鼠進行性強直蛋白人類同源物與骨、關節(jié)疾病

于 鵬，翁習生

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1國際醫(yī)療部 2骨科，北京 100730

ANK即鼠進行性強直蛋白，又稱無機焦磷酸鹽轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白，系位于小鼠細胞膜上的由492個氨基酸構成的多通道跨膜蛋白。該蛋白與其人類同源物(鼠進行性強直蛋白人類同源物ANKH)的主要功能類似，可以將細胞內(nèi)的無機焦磷酸鹽(inorganic pyrophosphate，PPi)轉(zhuǎn)運至細胞外環(huán)境中，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外PPi比例以及細胞外PPi和無機磷酸鹽(inorganic phosphate，Pi)的比例進而調(diào)控組織鈣化。PPi是礦化的抑制物，骨關節(jié)局部的高PPi濃度可以抑制羥基磷灰石的沉積，阻斷關節(jié)軟骨等組織不必要的礦化[1- 3]。ANK無意突變使細胞外PPi水平下降、細胞內(nèi)PPi水平升高，進而導致骨關節(jié)中鈣化調(diào)控異常，引發(fā)礦物質(zhì)沉積，從而導致骨沉積異常、炎癥和骨贅形成、異常鈣化等[1]。有關ANKH的研究深化了人們對部分骨關節(jié)病的認識，并為骨關節(jié)病的診斷、防治提供了新的方法和方向。目前，ANKH被認為主要與強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、顱骨干骺端發(fā)育不全(craniometaphyseal dysplasia，CMD)、軟骨鈣鹽沉積等幾種疾病相關。對該基因和上述骨關節(jié)疾病相關性的歸納總結，有利于提高研究人員對疾病的認知，推動相關疾病分子機制的研究。

ANKH與AS

AS是一種表現(xiàn)為背痛和進行性脊柱強直的中軸骨慢性炎癥性疾病，也可同時累及髖關節(jié)、肩關節(jié)、肌肉起止點等。在疾病晚期由于軟骨、軟骨周圍鈣化以及纖維化導致脊柱不可逆的僵硬以及特征性的“竹節(jié)樣”X線表現(xiàn)。ANK無意突變可以導致小鼠漸進性關節(jié)炎[4]。該疾病表現(xiàn)為漸進性的關節(jié)間隙變窄、椎間盤和脊柱韌帶鈣化、脊柱僵硬，和人類的AS極為類似，因此人們很自然地聯(lián)想到ANKH可能與AS相關[4- 6]。關于AS和ANKH之間的相關性，目前研究主要集中在ANKH的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)和AS的易感性、嚴重性間是否存在聯(lián)系。但各研究的結果間存在一定分歧。

一方面，有研究者以歐洲的高加索人種(葡萄牙人)為研究對象，分析了ANKH的4個SNP位點(rs27356、rs26307、rs25957、rs28006)，這些SNP與AS的易感性、癥狀嚴重性、起病年齡并無聯(lián)系[7]。另一項基于英國人群(種族不詳)的研究雖然發(fā)現(xiàn)了5個此前未發(fā)現(xiàn)的SNP，但最終結果表明這些SNP與AS同樣沒有關聯(lián)[8]。

另一方面，研究者Tsui等[9]針對美國和加拿大的高加索人種的AS家系研究顯示，AS的發(fā)病與ANKH的單倍型ANKH-OR等位基因1(即位于5’-UTR的 1～2個拷貝數(shù)的8 bp重復序列)和 ANKH-TR 等位基因7(即位于啟動子區(qū)不同拷貝數(shù)的3倍重復序列)相關。該研究者在后續(xù)的同樣針對美國和加拿大高加索人種AS家系的研究中，對AS家系進行了基因分型，結果顯示位于ANKH堿基序列的兩個不同區(qū)域與AS相關：rs26307/rs27356與男性罹患AS相關，而rs28006/rs25957則與女性罹患AS相關[10]。這項研究支持了ANKH與AS遺傳易感性具有一定相關性，同時還揭示了這種相關性具有性別-基因特異性。針對我國北方漢族群體的研究顯示，rs26307(T)/rs27356(C)單體型為AS的保護因素[11]。與Tsui等[9]研究結果不同，該研究中rs26307和rs27356位點基因型和單體型頻率分布無性別差異；另外，該研究并未發(fā)現(xiàn)rs26307與男性患病相關。針對日本及中國臺灣人群的研究顯示，ANKH中的SNP c.963T>G(dbSNP ID：rs2288474)在日本人群中顯示出較弱的相關性(P=0.045)，但在中國臺灣人群中未顯示出相關性[12]。

