SD大鼠術(shù)后急性疼痛向慢性疼痛轉(zhuǎn)化的差異代謝物分析

王國遼，林 輝，呂俊瑾，劉 鎮(zhèn)，程嬌嬌，唐雷雷，莫睿文，遠立國

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

術(shù)后慢性疼痛是指由手術(shù)引起、繼發(fā)于術(shù)后急性疼痛且持續(xù)時間超過3個月的慢性疼痛[1]。其病因復(fù)雜，機制未明，尚缺乏科學(xué)的干預(yù)手段和有效治療方案，對動物機體康復(fù)不利，導(dǎo)致醫(yī)療資源浪費，還嚴重影響生活質(zhì)量，產(chǎn)生不良后果[2]。為明析術(shù)后慢性疼痛的機制和致病因素，實現(xiàn)動物“疼痛最小化”，獸醫(yī)工作者進行了大量研究。術(shù)后疼痛的實質(zhì)是神經(jīng)遞質(zhì)和受體等物質(zhì)參與的多維神經(jīng)調(diào)節(jié)的結(jié)果，涉及多種物質(zhì)變化[3]，但目前尚不明確究竟何種物質(zhì)在其發(fā)生、傳遞和調(diào)制的過程中起決定作用。嚴重的術(shù)后急性疼痛是術(shù)后慢性疼痛的重要預(yù)測因素[4-5]，因此，甄別引發(fā)術(shù)后急性到慢性疼痛轉(zhuǎn)化這一復(fù)雜過程的關(guān)鍵物質(zhì)，對術(shù)后慢性疼痛機制的深入研究和治療靶點的選擇尤為重要。

近年來，代謝組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用促進了疼痛相關(guān)物質(zhì)研究的發(fā)展[6-8]，因此，本試驗擬用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)探討大鼠術(shù)后急性疼痛和慢性坐骨神經(jīng)緊縮損傷疼痛模型(CCI)的相關(guān)代謝變化，以期篩選出術(shù)后急性向慢性疼痛轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵物質(zhì)及其相關(guān)代謝通路，為術(shù)后慢性疼痛的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(7890B-5977A)；Agilent DB-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；電子測痛儀；L-2-氯苯丙氨酸(上海恒創(chuàng)生物)；HPLC級氯仿、甲醇和正己烷(CNW，德國)；超純水由Milli-Q超純水儀制備，其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及模型構(gòu)建 SPF級SD大鼠65只，體重(250±10)g，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物中心。大鼠隨機分為空白對照組(n=5)、假手術(shù)組(n=30)和手術(shù)組(n=30)。參照Bennett等[9]的方法制作大鼠CCI模型，具體方法：大鼠經(jīng)腹腔注射水合氯醛麻醉后剔除右側(cè)大腿被毛，消毒備皮。平行股骨外側(cè)作長約1 cm切口，撥開皮膚、筋膜和肌肉暴露坐骨神經(jīng)主干。挑起坐骨神經(jīng)主干并結(jié)扎，共4道，間距2 mm，結(jié)扎力度以小腿肌肉輕微顫動為宜，關(guān)閉切口；假手術(shù)組暴露坐骨神經(jīng)但不結(jié)扎，其余操作同手術(shù)組；空白對照組不作任何處理。

1.2.2 機械縮足反射閾值測量 Von Frey電子測痛儀測定大鼠機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)，大鼠于測痛裝置內(nèi)適應(yīng)環(huán)境30 min，將Von Frey刺激大鼠術(shù)側(cè)足底，力度由小到大，直至出現(xiàn)躲避反射即為其MWT值，重復(fù)測定5次，結(jié)果取平均值。

1.2.3 樣本采集與預(yù)處理 術(shù)前和術(shù)后第1、3、5、7、14、21天，大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，斷頭法處死，取下丘腦及胸椎T3～T5段脊髓經(jīng)PBS沖洗后，液氮中保存。稱取樣品于離心管中，加入內(nèi)標L-2-氯苯丙氨酸20 μL和600 μL甲醇水溶液，-80 ℃放置2 min， 研磨；加入120 μL氯仿。冰水浴超聲提取，4 ℃ 靜置。離心10 min(12 000 r·min-1, 4 ℃)，吸取400 μL上清液轉(zhuǎn)入衍生瓶中，揮干樣本。加入甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL進行肟化反應(yīng)，隨后加入80 μL BSTFA衍生試劑和20 μL的正己烷。70 ℃ 孵育60 min，室溫冷卻后用于GC-MS檢測。每10個樣品中插入1個由所有樣本的提取液等體積混合制備的質(zhì)控樣品(QC)。

