期適應(yīng)高寒低氧環(huán)境的生活中，后腦必然也發(fā)揮著極其重要的調(diào)節(jié)作用。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于高原牦牛腦組織NGB與HIF-1α分布及表達(dá)的研究報(bào)道并不多見[12-14]，且研究結(jié)果相對(duì)單一，研究部位缺乏系統(tǒng)性。鑒于后腦在調(diào)節(jié)脊椎動(dòng)物機(jī)體重要生理活動(dòng)中的復(fù)雜性與重要性，本研究以高原牦牛后腦作為研究部位，采用RT-qPCR、Western blot、蘇木精-伊紅染色 (hematoxylin-eosin staining, HE)及免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)技術(shù)對(duì)NGB和HIF-1α在后腦不同區(qū)域的分布與表達(dá)特征進(jìn)行系統(tǒng)研究，探索NGB和HIF-1α在牦牛后腦不同區(qū)域的分布規(guī)律、表達(dá)水平及其與低氧環(huán)境之間的關(guān)聯(lián)，研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討牦牛腦組織低氧適應(yīng)性機(jī)制提供有價(jià)值的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及取樣

自甘肅省甘南藏族自治州合作市牛羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)采集2～5歲齡健康成年牦牛共計(jì)5頭份，公母不限。迅速開顱獲取完整腦組織，按圖1所示，采集后腦各部位的組織樣本，包括延髓、腦橋、小腦半球皮質(zhì)、小腦半球白質(zhì)、蚓前葉、蚓后葉及蚓小葉。分別置液氮和4%多聚甲醛中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

RT-qPCR試劑及耗材：AG RNAex Pro RNA提取試劑、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含去除gDNA試劑)、Rox染料均購(gòu)自北京瑞真生物技術(shù)有限公司。

Western blot試劑及耗材：兔抗NGB多克隆抗體(bs-1859R)、兔抗HIF-1α多克隆抗體(bs-0737R)、兔抗β-actin多克隆抗體(bs-0737R)、羊抗兔IgG/HRP(bs-0295G-HRP)均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自Biotopped，0.22 μm 聚偏二氟乙烯 (polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、4×蛋白上樣buffer(含DTT)、彩虹245廣譜蛋白Marker(11-245KD)、ECL超敏發(fā)光液均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司(北京)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

A. 背側(cè)觀；B. 腹側(cè)觀；C. 中央矢狀面觀 A. Dorsal view; B. Ventral view; C. Central sagittal view圖1 牦牛后腦大體解剖學(xué)位置Fig.1 The gross anatomy of the hindbrain in yak

免疫組織化學(xué)試劑及耗材：SP試劑盒(包括試劑1：內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑；試劑2：封閉用正常山羊血清工作液；試劑3：生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG；試劑4：辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液)購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 牦牛后腦不同區(qū)域NGB和HIF-1α mRNA RT-qPCR檢測(cè)

嚴(yán)格按照Trizol法步驟及Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行樣品總RNA提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)NCBI已收錄的牦牛NGB、HIF-1α、內(nèi)參基因(β-actin)序列，利用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，并送生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物信息列于表1。使用QuantStudio5儀器進(jìn)行RT-qPCR 試驗(yàn)。反應(yīng)體系(20 μL)：SYBR Green ProTaq10 μL、 上、下游引物(濃度為0.2 μmol·mL-1)各0.8 μL、 Rox染料0.4 μL、模板cDNA 2 μL、ddH2O 6 μL。 反應(yīng)參數(shù)：50 ℃ 2 min預(yù)熱；95 ℃ 2 min預(yù)變性；95 ℃ 10 s變性，60 ℃ 34 s退火，40個(gè)循環(huán)。每組設(shè)計(jì)3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)，利用Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)每個(gè)樣品的循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄量。

表1 RT-qPCR引物信息

1.4 牦牛后腦不同區(qū)域NGB和HIF-1α蛋白Western blot檢測(cè)