上述各項研究的異質(zhì)性很高，所采用的統(tǒng)計量不同且無法互相轉(zhuǎn)化，所以也無法對各研究的統(tǒng)計量進行統(tǒng)計學合并。各研究結果間的差異來源可能來自以下幾個方面。首先，各研究所納入的SNP間的重合度并不高，故而其結果間出現(xiàn)差異也并不出乎意料；其次，即使對于所納入的SNP一致的幾項研究，單就各研究的實驗設計、研究類型、統(tǒng)計學方法等的異質(zhì)性完全就可以解釋其結果間的差異；另外，AS的易感性本身就與民族、種族有關，各研究的研究對象不一致很可能也會導致研究結果的不一致；最后，有研究者猜測ANKH僅是受到某些上游因素調(diào)控從而導致組織鈣化的下游基因，因此，ANKH可能僅與局部鈣化程度相關而與AS本身并不相關。

最后，隨著近年微小RNA成為研究的熱門，研究者們試圖從這一表觀遺傳學層面研究ANKH和AS間的關系。一項新近的研究顯示下調(diào)AS患者成纖維細胞中的miR- 17- 5p可以減少其成骨分化，這一調(diào)控作用是通過和ANKH的3’UTR結合、調(diào)節(jié)ANKH的表達水平實現(xiàn)的，該研究表明miR- 17- 5p的抑制物可以緩解AS模型大鼠的骶髂關節(jié)炎，抑制異位骨化[13]。該研究從一個側(cè)面表明，即使ANKH和AS的起病、嚴重程度、易感性間并無相關性，ANKH仍具備成為AS治療靶點的潛質(zhì)。

ANKH與CMD

CMD是一種罕見的遺傳性骨發(fā)育不良疾病。該病特征性的表現(xiàn)是肢體長骨的骨質(zhì)減少以及顱、頜面部的骨質(zhì)肥厚、硬化。部分嚴重病例也可由于骨異常增生壓迫顱神經(jīng)孔，導致面神經(jīng)、前庭蝸神經(jīng)、視神經(jīng)的功能障礙。該病的遺傳方式有兩種：常染色體顯性遺傳(AD，MIM#123000，致病基因位于染色體 5p15.2-p14.1[14- 15])，以及常染色體隱性遺傳(AR，MIM#218400，致病基因位于6q21- 22，較AD更為罕見[16- 19])。其中，遵循AD遺傳模式的CMD即由ANKH的突變所致。有研究者通過對9個家系的突變進行研究顯示6個導致該疾病的ANKH突變，這些基因突變包括單核苷酸替換、刪失或者插入，這些突變均發(fā)生于高度保守的核苷酸殘基，且均位于跨膜蛋白的細胞質(zhì)側(cè)，進而導致跨膜蛋白的構像變化[20]。除上述研究外，人們還發(fā)現(xiàn)其他位點的刪失突變及插入突變[17]、單氨基酸突變[21]，外顯子區(qū)的復雜雜合突變[22]、無意突變L244[23]、母源鑲嵌性突變[24]等其他致病突變形式。上述這些突變所編碼的氨基酸幾乎均位于細胞內(nèi)或者跨膜段，可以導致PPi轉(zhuǎn)運功能異常，從而影響骨質(zhì)鈣化[25]。由于CMD較為罕見，因此研究者們嘗試建立鼠CMD模型，在實驗動物上進行有關CMD的細胞和分子水平研究。雖然ANK敲除小鼠(ANKnull/null)表型與CMD者類似，但是ANK敲除鼠只能復制出CMD的一部分表現(xiàn)，如顱骨厚度增加、中耳骨融合、枕骨大孔變窄以及股骨干骺端骨小梁減少[25]等。而鼻竇閉塞、下頜骨前突伴頜骨骨量增加、長骨肥大及干骺端肥大等特點則無法在ANK敲除鼠中獲得。因此，人們嘗試將表達ANK人類突變(Phe377缺失，TTC1130- 1132)的基因敲入鼠中，這種純合子ANK敲入鼠(ANKKI/KI)成功地復制了幾乎所有的人類CMD特征。在ANKKI/KI鼠的成骨細胞中PPi水平與正常對照組的PPi水平類似，均顯著高于ANKnull/null組。事實上，在ANKKI/KI鼠成骨細胞中，另一PPi穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)基因ENPP- 1的表達水平顯著增加，這很可能彌補了ANK功能異常導致的PPi水平變化，這表明3組間的表型差異并不是單純的源自成骨細胞PPi水平的差異。實驗證明，ANKKI/KI鼠的破骨細胞生成減少。因此使得成骨/破骨間的平衡被打破，導致骨量異常增加，進而出現(xiàn)CMD相關的表型[26]。骨髓移植可以改善這種異常的骨量增加，很可能是因為移植的骨髓干細胞在體內(nèi)發(fā)生分化，彌補了破骨細胞的缺乏[26]。由此可見，ANKH導致的破骨細胞生成減少是導致CMD表型的真正原因，同時也給CMD的治療指出了方向。如果可將該方法[26]用于其他突變的研究，對于了解其他突變的致病機制將很有幫助。但目前仍然不知道突變的ANK是通過什么調(diào)控方式導致破骨細胞生成減少的。雖然ANK的蛋白構象研究目前仍停留在軟件預測的程度上，但仍舊可以推斷，ANKH的致病突變很可能是由于堿基突變導致跨膜蛋白構像發(fā)生變化，從而造成某些通路的異常活化或失活，最終導致破骨細胞產(chǎn)生減少的后果。