1.2.4 氣相色譜-質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)分析 GC-MS檢測條件參考文獻[10]的方法并結(jié)合本試驗適當(dāng)更改，質(zhì)譜的離子源溫度為230 ℃，質(zhì)量掃描范圍為50～500 m·z-1；氣相色譜進樣口溫度為260 ℃, 升溫程序見表1。GC-MS的原始數(shù)據(jù)由Anal-ysisBaseFileConverter和MS-DIAL軟件進行預(yù)處理，將手術(shù)組或假手術(shù)組在相同取樣時間的樣品數(shù)據(jù)歸為同一組，即手術(shù)組(D1、D3、D5、D7、D14、D21組)，假手術(shù)組(S1、S3、S5、S7、S14、S21組)；將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件中進行多元統(tǒng)計分析，找到組間差異代謝物，并將篩選出的差異代謝物以KEGG數(shù)據(jù)庫為背景，經(jīng)MBRole進行代謝通路富集分析。

表1 氣相色譜升溫程序

2 結(jié) 果

2.1 機械縮足反射閾值

大鼠機械縮足反射閾值結(jié)果見圖1，結(jié)果顯示，大鼠MWT術(shù)前基礎(chǔ)值比較無顯著差異。模型建立后，手術(shù)組大鼠MWT較術(shù)前顯著降低，隨后逐漸恢復(fù)，直至術(shù)后第21天MWT值仍低于術(shù)前基礎(chǔ)值，差異顯著(P<0.05)，提示CCI模型建模成功。

圖1 大鼠機械縮足反射閾值Fig.1 The mechanical withdrawal threshold of rat

2.2 原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量控制與TIC圖

質(zhì)控樣品的TIC疊加圖及單個代表性樣品TIC圖見圖2，結(jié)果表明，采用的分析方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，分析程序合理。

2.3 數(shù)據(jù)的多變量統(tǒng)計分析

樣本PCA模型得分圖如圖3所示，QC樣本緊密分布，表明試驗具有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。為更直觀觀察組間差異，進一步建立每兩分析組間共11組的PCA、PLS-DA、OPLS-DA模型。PCA得分圖表明，組間分離趨勢明顯；PLS-DA模型解釋能力參數(shù)R2Y(0.842～0.995)，預(yù)測能力參數(shù)Q2(0.584～0.937)；OPLS-DA模型參數(shù)R2Y(0.842～0.991)，Q2(0.474～0.805)；在建立的OPLS-DA模型下進行200次響應(yīng)排序檢驗考察模型的質(zhì)量，各組模型預(yù)測能力參數(shù)Q2均在-0.925～-0.156；除D21/S21組的PLS-DA模型參數(shù)(R2X=0.491，R2Y=0.842，Q2=0.181)外，模型穩(wěn)定性、預(yù)測能力均符合分析要求，模型未出現(xiàn)過擬合。以手術(shù)組D3和D5組兩組樣本的分析為例，見圖4。

2.4 差異代謝物的篩選

經(jīng)多元統(tǒng)計分析、T檢驗和變異倍數(shù)分析(VIP>1，P<0.05，∣log2FC∣≥2)，從224種代謝物中篩選出35種代謝物作為候選差異代謝物，其中，24個 顯著下調(diào)，9個顯著上調(diào)，見表2。為表征候選差異代謝物間的聚落關(guān)系，對代謝物的定量信息進行層次聚類，見圖5；在候選差異代謝物中，N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、葡萄糖、β-丙氨酸、3-羥基丁酸與疼痛密切相關(guān)，可能是術(shù)后急性疼痛向慢性疼痛轉(zhuǎn)化的潛在生物標志物，為表征代謝物在不同時間的變化趨勢，對6種代謝物的平均表達量繪制箱線圖，見圖6。

