乳桿菌抑制幽門螺桿菌感染的分子機制

于婷，張麗紅，翟玉香，王莉莉，董全江，欒淑芳

（1.青島大學附屬青島市市立醫(yī)院 中心實驗室，山東 青島266071；2.煙臺毓璜頂醫(yī)院消化內(nèi)科，山東 煙臺264000）

乳桿菌為革蘭陽性、兼性厭氧的桿狀細菌，能發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸。乳桿菌屬由兩百多個種和亞種組成，在不同環(huán)境中廣泛分布，如發(fā)酵食品、植物表面、口腔和糞便等[1]。其也是人類消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)中微生物群落的重要組成部分[2]。幽門螺桿菌（helicobacter pylori, Hp）是高感染率的致病菌，全球約一半的人口被感染，可定植在人類胃黏膜中，導致上消化道疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤和胃癌[3]。臨床通常采用基于抗生素的標準三聯(lián)（質(zhì)子泵抑制劑+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林）或四聯(lián)（鉍劑+質(zhì)子泵抑制劑+克拉霉素+甲硝唑或阿莫西林）療法根除。

但近年來由于抗生素的廣泛使用，幽門螺桿菌耐藥率上升，導致Hp 根除率持續(xù)下降（從92.2%下降到80.2%）。特別是克拉霉素耐藥率在日本和意大利已升至約30%，土耳其約為40%，中國約為50%[4]。另外，甲硝唑耐藥率也一直呈上升趨勢。因此，亟需新的治療方案達到Hp 理想根除率。作為共生菌，乳桿菌通常被認為是安全、非致病性的。多種乳桿菌被認為有益生作用，能夠調(diào)節(jié)胃腸道菌群、改善胃腸道功能，包括嗜酸乳桿菌、加氏乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、植物乳桿菌和短乳桿菌等。乳桿菌作為益生菌的特性是其對酸性環(huán)境的耐受性強，對胃黏膜的黏附能力好；另外，它們對宿主有益，能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，對上皮細胞起到屏障保護和免疫調(diào)節(jié)的作用[5]。因此，乳桿菌成為當前預防和抑制Hp 感染的研究熱點。本文通過綜述乳桿菌在不同臨床研究中抗Hp 效果以及抑制Hp 感染的分子機制，以期篩選出高效抗Hp 的乳桿菌菌株，提高乳桿菌聯(lián)合抗生素根除Hp 的臨床療效。