取牦牛后腦不同區(qū)域組織樣品各0.25 g，分別加入等量RIPA組織/細(xì)胞快速裂解液(1 mL RIPA+10 μL 苯甲基磺酰氟 (phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，搖床冰浴2 h (120 r·min-1)，于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，取30 μL，加入10 μL 4×蛋白上樣buffer(含DTT)，100 ℃煮沸10 min， 冷卻至室溫，保存于-20 ℃，備用。

蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)電泳后，根據(jù)條帶大小切膠，并在1×電轉(zhuǎn)液的作用下，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。用5 g·L-1脫脂奶粉4 ℃過夜封閉；分別加入一抗(NGB：1∶800、HIF-1α：1∶500、β-actin：1∶2 000稀釋)，室溫?fù)u床孵育3 h，PBST洗10 min×3次；加入二抗(1∶4 000稀釋)，室溫?fù)u床孵育1 h，PBST洗10 min×3次，ECL底物顯色試劑各1 mL覆蓋PVDF膜，暗室中曝光，X光片顯影、定影。每組蛋白重復(fù)3次，Image J分析掃描蛋白條帶，測(cè)定灰度值分析蛋白表達(dá)情況(蛋白表達(dá)量=目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)。

1.5 牦牛后腦不同區(qū)域NGB和HIF-1α蛋白免疫組織化學(xué)染色

對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域組織樣本進(jìn)行固定(4%多聚甲醛)，修塊(2 cm × 2 cm)，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋制成組織蠟塊，經(jīng)連續(xù)切片(厚度4 μm)、展片、貼片、烤片處理，HE常規(guī)染色、鏡檢。

采用免疫組織化學(xué)SP(strepta-vidin-perosidase)法進(jìn)行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精分化；高壓修復(fù)抗原后，滴加試劑1，37 ℃孵育15 min， PBS洗10 min×3次；隨后滴加試劑2，37 ℃孵育15 min，傾去勿洗；每張切片分別滴加50 μL一抗(NGB 1∶400、HIF-1α 1∶400稀釋)，37 ℃孵育4 h， PBS洗10 min×3次(陽(yáng)性、陰性分開洗)；滴加試劑3，37 ℃孵育15 min，PBS洗10 min×3次；滴加試劑4，37 ℃孵育15 min，PBS洗10 min×3次，最后滴加新鮮配制 HRP-DAB顯色液，常規(guī)脫水透明、封片、鏡檢。陰性對(duì)照以PBS替代一抗染色。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 NGB基因與蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域的表達(dá)

以β-actin基因作為內(nèi)參，對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域NGB進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖2)，NGBmRNA在牦牛后腦各區(qū)域均有表達(dá)。其中，蚓前葉表達(dá)量最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其后依次為小腦半球皮質(zhì)、蚓后葉、腦橋、小腦半球白質(zhì)、延髓和蚓小葉。小腦半球白質(zhì)、延髓、蚓小葉間差異不顯著，其余區(qū)域彼此間差異顯著(P<0.05)，蚓小葉表達(dá)量最低。

內(nèi)參基因?yàn)棣?actin；不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)。下同 Reference gene is β-actin. Different lowercase letters represent significant differences (P <0.05). The same as below圖2 牦牛后腦不同區(qū)域NGB RT-qPCR檢測(cè)Fig.2 The RT-qPCR results of NGB in different regions of yak’s hindbrain

以β-actin蛋白作為內(nèi)參，對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域NGB進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖3)，NGB蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，蚓前葉表達(dá)量為最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其他依次為小腦半球皮質(zhì)、蚓后葉、腦橋、延髓、小腦半球白質(zhì)和蚓小葉。延髓與腦橋之間、小腦半球白質(zhì)與蚓小葉之間差異不顯著，其余區(qū)域彼此間差異顯著(P<0.05)，蚓小葉表達(dá)量最低。