A. 質(zhì)控樣品TIC圖；B. 手術(shù)組大鼠樣品TIC圖 A. TIC of quality control samples; B. TIC of surgical group sample圖2 樣品的總離子流色譜圖 Fig.2 Total ions chromatogram

橫坐標表示第1主成分，即PC1，用t[1]表示；縱坐標表示第2主成分，即PC2，用t[2]表示 X-axis show the first principal component, t[1], Y-axis show the second principal component, t[2]圖3 所有分析樣本PCA得分圖Fig.3 PCA score plots of all sample group

2.5 代謝通路富集分析

將差異代謝物映射到KEGG數(shù)據(jù)庫中，通過 MBRole通路分析功能進行通路富集分析，結(jié)果35種候選差異代謝物參與了45個代謝途徑。代謝通路的P值表示該代謝通路富集的顯著性，以10為底取對數(shù)繪制代謝通路富集圖，P值越小，-lg(P-value)越大；圖中紅線和藍線分別示意P值為0.01和0.05(圖7)。

3 討 論

本試驗成功建立了大鼠術(shù)后急性疼痛和慢性坐骨神經(jīng)緊縮損傷疼痛模型，并應(yīng)用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)比較手術(shù)組與對照組、手術(shù)組D1、D3、D5、D7、D14、D21各組間的差異代謝物，鑒定出包括N-乙酰天冬氨酸(NAA)、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羥基丁酸、葡萄糖等35種差異代謝物及45條潛在代謝通路可能參與了術(shù)后急性向慢性疼痛的轉(zhuǎn)化。

A、B、C分別代表樣本的PCA、PLS-DA、OPLS-DA得分圖；方形代表D3組的5個樣本，三角形代表D5組的5個樣本；得分圖的橫坐標表示第1主成分，即PC1，用t[1]表示；縱坐標表示第2主成分，即PC2，用t[2]表示；D是OPLS-DA模型的響應(yīng)排序檢驗，縱坐標表示R2和Q2的取值 A, B, C show the sample score plots of PCA, PLS-DA, OPLS-DA, square mean 5 samples in the D3 group and triangles mean 5 samples in the D5 group of surgical group; X-axis show the first principal component, t[1], Y-axis show the second principal component, t[2]. D mean the permutation test for OPLS-DA model, Y-axis mean the value of R2 and Q2圖4 兩組樣本得分圖Fig.4 Sample score plots of two group

圖5 各組分析樣本差異代謝物熱圖Fig.5 Heatmap of differential metabolites in each sample group

A. N-乙酰天冬氨酸; B. β-丙氨酸; C. 3-羥基丁酸; D. 天冬氨酸; E. 葡萄糖; F. 泛酸 A. N-acetylaspartic acid; B. Beta-alanine; C. 3-hydroxybutyric acid; D. Aspartate; E. Glucose; F. Pantothenic acid圖6 代謝物平均表達量箱線圖Fig.6 Box plots of average metabolites expression

A.D 1組vs D 3組；B. D 3組vs D 5組；C. D 5組vs D 7組；D. D 7組vs D 14組；E. D14組vs D21組 A.Group D 1 vs group D 3; B. Group D 3 vs group D 5; C. Group D 5 vs group D 7; D. Group D 7 vs group D 14; E. Group D 14 vs group D 21圖7 代謝通路富集圖Fig.7 Enrichment map of metabolic pathways

N-乙酰天冬氨酸是衡量神經(jīng)細胞破壞程度的標志物[11]，濃度降低提示神經(jīng)元丟失、結(jié)構(gòu)破壞或功能異常[12-13]。應(yīng)用核磁共振波譜技術(shù)(MRS)，發(fā)現(xiàn)慢性疼痛患者經(jīng)顱直流電刺激治療后，疼痛程度減輕，且腦代謝物中NAA濃度較治療前顯著升高[14-15]。進一步研究發(fā)現(xiàn)NAA的濃度與疼痛的強度呈負相關(guān)[16]，本試驗中，NAA濃度在術(shù)后D1vsD3組和D14vsD21組中表達下調(diào)，與這些研究結(jié)果相同，其平均表達量與MWT值變化趨勢一致，說明NAA在急性向慢性疼痛轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮了作用。