1 不同乳桿菌菌株抑制Hp的作用

由于傳統(tǒng)抗生素對Hp 根除率逐漸降低，益生菌成為治療方案中的重要補充。臨床多以嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和加氏乳桿菌等乳桿菌為研究熱點。ZIEMNIAK[6]涉及641 例Hp 感染患者的研究中，采用嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的三聯(lián)療法組對Hp 的根除率提高8.4%。另一項研究中將我國100 例Hp 感染伴有消化道癥狀的兒童作為治療組，采用標準三聯(lián)療法（兒童每日給藥劑量為質(zhì)子泵抑制劑0.6～0.8 mg/kg，克拉霉素30～50 mg/kg，阿莫西林30～50 mg/kg 或甲硝唑15～20 mg/kg）并補充益生菌（嗜酸乳桿菌La5 和乳雙歧桿菌）2 周，然后再單獨補充益生菌4 周，結(jié)果提升，治療組相比對照組根除率顯著升高[7]。一項涉及234 例Hp 陽性的胃炎或消化不良患者的隨機開放性研究發(fā)現(xiàn)，與標準療法（奧美拉唑20 mg，克拉霉素500 mg，阿莫西林1 000 mg 連續(xù)給藥7 d）相比，乳桿菌預處理2 周或抗生素治療后繼續(xù)服用乳桿菌，Hp 根除率均提高約20%[8]。SHEU 等[9]對138 例前期Hp 根除失敗的十二指腸潰瘍或胃炎患者采用抗生素四聯(lián)療法（阿莫西林1 g，甲硝唑500 mg，奧美拉唑20 mg、2 次/d，枸櫞酸鉍120mg、3 次/d）7 d 并聯(lián)合益生菌（嗜酸乳桿菌La5 和乳雙歧桿菌）治療4 周后，通過意向性治療分析，Hp 的根除率從71.7%提高到85.0%；通過遵循研究方案分析，根除率從76.6%升高到90.8%。在DEGUCHI 等[10]對229 例Hp 感染患者的隨機對照研究中發(fā)現(xiàn)，標準三聯(lián)療法（雷貝拉唑10 mg，阿莫西林750 mg，克拉霉素200 mg，2 次/d，連續(xù)7 d）聯(lián)合加氏乳桿菌OLL2716 片劑（連續(xù)服用4 周）治療組的Hp 根除率顯著高于標準三聯(lián)療法組。此外，一項評估益生菌抑制Hp 感染的有效性和安全性的Meta 分析研究發(fā)現(xiàn)，在使用抗生素治療前和整個治療過程中補充益生菌能夠提高Hp 藥物根除率并減少副作用，補充益生菌2周以上，藥物療效更好[11]。然而，并非所有的臨床研究結(jié)論一致，MEDEIROS 等[12]招募62 例患有消化潰瘍的Hp 陽性患者，比較抗生素三聯(lián)治療組（埃索美拉唑20 mg，阿莫西林1 000 mg，克拉霉素500 mg，連續(xù)治療8 d）和嗜酸乳桿菌聯(lián)合抗生素治療組之間Hp 根除率有無差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加嗜酸乳桿菌并沒有提高抗生素根除Hp 的療效。另一項107 例Hp 感染的消化潰瘍和功能消化不良的巴西人群研究中，患者使用益生菌（嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、雙歧桿菌和糞鏈球菌）聯(lián)合抗生素治療Hp，治療7 d、30 d 后隨訪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組之間Hp 的根除率沒有明顯差異[13]。造成研究差異的原因可能是受試菌株不一致。

研究證實，嗜酸乳桿菌La5、鼠李糖乳桿菌和加氏乳桿菌OLL2716 等乳桿菌聯(lián)合抗生素三聯(lián)或四聯(lián)療法能提高Hp 根除率。然而，仍有10%～15%患者Hp 根除失敗。各臨床研究中Hp 根除效果有差異，可能與乳桿菌菌株特異性、受試者數(shù)量、地理區(qū)域、給藥時間不同有關。

2 乳桿菌抗Hp的分子機制

乳桿菌對Hp 具有抑制作用已得到較多研究的證實，但其潛在的作用機制仍需深入研究。目前認為乳桿菌抑制Hp 感染的可能分子機制包括細菌素的直接殺菌、黏附抑制、胃腸道微生物群調(diào)節(jié)和炎癥抑制等。