2.2 HIF-1α基因與蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域的表達(dá)分析

以β-actin基因作為內(nèi)參，對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域HIF-1α進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖4)：HIF-1αmRNA在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，其中，在蚓前葉表達(dá)量為最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其后依次為小腦半球皮質(zhì)、蚓后葉、小腦半球白質(zhì)、蚓小葉、腦橋、延髓。小腦半球白質(zhì)與蚓小葉、延髓與腦橋之間差異不顯著，其余區(qū)域彼此間差異顯著(P<0.05)，延髓表達(dá)量最低。

A. NGB蛋白檢測(cè)結(jié)果；B. NGB蛋白相對(duì)表達(dá)量 A. Detection results of NGB protein; B. Relative expression of NGB protein圖3 牦牛后腦不同區(qū)域NGB蛋白Western blot檢測(cè)Fig.3 The Western blot results of NGB in different regions of yak’s hindbrain

以β-actin蛋白作為內(nèi)參，對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域HIF-1α進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示(圖5)：HIF-1α蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，其中，在蚓前葉表達(dá)量為最高，顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，其他依次為小腦半球皮質(zhì)、蚓后葉、小腦半球白質(zhì)、腦橋、延髓和蚓小葉，小腦半球皮質(zhì)與蚓后葉、腦橋與小腦半球白質(zhì)之間差異不顯著，其余區(qū)域彼此間差異顯著(P<0.05)，蚓小葉表達(dá)量最低。

2.3 NGB和HIF-1α蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域的分布

牦牛后腦延髓區(qū)域主要由神經(jīng)核團(tuán)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)纖維的髓鞘和軸突構(gòu)成；腦橋內(nèi)部也含有大量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核團(tuán)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，構(gòu)成與延髓類似(圖6 A1～A2)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，NGB和HIF-1α蛋白主要分布于延髓和腦橋神經(jīng)元胞質(zhì)中，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、髓鞘及軸突無(wú)明顯陽(yáng)性反應(yīng)著色，HIF-1α蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度整體高于NGB蛋白(圖6 B1、B2、C1、C2)。

內(nèi)參基因?yàn)棣?actin Reference gene is β-actin圖4 牦牛后腦不同區(qū)域HIF-1α RT-qPCR檢測(cè)Fig.4 The RT-qPCR results of HIF-1α in different regions of yak’s hindbrain

牦牛小腦半球皮質(zhì)由外向內(nèi)可分為明顯的三層結(jié)構(gòu)，依次為分子層、浦肯野細(xì)胞層和顆粒層(圖6 A3)。其中，分子層主要包括無(wú)髓神經(jīng)元纖維及少量神經(jīng)元，如籃狀細(xì)胞；浦肯野細(xì)胞胞體呈梨形，排列整齊有序；顆粒層則由密集排列的顆粒細(xì)胞構(gòu)成。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，牦牛小腦半球皮質(zhì)分子層可見有散亂分布的NGB和HIF-1α陽(yáng)性反應(yīng)著色，籃狀細(xì)胞內(nèi)也存在少量陽(yáng)性表達(dá)；浦肯野細(xì)胞的樹突細(xì)胞胞質(zhì)有較強(qiáng)的NGB和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)；顆粒細(xì)胞胞質(zhì)中亦有較強(qiáng)的NGB和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，NGB和HIF-1α 蛋白免疫陽(yáng)性著色定位主要在神經(jīng)元胞質(zhì)，HIF-1α蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度整體高于NGB蛋白(圖6 B3、C3)。小腦半球髓質(zhì)區(qū)主要由無(wú)髓神經(jīng)纖維構(gòu)成，其中散在分布有少量神經(jīng)核團(tuán)(齒狀核等)及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖6 A4)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，牦牛小腦半球髓質(zhì)區(qū)神經(jīng)元胞質(zhì)中可見NGB和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中也有少量表達(dá)(圖6 B4、C4)。