泛酸以輔酶A的生物活性形式揮發(fā)其功能，參與含碳架物質(zhì)的能量代謝[17]，其表達失調(diào)表明機體能量失衡。神經(jīng)損傷后釋放大量ATP，作用于P2X3受體參與傷害性信息的傳遞和痛覺敏化[18-19]。本試驗中泛酸濃度下調(diào)，其代謝紊亂引起的能量失衡可能導(dǎo)致信號傳導(dǎo)異?；蚣毎麅?nèi)外離子交換障礙，從而在術(shù)后急性疼痛向慢性疼痛轉(zhuǎn)化過程發(fā)揮作用。輔酶A也是機體應(yīng)激反應(yīng)重要觀測指標皮質(zhì)醇的必需輔助因子[20]，傷害性信號促使下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸興奮增強，皮質(zhì)醇等應(yīng)激激素水平升高，引起術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)，進而導(dǎo)致糖代謝紊亂[21]。葡萄糖是腦細胞能量代謝的最主要的直接來源，本試驗中葡萄糖濃度下調(diào)，可能是手術(shù)傷害性刺激引起神經(jīng)元的活性增強、代謝旺盛，從而參與疼痛的形成。

表2 主要差異代謝物及其相關(guān)代謝通路

(轉(zhuǎn)下頁 Carried forward)

β-丙氨酸為不參與蛋白質(zhì)合成的氨基酸，與主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)甘氨酸和γ-氨基丁酸結(jié)構(gòu)相似，能夠激活甘氨酸和γ-氨基丁酸受體，進而影響突觸的可塑性[22-23]。傷害感受器可塑性變化在急性疼痛向慢性疼痛轉(zhuǎn)化中具有重要作用[24]。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸代謝紊亂，說明其可能通過調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性變化從而參與了術(shù)后急性向慢性疼痛轉(zhuǎn)變的過程。

天冬氨酸是重要的興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，參與維持神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，濃度過高會介導(dǎo)神經(jīng)元的死亡。本試驗天冬氨酸濃度升高，提示手術(shù)引起的傷害性刺激傳入脊髓背角使神經(jīng)突觸和膠質(zhì)細胞釋放大量的天冬氨酸[25]，天冬氨酸等興奮性氨基酸過度釋放會導(dǎo)致NMDA受體上調(diào)，使突觸的可塑性出現(xiàn)長時程易化，造成中樞敏化[26]，從而參與了術(shù)后慢性疼痛的形成。

3-羥基丁酸具有多種生物活性，可以為神經(jīng)膠質(zhì)細胞提供能量，并通過抗氧化、線粒體保護和增加腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達等方式對神經(jīng)起到保護作用[27]，同時還可以抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡。胡華輝等[28]發(fā)現(xiàn)3-羥基丁酸在急性脊髓損傷模型大鼠脊髓中濃度降低，與本試驗中3-羥基丁酸在手術(shù)組D7vsD14組中表達下調(diào)相似，說明其參與了疼痛形成過程中神經(jīng)保護與修復(fù)的過程。3-羥基丁酸還可以作為表觀遺傳修飾調(diào)控因子發(fā)揮功能，預(yù)示其可能在疼痛的表觀遺傳調(diào)控中發(fā)揮功能[29-30]。

4 結(jié) 論

使用GC-MS代謝組學(xué)技術(shù)對大鼠術(shù)后急性疼痛和慢性坐骨神經(jīng)緊縮損傷疼痛模型的下丘腦和脊髓代謝物進行初步研究，篩選出N-乙酰天冬氨酸、泛酸、天冬氨酸、β-丙氨酸、3-羥基丁酸、葡萄糖等35種物質(zhì)可能與術(shù)后急性疼痛向慢性疼痛轉(zhuǎn)變密切相關(guān)。但由于試驗條件和試驗設(shè)計的限制，這些差異代謝物在術(shù)后疼痛中的作用及其具體機制仍有待進一步深入研究。