馬香苓口服液中白術內(nèi)酯Ⅲ含量測定方法的建立

楊洪早,李錦宇,王東升*,張世棟,董書偉,閆寶琪,那立冬,吳春麗,鄧 俊,吳冠連,陳新麗,趙留濤,朱 凱, 梁永喜,嚴作廷,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050; 2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅蘭州 730050;3.鄭州大學藥學院，河南鄭州 450001; 4.甘肅農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070)

馬香苓口服液是由廣藿香、白術、馬齒莧等制成的純中藥口服液，臨床主要用于治療病毒引起的仔豬腹瀉。研究表明，該制劑工藝穩(wěn)定可行，無刺激性，治療仔豬腹瀉總有效率達96%，治愈率達90%。為進一步控制該制劑的質量，便于臨床藥效學研究，故對該方劑做其定量的方法研究[1-2]。白術具有健脾益氣，燥濕利水，止汗，安胎之功效；用于脾虛食少，腹脹泄瀉，痰飲眩悸，水腫，自汗，胎動不安[3]。在馬香苓口服液中作為臣藥，它的主要成分作用為白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術酮等，該類成分具有調節(jié)胃腸道功能和促進營養(yǎng)物質吸收的作用，也是控制白術藥材質量的主要指標之一[4]。據(jù)報道[5]，其白術內(nèi)酯Ⅲ含量可以作為評定中藥散劑、口服液水提工藝等指標。因此，采用高效液相色譜法(HPLC)測定本制劑中白術內(nèi)酯Ⅲ的含量并做方法學研究，可以為該制劑的質量標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 白術內(nèi)酯Ⅲ(含量99.9%，20 mg，批號：11978-201501),中國食品藥品檢定研究院產(chǎn)品;馬香苓口服液，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所研制(批號20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721);甲醇(色譜純，規(guī)格1 L，批號20161006)，天津川普偉業(yè)科技有限公司產(chǎn)品;水為超純水，石油醚(60℃～90℃，批號20160901)煙臺市雙雙化工有限公司產(chǎn)品;其余有機試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備 DIONEX UItiMate 3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；NewClassic MS 電子天平，梅特勒-托利多上海有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司產(chǎn)品；KQ 3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6 mm×250 mm，美國Agilent Technologies)，以水和甲醇為流動相梯度洗脫(表1)，流速0.8 mL/min，柱溫25℃，檢測波長223 nm，進樣量30 μL。

1.2 方法

溶液制備：以甲醇和500 mL/L甲醇水溶液為空白溶液。精密稱取白術內(nèi)酯Ⅲ1.46 mg，置2 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，密封，搖勻，即得濃度為0.73 mg/mL的對照品儲備液。精密移取白術內(nèi)酯Ⅲ標準儲備液1 mL，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成濃度為0.073 mg/mL，作為白術內(nèi)酯Ⅲ對照溶液。量取中藥口服液25 mL于125 mL分液漏斗，加石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次，每次40 mL，收集上層石油醚有機溶液，水浴揮干(水浴鍋溫度90℃)，殘渣加500 mL/L甲醇水溶液使其溶解，并定容至10 mL容量瓶，即得供試品溶液。取按處方比例并以同樣制備工藝的缺白術的陰性對照口服液，按供試品溶液制備法制得陰性對照溶液。

表1 流動相梯度

2 結果

2.1 專屬性試驗

取空白、對照品、供試品和陰性對照溶液，過0.22 μm有機微孔濾頭于1 mL進樣瓶中，密封，參照文獻[2]并按色譜條件自動進樣測定，每個樣品進樣2次，記錄色譜圖(圖1)，結果白術內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液理論板數(shù)為13327；在與白術內(nèi)酯Ⅲ對照品溶液色譜峰對應的位置上，供試品(26.063 min)與其對照品(26.419 min)保留時間一致，其理論塔板數(shù)為21420，且與其他組分分離度大于1.5；陰性對照溶液在對照品與供試液相應的保留時間內(nèi)未檢出色譜峰，表明樣品中其他成分不干擾白術內(nèi)酯Ⅲ的測定。

2.2 線性關系考察

精密量取白術內(nèi)酯Ⅲ對照液1 mL于2 mL容量瓶，加色譜甲醇定容至刻度，依次進行倍比稀釋得系列標準溶液，其濃度分別為73.00、36.50、18.25、9.13、4.56、2.28μg/mL，按色譜條件自動進樣上述系列溶液各30 μL，每個濃度進樣2次，記錄色譜圖并測定峰面積。以白術內(nèi)酯Ⅲ峰面積(y)縱坐標，檢測質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標進行線性回歸(圖2)，得回歸方程y=1.356 7x+0.857 6，R2=0.992，結果表明，白術內(nèi)酯Ⅲ檢測質量濃度在0.57 μg/mL～73.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.3 精密度試驗

精密量取對照品溶液，按色譜條件自動進樣30 μL，連續(xù)進針6次，記錄色譜圖，測定峰面積。計算結果保留時間RSD=3.04%，相對峰面積RSD=2.00%，表明儀器精密度良好。