2.1 乳桿菌產(chǎn)生細菌素殺滅Hp

細菌素是由細菌（包括乳桿菌）合成的一種30～60 個氨基酸組成的、耐熱穩(wěn)定的抗菌肽或肽毒素，對同一種屬（窄譜）或不同種屬（寬譜）的細菌具有殺傷活性[14]。根據(jù)細菌素生化特性分為3 類：Class Ⅰ細菌素（羊毛硫抗生素）以翻譯后修飾為特征，如Nisin、Lactocin 和Mersacidin。ClassⅡ細菌素是分子量<10 kDa、未經(jīng)修飾、疏水的一類小分子肽，它分為Class Ⅱa 和Class Ⅱb 兩個亞類。Class Ⅱa 具有抗李斯特菌活性，如Pediocin Pa1和Leucocin A；Class IIb 需2 個互補肽協(xié)同作用發(fā)揮抗菌活性，如Plantaricin A 和Enterocin X。Class Ⅲ細菌素是分子量>30 kDa、耐熱的大分子肽，如Lysostaphin 和Helveticin J[15]。JUNG 等[16]根據(jù)結(jié)構(gòu)和作用機制不同，將細菌素分為A 類和B 類。A 類細菌素為螺旋結(jié)構(gòu)，在細菌膜上形成電位依賴性空隙；B 類細菌素為球形結(jié)構(gòu)，抑制細菌細胞壁形成。細菌素的產(chǎn)生在細菌競爭中發(fā)揮重要作用，使生產(chǎn)菌株具有生存優(yōu)勢。研究證明乳桿菌在上清液中產(chǎn)生的細菌素對大腸桿菌、傷寒沙門氏菌及白假絲酵母菌均有抑制作用[17-19]。ZHAO 等[20]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZDY2013 的培養(yǎng)上清液與對照組（肉湯培養(yǎng)基）相比能夠顯著抑制Hp 生長活性。URRUTIA-BACA 等[21]使用羅伊氏乳桿菌ATCC 55730 產(chǎn)生的細菌素Reuterin 與Hp 進行體外共培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)其對Hp 有明顯的生長抑制作用，隨著Reuterin 濃度的增加，細菌殺滅時間呈濃度依賴性下降。此外，細菌素Reuterin 顯著下調(diào)Hp 毒力基因（flaA、vacA和luxS）的表達。這表明細菌素的拮抗作用可能是通過對靶細菌的直接殺滅實現(xiàn)的。細菌素能夠破壞Hp 的生物膜，誘導生物膜形態(tài)發(fā)生改變，在膜上成孔，通過質(zhì)子動力的耗散以及鉀和氨基酸的流出使細菌死亡[22]。目前已發(fā)現(xiàn)的能產(chǎn)細菌素的乳桿菌包括植物乳桿菌、加氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌等20 余種，產(chǎn)生的細菌素包括Plantaricin、Bactofencin、Gassereccin、Fermencin 和Reutericin 等。另外，細菌素干擾細菌脫氧核糖核酸、核糖核酸和蛋白質(zhì)代謝，抑制細菌繁殖，如MccB17 細菌素是DNA 促旋酶抑制劑，分子量<5 kD，它能抑制致病菌DNA 復制，促使細菌發(fā)生應急反應；MccC7/C51 細菌素能在tRNA 合成酶上起作用，是蛋白翻譯抑制劑，干擾細菌的蛋白質(zhì)合成過程[23]。不同菌株產(chǎn)生的細菌素存在株間差異，因此需要研究篩選高效穩(wěn)定拮抗Hp 的細菌素。

此外，乳桿菌釋放有機酸（如乳酸、甲酸和乙酸等短鏈脂肪酸）抑制Hp 生長，研究發(fā)現(xiàn)乙酸和乳酸對Hp 的生長抑制作用呈劑量依賴性，其中乳酸的抑制作用更強，不僅能使Hp 產(chǎn)生球型變、抑制分裂繁殖，還能抑制其脲酶活性[24-25]。