HE結(jié)果顯示，牦牛小腦蚓前葉、蚓后葉、蚓小葉皮質(zhì)區(qū)均有分層現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)與小腦半球皮質(zhì)類似(圖6 A5～A7)。其中，蚓前葉分子層、顆粒層較薄，分子層交織形成一條帶狀區(qū)域，其內(nèi)散在分布有大量浦肯野細(xì)胞、顆粒細(xì)胞以及少量籃狀細(xì)胞；蚓后葉分子層呈垂直走向，浦肯野細(xì)胞胞體較大，樹突較短，顆粒層較厚，髓質(zhì)呈水平走向，含少量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；蚓小葉分子層厚而均勻，呈水平走向，浦肯野細(xì)胞成排分布，間距不等，靠近浦肯野細(xì)胞層分布有籃狀細(xì)胞，顆粒層含有大量顆粒細(xì)胞，髓質(zhì)呈垂直走向，含少量神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，小腦蚓部各葉浦肯野細(xì)胞、籃狀細(xì)胞、顆粒細(xì)胞胞質(zhì)均有NGB和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)，其中，浦肯野細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)著色最強(qiáng)；髓質(zhì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中亦可見少量NGB和HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)(圖6 B5～B7、C5～C7)。NGB和HIF-1α蛋白免疫陽(yáng)性著色均定位于神經(jīng)元胞質(zhì)中，HIF-1α蛋白免疫陽(yáng)性反應(yīng)強(qiáng)度整體高于NGB蛋白。

A. HIF-1α蛋白檢測(cè)結(jié)果；B. HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量 A. Detection results of HIF-1α protein; B. Relative expression of HIF-1α protein圖5 牦牛后腦不同區(qū)域HIF-1α蛋白Western blot檢測(cè)Fig.5 The Western blot results of HIF-1α in different regions of yak’s hindbrain

A. HE染色結(jié)果；B. NGB蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果；C. HIF-1α 蛋白免疫組織化學(xué)結(jié)果；D. 陰性對(duì)照；標(biāo)尺均為50 μm。1～7. 延髓、腦橋、小腦半球皮質(zhì)、小腦半球白質(zhì)、蚓前葉、蚓后葉、蚓小葉。NCB. 神經(jīng)元細(xì)胞；NgC. 膠質(zhì)細(xì)胞；MN. 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元；MS. 髓鞘；Ax. 軸突；BV. 血管；ML. 分子層； PCL. 浦肯野細(xì)胞層；GL. 顆粒層；M. 髓質(zhì)；PjC. 浦肯野細(xì)胞；Bac. 籃狀細(xì)胞；Go. 高爾基細(xì)胞；fa. 纖維狀星形膠質(zhì)細(xì)胞；Dn. 齒狀核；Gc. 顆粒細(xì)胞 A. HE staining results；B. Immunohistochemical results of NGB protein；C. Immunohistochemical results of HIF-1α protein；D. Negative control. The scale is 50 μm. 1-7. Medulla oblongata, pons, cerebellar cortex, corpus medullane, archicerebellum, neocerebellum, palaeocerebellum. NCB. Nerve cell; NgC. Nerve glial cell; MN. Motor neuron; MS. Myelin sheath; Ax. Axon; BV. Blood vessel; ML. Molecular layer; PCL. Purkinje cell layer; GL. Granular layer, M. Medulla; PjC. Purkinje cell; Bac. Basket cell; Go. Golgi cell; fa. Fibrous astrocyte; Dn. Dentate nucleus; Gc. Granule cell圖6 牦牛后腦不同區(qū)域HE及免疫組織化學(xué)結(jié)果Fig.6 The HE and immunohistochemical results in different regions of yak’s hindbrain