圖1 專屬性試驗(高效液相色譜圖)

2.4 重復性試驗

取同一批中藥口服液，按供試品溶液制備法平行制備6份。按色譜條件進樣30 μL，每個樣品連續(xù)進樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。計算結果得相對峰面積RSD=6.00%，表明本方法重復性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取同一批中藥口服液(批號：20160721)，按供試品溶液制備法制備，考察其日內(nèi)精密度與日間精密度。分別于0、2、4、8、12、16、24 h內(nèi)及在0、12、24、36、48、60、72 h之內(nèi)分別精密量取供試液，按照色譜條件進樣30 μL，每個樣品進樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。計算結果得24 h內(nèi)平均含量2.27 μg/mL，相對平均含量RSD=8.14%，相對峰面積RSD=6.00%；72 h內(nèi)平均含量2.20 μg/mL，相對平均含量RSD=9.54%，相對峰面積RSD=8.58%，表明本方法在72 h內(nèi)重復性、穩(wěn)定性良好。

圖2 白術內(nèi)酯Ⅲ標準曲線圖

2.6 加樣回收率試驗

精密稱取白術內(nèi)酯Ⅲ 5.98 mg于5 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，得其濃度為1.196 mg/mL白術內(nèi)酯Ⅲ對照液，根據(jù)前期研究算出供試液含量，特此進行配制高、中、低3個不同標準品濃度作為加樣標液，分別取0.6、0.5、0.4 mL于10 mL容量瓶，加甲醇稀釋并定容至刻度，得其加樣標液濃度分別為71.76、59.8、47.84 μg/mL。

精密量取同批次(批號：20160721)中藥口服液置于分液漏斗中，分為9份，每份樣品液為25 mL，分為高中低3組，每3份口服液為1組，各分別精密加入1 mL白術內(nèi)酯Ⅲ對照液于分液漏斗中，混勻，按供試品溶液制備法制備，即得加樣回收供試液。按色譜條件進樣，每個樣品進樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積，并計算含量與回收率。其平均回收率為98.04%，RSD=11.89%，表明回收相對較好(表2、表3)。計算公式為：測得加入量=測得總量-中藥口服液本身含有量，回收率=測得加入量/實際加入量×100%

表2 加樣標液高、中、低濃度與未加標樣馬香苓口服液20160721批供試液結果

2.7 耐用性試驗

研究的變動因素主要有：柱溫分別為20℃、25℃、30℃，流速0.8 mL/min，色譜柱為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；流速分別為0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min，柱溫25℃，色譜柱為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)；色譜柱分別為ZORBAX SB-C18(5 μm×4.6×250 mm,Agilent Technologies)、PhenomenexGemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)、Vydac 218 TP C18(5 μm×250 mm×4.60 mm， Grace)，柱溫25℃，流速0.8 mL/min。

按以上變量色譜條件進樣，其中白術內(nèi)酯Ⅲ對照液(73μg/mL)進樣10 μL，20160721批供試液進樣30 μL，每個樣品進樣2次，記錄色譜圖，測定峰面積。當柱溫改變，其他條件不變時，相對保留時間RSD=0.44%，相對含量RSD=4.15%；當流速改變，其他條件不變時，相對保留時間RSD=1.25%，相對含量RSD=3.49%；當換用不同型號色譜柱，其他條件不變時，相對保留時間RSD=0.64%，相對含量RSD=8.20%。從相對RSD值來看，不同型號色譜柱對保留時間差異最小，對其含量變化值相對較大；柱溫和流速的改變對其保留時間和含量變化差異均較小(表4～表6)。

因此，在測定白術內(nèi)酯Ⅲ含量時柱溫應保持在25℃，流速保持在0.8 mL/min，選用Phenomenex Gemini C18 110A(5 μm×250 mm×4.60 mm)柱子進行測定，其所得含量相對較高、穩(wěn)定且峰形較好，進樣重復性好。

2.8 10批樣品含量測定

分別取10批樣品(批號：20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721、20160724)按供試液法每批次各平行制備2份供試液，按色譜條件自動進樣測定，其對照液白術內(nèi)酯Ⅲ(濃度71.76 μg/mL)分別進樣30、20、10 μL，且每個進樣量分別進樣2次；每份供試液各進樣2針，記錄色譜圖和峰面積，并計算含量以及RSD值(表7)，計算得馬香苓口服液中白術內(nèi)酯Ⅲ不同進樣量含量分別為2.15、2.58、2.54，平均含量為2.43 μg/mL，相對含量RSD=9.82%?？紤]到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失和測量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暫定馬香苓口服液中白術藥材按白術內(nèi)酯Ⅲ計不少于1.94 μg/mL。

表3 馬香苓口服液中白術內(nèi)酯Ⅲ加樣回收率試驗結果(n=9)