和其他大多數(shù)罕見基因病一樣，雖然研究者們了解了CMD發(fā)病的分子學機制，但是目前并無針對CMD的有效治療。動物實驗表明，補充磷酸鹽并不能改善本病的骨骼異常[27]。而存在低血鈣的CMD患者究竟應該補鈣治療還是應該低鈣飲食尚存在爭議[28]。補鈣可以改善CMD患者的甲狀旁腺素升高和低血鈣，但這樣是否真的可以改善預后目前尚無有力證據(jù)[29]。手術解除神經(jīng)壓迫、糾正關節(jié)僵硬、調(diào)整面部外觀可以用來改善神經(jīng)壓迫癥狀、提高生活治療、改善社交[30- 31]。雖然在動物實驗中發(fā)現(xiàn)骨髓移植可以改善異常增加的骨量，但距離應用于臨床尚有十分遙遠的距離。ANKH敲入鼠除了出現(xiàn)CMD相關表型之外還存在破骨細胞功能異常；而存在Phe377缺失或Ser375缺失的CMD患者的人源多能干細胞可以穩(wěn)定地分化為破骨細胞，因而這兩者具備成為工具動物、工具細胞以研究CMD等其他破骨細胞相關疾病的潛質(zhì)[32]。

ANKH與焦磷酸鈣沉積

焦磷酸鈣(calcium pyrophosphate，CPP)晶體沉積(calcium pyrophosphate deposition，CPPD)在關節(jié)軟骨鈣化(chondrocalcinosis，CC)時十分常見[33]。CPP沉積可能表現(xiàn)為急性焦磷酸鹽晶體性關節(jié)炎，CPPD并發(fā)骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)，慢性CPP晶體炎癥性關節(jié)炎或無癥狀關節(jié)鈣化[34]。歷史上，由于這些CPPD疾病的臨床癥狀和痛風、類風濕關節(jié)炎等很類似，故而被稱之為 “假性綜合征”，即假性痛風和假性類風濕關節(jié)炎[35]等。后來，這些名稱被歐洲風濕病聯(lián)盟公布的新名詞取代。CC可以散發(fā)于關節(jié)病變的患者中，也可呈家族性分布。

散發(fā)性CC在人群中十分常見。導致CC的高危因素眾多，高齡、骨關節(jié)炎是十分重要的危險因素[34]。實際上，CPPD并發(fā)OA在臨床上十分常見，OA患者也在散發(fā)性CC患者中占據(jù)相當大的比重。因此，有關散發(fā)性CC的研究很多都以OA患者或OA動物模型作為研究對象和實驗材料的來源，因而有關CC的很多研究結果也可以推廣至OA。CC在OA發(fā)生發(fā)展中的角色并不完全清楚，但可以確定的是，CPPD和OA存在密切聯(lián)系。一方面，CPPD普遍存在于OA患者的關節(jié)軟骨中，可以涉及整個膝關節(jié)軟骨，甚至包含肉眼觀測正常的負重區(qū)；同時有充足證據(jù)證明這些晶體可以啟動、放大骨破壞，參與關節(jié)損傷[34]。另外，關節(jié)液中CPPD的存在可以用來預測OA患者關節(jié)損傷的嚴重程度和關節(jié)破壞速度[36]。PPi作為CPPD的陰離子組分，其調(diào)控基因ANKH也受到研究者的重視。概括地說，ANKH可以調(diào)控CPPD在關節(jié)組分中的沉積，參與OA的形成和進展。有研究者發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的合并CPPD的軟骨細胞和合并CPPD的軟骨提取物中ANK mRNA的基礎表達高于普通OA患者的軟骨或正常軟骨，而且與沒有CPPD沉積的對照組OA患者相比，CPPD沉積患者的關節(jié)組織中ANK蛋白和mRNA的水平增加，表明ANK在CPPD晶體形成中起到了直接作用[37]。在晶體沉積物附近的軟骨細胞中，ANKH的免疫熒光強度也明顯增強。另外，OA患者的受累關節(jié)軟骨細胞易于在體外被誘導鈣化。在這些細胞中，與礦化過程有關的幾個基因，包括ENPP- 1和ANKH的表達可見上調(diào)[38]。上述研究表明，ANKH參與了關節(jié)軟骨的晶體沉積。另有研究顯示OA患者的半月板細胞也存在CPPD晶體，并在OA患者半月板中發(fā)現(xiàn)了ANKH的表達異常，并且表達水平的異常程度隨著OA嚴重程度的增加而增加[39- 41]。除了關節(jié)軟骨和半月板細胞外，還有研究顯示OA患者的成骨細胞中的ANKH表達增加，在硬化的成骨細胞中觀察到的ANKH高表達可能是局部PPi積累的原因[42]。