3 討 論

腦紅蛋白(NGB)是在脊椎動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)中首次發(fā)現(xiàn)的一類特殊攜氧球蛋白，在清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)，維持腦組織氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)腦組織免受缺氧性損傷中發(fā)揮著重要作用[15]。本研究首次將牦牛后腦部位單獨(dú)作為研究對(duì)象進(jìn)行NGB表達(dá)的檢測(cè)，結(jié)果顯示，NGB基因和蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，且表達(dá)趨勢(shì)總體一致，與Haines等[9]研究結(jié)果類似。其中，小腦蚓前葉NGB基因和蛋白的表達(dá)量均為最高，且顯著高于延髓、腦橋及小腦其他區(qū)域(P<0.05)，表明NGB主要集中分布在蚓前葉，這一方面說明在適應(yīng)高寒低氧過程中蚓前葉需要大量NGB協(xié)助維持其氧化還原穩(wěn)態(tài)，是后腦中代謝最旺盛的區(qū)域，同時(shí)，由于蚓前葉含有大量來自大腦皮質(zhì)感覺運(yùn)動(dòng)區(qū)的傳入神經(jīng)[11]，NGB基因和蛋白的高表達(dá)，提示其可能在牦牛機(jī)體運(yùn)動(dòng)過程中也發(fā)揮著重要的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)作用；另一方面，蚓前葉可以接受來自大腦皮質(zhì)的信息并進(jìn)行處理[11]，NGB在大腦皮質(zhì)和小腦中的表達(dá)量較腦部其他區(qū)域要高[16]，推測(cè)二者在功能銜接過程中，蚓前葉區(qū)域可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。此外，小腦半球皮質(zhì)NGB基因和蛋白的表達(dá)量?jī)H次于蚓前葉，也顯著高于其他區(qū)域(P<0.05)，這與李同方等[16]研究結(jié)果相一致，小腦半球皮質(zhì)通?？赏ㄟ^紅核、齒狀核等核團(tuán)與大腦皮質(zhì)形成雙向性聯(lián)系，在調(diào)節(jié)肌肉張力、肌肉運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮重要功能[11]，推測(cè)此處NGB基因與蛋白的高表達(dá)同樣也是為了保障其正常功能行使過程中有充足的氧氣供應(yīng)。蚓小葉是后腦NGB表達(dá)最低的區(qū)域，說明蚓小葉可能是牦牛后腦耗氧量較低，耐受性較弱的部位。由于NGB除具有攜氧能力外，也具有清除氧化自由基等作用[4]，牦牛后腦各區(qū)域中NGB表達(dá)的差異性可能是其在長(zhǎng)期適應(yīng)低氧環(huán)境過程中，根據(jù)其特定功能發(fā)揮的不同而導(dǎo)致基因選擇性表達(dá)的結(jié)果。

缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子，其表達(dá)變化直接與下游分子激活相關(guān)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，HIF-1α基因和蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，基因與蛋白表達(dá)趨勢(shì)總體一致，說明HIF-1α在牦牛后腦中表達(dá)和執(zhí)行相關(guān)功能時(shí)對(duì)下游分子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控均處在一恒定水平，且對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性。此外，HIF-1α基因和蛋白在蚓前葉表達(dá)量最高，顯著高于延髓、腦橋及小腦其他部位(P<0.05)，這與NGB在后腦的表達(dá)規(guī)律一致。在缺氧應(yīng)激狀態(tài)下，HIF-1α可作為上游的重要分子開關(guān)，激活下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO) 等目的基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管和紅細(xì)胞生成，提高攜氧能力，進(jìn)而使缺氧的組織細(xì)胞保持氧穩(wěn)態(tài)并耐受低氧環(huán)境[18-19]。腦區(qū)NGB的表達(dá)在低氧應(yīng)激性適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要功能，蚓前葉中HIF-1α的高表達(dá)，提示其在適應(yīng)缺氧應(yīng)激過程中，HIF-1α和NGB可能存在某種直接或間接的調(diào)控聯(lián)系，共同對(duì)蚓前葉起保護(hù)作用。同時(shí)，HIF-1α在蚓前葉的高表達(dá)也進(jìn)一步證實(shí)在適應(yīng)高寒低氧過程中，蚓前葉是小腦中功能性最強(qiáng)的組織區(qū)域，這可能也與其不同于其他區(qū)域的神經(jīng)元構(gòu)成有關(guān)。小腦半球皮質(zhì)HIF-1α的表達(dá)結(jié)果與NGB的表達(dá)規(guī)律相近，進(jìn)一步說明此類功能聯(lián)系廣泛、代謝旺盛的區(qū)域，在適應(yīng)低氧環(huán)境過程中需要大量的神經(jīng)保護(hù)因子來協(xié)助其完成正常的生理活動(dòng)。另外，區(qū)別于NGB蛋白，HIF-1α在蚓后葉、小腦半球白質(zhì)、腦橋、延髓等區(qū)域的表達(dá)量非常接近，也提示在牦牛長(zhǎng)期適應(yīng)低氧環(huán)境的過程中，已將此類缺氧應(yīng)激性神經(jīng)保護(hù)因子維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平。