表4 柱溫耐用性考察

3 討論

3.1 待測組分選擇

白術的內(nèi)酯類成分具有抗炎、增強免疫、利尿等作用，而且還可以調理胃腸道和促進營養(yǎng)物質的吸收，其中白術內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的藥理作用較為明顯，也是發(fā)揮白術健脾益氣、燥濕利水的功效之一[6]。在炮制過程中蒼術酮被氧化，其產(chǎn)物是雙白術內(nèi)酯、白術內(nèi)酯Ⅱ和白術內(nèi)酯Ⅲ，同時白術內(nèi)酯Ⅲ在經(jīng)高溫加熱過程中會生成白術內(nèi)酯Ⅱ[7-8]；從氧化反應機制來看，蒼術酮易與水發(fā)生加成反應，生成半縮醛羥基，而水又導致半縮醛羥基開環(huán)生成羰基，羰基進一步被氧化生成羧基，雜化軌道平面兩側容易被羥基進攻羧基，羥基并與羧基進行分子內(nèi)脫水反應，可生成白術內(nèi)酯Ⅰ和表白術內(nèi)酯Ⅰ，而白術內(nèi)酯Ⅰ在7位上與碳相連的氫相比較為活躍，易被羥基取代而生成白術內(nèi)酯Ⅲ[9]。白術內(nèi)酯Ⅲ的結構較其穩(wěn)定，更有利于含量測定。

表5 流速耐用性考察(0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min)

表6 不同色譜柱耐用性考察

表7 馬香苓口服液10批樣品含量測定結果(n=2)

3.2 供試液前處理

按照萃取溶劑的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有機溶劑，經(jīng)過與標準品色譜法相比較，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供試液峰形較好，分離度高，但其前面有一小雜峰，后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作為復級溶液，考慮到白術內(nèi)酯類成分的穩(wěn)定性，并同時選擇了考察柱溫的最佳條件(20℃、30℃、35℃)，結果表明，在柱溫為25℃、選用500 mL/L甲醇水溶液作為復級溶液，所出的峰形分離度高，峰形對稱且含量較高。有關提取次數(shù)優(yōu)選，在其他相同條件下，用石油醚(60℃～90℃)振搖提取3～5次，結果表明，用供試品提取3次與4、5次有較大差異，而4、5次時白術內(nèi)酯Ⅲ含量無明顯差異，故選擇用石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次[10-11]。

3.3 色譜條件選擇

本制劑通過單因素試驗，對其柱子型號、柱溫、流速、流動相比例進行優(yōu)化和系統(tǒng)適用性試驗以及波長的選擇，用紫外分光光度計測量白術內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收波長，結果在223 nm處吸收峰最強[12-13]；在流動相選擇上參考其他學者研究，用標準品白術內(nèi)酯Ⅲ進行判定等度條件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情況，試驗表明用甲醇-水(60∶40)對其標準品的峰更好，含量更高，同樣條件下進樣測定供試液，發(fā)現(xiàn)其分離度達不到《中國獸藥典》的要求，雜峰較多，故進行了梯度洗脫，考慮中藥成分復雜多樣，會影響色譜柱的質量以及下一針進樣的出峰情況，故在樣品目標峰等完全出完過后使用了純甲醇進行沖洗色譜柱10 min，然后用15 min再平衡到流動相的初始比例以方便下一針進樣分析，最終確定了流動相條件[14-15]。在其他條件不變情況下，柱溫的改變對其供試品溶液中白術內(nèi)酯Ⅲ含量的相對標準偏差為4.15%，且柱溫過高，易導致峰形不對稱，有拖尾現(xiàn)象，綜合考慮，最終選用柱溫為25℃；在柱溫25℃等其他條件不變情況下，改變流速0.8 mL/min±0.2 mL/min，發(fā)現(xiàn)供試品溶液中白術內(nèi)酯Ⅲ含量相對標準偏差為3.49%，說明改變流速對樣品中白術內(nèi)酯Ⅲ的測定無影響，對其樣品出峰時間早晚有一定影響，但對峰的對稱性、分離度無影響[16]，故最終確定流速為0.8 mL/min。

試驗證明以流動相甲醇-水(體積比)進行梯度洗脫(甲醇60→65、水40→35運行30 min，甲醇65→100、水35→0運行2 min，甲醇100、水0運行10 min，甲醇100→60、水0→4運行3 min，甲醇60、水40運行15 min)、檢測波長223 nm、柱溫25℃、流速0.8 mL/min的色譜條件對白術內(nèi)酯Ⅲ的測定具有較強的專屬性，能達到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對稱、陰性對照無干擾、大大縮短分析時間，便于作為含量測定和方法學研究。

建立的HPLC方法測定白術內(nèi)酯Ⅲ含量的線性關系良好，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的平均峰面積RSD分別為2.00%、6.00%和8.58%；平均加樣回收率為98.04%，RSD=11.89%，其回收率相對良好，進行10批樣品的含量測定，暫定馬香苓口服液中白術藥材按白術內(nèi)酯Ⅲ計不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征圖譜專屬性強、準確可行、簡便，可快速用于鑒別馬香苓口服液中白術內(nèi)酯Ⅲ以及其含量，可有效地用于該制劑的質量控制，同時該方法還可以為進一步加強含白術類化合物的制劑質量控制提供參考，為申報新獸藥質量標準提供一定的數(shù)據(jù)支撐。