2.2 乳桿菌對Hp的黏附抑制作用

Hp 感染的分子機制研究認為，Hp 在胃黏膜表面黏附是其致病過程中的重要一步。體外實驗證實，乳桿菌能夠抑制Hp 對胃腺癌細胞系AGS 細胞的黏附，這種抑制作用可能與乳桿菌抑制Hp 黏附基因表達、生成黏蛋白和競爭黏附位點有關。為了研究乳桿菌對宿主細胞黏附性的影響，GARCIACASTILLO 等[26]從健康人胃組織中分離到一株乳桿菌（鼠李糖乳桿菌UCO-25A），分別用該乳桿菌預處理AGS 細胞，再用Hp 感染、用該乳桿菌和Hp 在AGS 細胞中共孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌預處理和共孵育的AGS 細胞中，Hp 黏附數(shù)量較對照組顯著減少，這表明乳桿菌具有抑制Hp 黏附AGS 細胞的能力。KLERK 等[27]從28 株乳桿菌中篩選到3 株（加氏乳桿菌Kx 110 A1、加氏乳桿菌Kx 126 A5 和短乳桿菌ATCC 14869）能抑制Hp黏附AGS細胞的菌株，進一步研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)具有抑制Hp作用的乳桿菌處理后，Hp 的sabA黏附基因表達下降，故乳桿菌可能是通過下調(diào)Hp 相關基因的表達抑制其黏附。另外，ZUO 等[28]構(gòu)建加氏乳桿菌srtA 突變體，研究黏附功能相關的Sortase 依賴蛋白的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Sortase A 蛋白是影響加氏乳桿菌Kx110A1 菌株表面性質(zhì)的重要因素，srtA 突變體菌株失去了黏附胃上皮細胞的能力，因此喪失對致病菌的黏附抑制作用，無法防止Hp 定植。

2.3 乳桿菌可能通過改變胃腸道細菌菌群拮抗Hp

LI 等[29]對Hp 相關的萎縮性胃炎、腸化生、胃癌患者及Hp 陰性健康者的胃組織進行菌群研究，發(fā)現(xiàn)Hp 感染會導致人胃微生物改變和細菌多樣性的減少，Hp 與胃內(nèi)菌群似乎存在復雜的相互作用關系。某些有益菌（如枯草芽孢桿菌）可以產(chǎn)生保護性的細胞外基質(zhì)，并與其他益生菌共享，保護益生菌群免受不利環(huán)境的影響，這種細胞外基質(zhì)主要由多糖和其他大分子如蛋白質(zhì)、酶和脂質(zhì)等組成[30]。CHEN 等[31]實驗發(fā)現(xiàn)Hp 感染的小鼠喂食鼠李糖乳桿菌GMNL-74 和嗜酸乳桿菌GMNL-185后，小鼠胃腸道內(nèi)特定菌群組成發(fā)生明顯改變，雙歧桿菌和嗜黏蛋白-艾克曼菌相對豐度增加，大腸桿菌和梭狀芽孢桿菌相對豐度降低，乳桿菌作為益生菌可能通過保護有益生作用的細菌，增加有益菌的豐度進而拮抗Hp 在小鼠胃腸道內(nèi)定植。PAN 等[32]進行植物乳桿菌ZDY 2013 對胃黏膜炎癥和Hp 感染引起的小鼠胃腸道菌群改變的實驗研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌ZDY 2013 能夠有效降低致炎細胞因子（白細胞介素1β 和γ-干擾素）表達，使用植物乳桿菌ZDY 2013 預處理Hp 感染的小鼠后，胃腸道內(nèi)擬桿菌門和厚壁菌門細菌數(shù)量增加，表明植物乳桿菌ZDY 2013 在預防胃黏膜炎癥和Hp 感染引起的微生物群改變中發(fā)揮作用。因此，乳桿菌對菌群的調(diào)節(jié)作用可能是其抑制Hp 的潛在機制。