利用HE染色、IHC法對(duì)牦牛后腦不同區(qū)域NGB和HIF-1α蛋白分布特征的研究結(jié)果表明，二者的分布規(guī)律總體一致，這與Giulio等[20]對(duì)人神經(jīng)元中NGB和HIF-1α蛋白分布特征的研究結(jié)果相似。延髓、腦橋中NGB和HIF-1α蛋白主要分布在神經(jīng)元胞質(zhì)，也與李同方等[16]、曹亮[21]和拜占春等[22]對(duì)牦牛神經(jīng)元中NGB或HIF-1α蛋白分布特征的研究結(jié)果相一致。結(jié)合延髓與腦橋?qū)C(jī)體呼吸、運(yùn)動(dòng)、感覺等生理功能的調(diào)節(jié)作用[11]，說明NGB和HIF-1α在這些區(qū)域神經(jīng)元的功能發(fā)揮中擔(dān)負(fù)著重要作用，且對(duì)缺氧具有較高的耐受性。在小腦不同區(qū)域的皮質(zhì)層中，分子層越靠近浦肯野細(xì)胞層的部分，NGB和HIF-1α表達(dá)量越高，說明分子層在功能上與浦肯野細(xì)胞層存在關(guān)聯(lián)，此外，NGB和HIF-1α均主要集中表達(dá)于浦肯野細(xì)胞胞質(zhì)，提示浦肯野細(xì)胞作為小腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中唯一的傳出神經(jīng)元對(duì)缺氧耐受性最高。在小腦不同區(qū)域的髓質(zhì)中，神經(jīng)核團(tuán)有不同程度的NGB和HIF-1α蛋白陽(yáng)性表達(dá)，而軸突未見明顯陽(yáng)性反應(yīng)著色。小腦髓質(zhì)深層分布有神經(jīng)核團(tuán)，細(xì)胞之間通過軸突和胞質(zhì)將整個(gè)小腦的神經(jīng)組成網(wǎng)絡(luò)，軸突不具有合成蛋白質(zhì)的功能，因此，需要將所需蛋白通過胞質(zhì)合成后利用“軸漿運(yùn)輸”運(yùn)送到軸突及其終末[23]，結(jié)合本研究結(jié)果，提示小腦髓質(zhì)區(qū)NGB和HIF-1α蛋白可能存在“軸漿運(yùn)輸”現(xiàn)象，其相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。此外，髓質(zhì)區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞均有少量NGB和HIF-1α表達(dá)，與Dellavalle等[24]和Avivi等[25]的研究結(jié)果類似，考慮NGB和HIF-1α在此類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)可能也與該細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境有關(guān)。

4 結(jié) 論

NGB和HIF-1α基因與蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域均有表達(dá)，且表達(dá)量存在明顯差異，其中，小腦蚓前葉的表達(dá)量最高，蚓小葉的表達(dá)量最低。兩種蛋白主要集中分布在后腦神經(jīng)元胞質(zhì)中，髓質(zhì)區(qū)也見有少量表達(dá)。NGB和HIF-1α蛋白在牦牛后腦不同區(qū)域適應(yīng)低氧環(huán)境過程中均發(fā)揮著重要作用，不同部位的表達(dá)差異，推測(cè)是在其行使特定功能過程中NGB和HIF-1α差異性選擇表達(dá)的結(jié)果，小腦蚓前葉和蚓小葉可能分別是牦牛后腦中對(duì)缺氧耐受度最高和最低的兩個(gè)區(qū)域。