2.4 乳桿菌具有炎癥抑制作用

Hp 感染胃組織后，分泌細胞毒性相關蛋白（細胞毒素相關蛋白、細胞空泡毒素和熱休克蛋白60 等）破環(huán)人胃黏膜屏障，使機體產(chǎn)生炎癥反應，導致胃組織出現(xiàn)一系列形態(tài)學及病理性改變，是胃部疾病發(fā)生的重要原因。Hp 對免疫反應的失調(diào)會導致促炎細胞因子（如腫瘤壞死因子、白細胞介 素6 和白細胞介素8 等）異常升高[33]。GEBREMARIAM 等[34]篩選到加氏乳桿菌Kx110A1 可能通過抑制去整合素-金屬蛋白酶超家族中ADAM17 表達，影響Hp 感染的巨噬細胞內(nèi)腫瘤壞死因子和白細胞介素6 的產(chǎn)生。NF-κB 為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，能對多種炎癥反應進行調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌GMNL-74 和嗜酸乳桿菌GMNL-185 可抑制NF-κB 介導的炎癥活動通路，有效的降低白細胞介素8 的生成，改善Hp 誘導的人胃上皮細胞炎癥反應[31]。GARCIA-CASTILLO 等[35]從胃組織中分離出的乳桿菌（發(fā)酵乳桿菌UCO-979C）進行體外實驗時，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌UCO-979C 明顯降低AGS 和THP-1 細胞中炎癥細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，增加免疫調(diào)節(jié)細胞因子的水平，具有顯著的抗炎作用。ZHAO 等[20]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌ZDY2013 能夠拮抗Hp 及其體外感染人胃上皮細胞，增強抗炎細胞因子白細胞介素10 的表達，減弱AGS 細胞中促炎細胞因子（腫瘤壞死因子α）的表達。因此，乳桿菌能減輕慢性炎癥介導的組織損傷程度，在Hp 感染導致的炎癥方面發(fā)揮積極作用。

綜上所述，從臨床研究中較為關注的鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和加氏乳桿菌抑制Hp 分子機制方面進一步發(fā)現(xiàn)：三種乳桿菌均能產(chǎn)生細菌素從而發(fā)揮對Hp 直接殺菌作用；細胞實驗發(fā)現(xiàn)，鼠李糖乳桿菌和加氏乳桿菌具有明確抑制Hp 黏附的作用；體內(nèi)動物實驗表明，鼠李糖乳桿菌和嗜酸乳桿菌能夠通過改變小鼠菌群抑制Hp 在小鼠體內(nèi)定植；此外，三種乳桿菌均能抑制Hp 感染介導的炎癥因子表達，減輕慢性炎癥介導的組織損傷程度。因此鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌和加氏乳桿菌均能夠抑制Hp 感染。根據(jù)前期文獻報道，仍有10%～15%患者通過乳桿菌聯(lián)合抗生素治療，Hp根除失敗。因此，篩選更高效的乳桿菌菌株進一步提升Hp 療效將是未來的研究重點。

3 展望

目前用于臨床研究中的乳桿菌大多源自糞便、發(fā)酵產(chǎn)品或腸道等，菌株分離位置的不同導致菌株間抗菌特性的差異，可能是臨床療效不同的原因之一。據(jù)研究報道，至今已從胃內(nèi)分離出包括嗜酸乳桿菌、厄爾納拉乳桿菌、胃竇乳桿菌、加氏乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、陰道乳桿菌、唾液乳桿菌、粘膜乳桿菌、卷曲乳桿菌、口乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和干酪乳桿菌等乳桿菌[36-38]。胃內(nèi)定植的乳桿菌菌株長期適應胃內(nèi)環(huán)境，相對于其他來源的菌株是否具有更加高效抗Hp 作用，需要在未來的研究中重點關注。

近年，納米材料作為高效載體在生物醫(yī)學應用方面表現(xiàn)出巨大潛力。研究發(fā)現(xiàn)當由乳鐵蛋白修飾的仿生羥基磷灰石納米顆粒與副干酪乳桿菌的無細胞上清液結(jié)合時，對Hp 的抗菌活性較單獨或合用乳鐵蛋白、副干酪乳桿菌的效果更強[39]，表明納米材料使乳桿菌的抗菌作用增強。另外，ZHANG 等[40]研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌產(chǎn)生的細菌素與納米材料結(jié)合后可以更好地附著在Hp 感染的小鼠胃黏膜上，進而更有效地清除Hp。因此，乳桿菌產(chǎn)生的細菌素與納米材料有效結(jié)合，研發(fā)新型抗Hp 制劑，或能替代抗生素，將是提升Hp 根除率的新途徑。