除了ANKH對CPPD的調(diào)控研究外，尚有研究顯示軟骨鈣化與ANKH的5’UTR中的SNP- 4bpG>A存在關聯(lián)[43]。雖然在歐洲人中上述SNP與散發(fā)型CC有關[44]，但是，在同為雅利安人種的以Khatris為種姓的印度OA人群中卻并未發(fā)現(xiàn)這項突變[45]。這一研究結果間的差別是因為病例數(shù)不夠大還是由于種族間的差異，抑或其他原因目前尚不清楚，ANKH的其他SNP是否與OA存在關聯(lián)也不得而知。

有研究者發(fā)現(xiàn)，將大鼠關節(jié)軟骨細胞暴露于白介素- 1β、腫瘤壞死因子α可以使細胞外無機磷酸鹽含量下降，暴露于生長因子可以使胞外無機磷酸鹽含量上升[46- 47]。轉(zhuǎn)化生長因子-β對于誘導ANKH表達尤為有效，具有增加軟骨細胞釋放PPi的能力[48]。上述因子都是OA形成的重要分子機制，再加上ANKH在軟骨細胞、半月板細胞、軟骨下骨中均有表達并與鈣化、晶體形成等過程相關，所以該基因?qū)τ诜乐购湍孓D(zhuǎn)晶體沉積，阻止退變性關節(jié)炎的進展存在理論上的可能性[36]，具備成為預防、治療靶點的潛質(zhì)。

CPPD還可以作為家族性遺傳病而存在。目前已有多個國家和不同種族的家系報道，遺傳模式通常是常染色體顯性[49- 54]。與CMD患者的負性功能突變不同，家族性CPPD患者的突變通常為功能獲得性突變[25]。該病主要臨床表現(xiàn)為家族性早發(fā)性(通常在20～40歲)CPP晶體性關節(jié)炎，伴有多關節(jié)鈣鹽沉積，輕重不一的結構性關節(jié)炎/骨關節(jié)炎。該病還有第2種表型，發(fā)作于60～70歲，表現(xiàn)為少關節(jié)的鈣鹽沉積，更類似于散發(fā)的CPPD[55]。在兒童期良性發(fā)病似乎是一個早期多關節(jié)發(fā)病的英國家系所獨有的。導致該病的染色體5p15上的致病基因CCAL2(MIM 118600，即ANKH)即首次在這個家族中被鑒定出來[56]。在美國的另一個合并早發(fā)OA和相關CPPD的家庭中，則發(fā)現(xiàn)了該病的另一個致病基因，位于染色體8q(CCAL1，MIM 600668)[57]。有研究將導致CPPD的ANKH突變(ΔE490)轉(zhuǎn)染入成軟骨細胞ATDC5中，實驗證明ANKH和組織非特異性堿性磷酸酶的相互作用有利于正常組織礦化，而ANKH的功能異常即可導致組織非特異性堿性磷酸酶的調(diào)控異常。加上其他尚不明確的調(diào)控因素，導致病理性礦化發(fā)生，出現(xiàn)CPPD[58]。該研究者的另一項研究還將同樣可以導致CPPD的ANKH的突變M48T轉(zhuǎn)染入ATDC5細胞中，實驗發(fā)現(xiàn)ANKH M48T突變蛋白喪失了與鈉/磷酸鹽共轉(zhuǎn)運蛋白PiT- 1相互作用的能力。而PiT- 1則可以調(diào)節(jié)Pi和PPi的穩(wěn)態(tài)[59]。這些研究初步說明ANKH突變所導致CPPD的分子機制，即突變導致結構異常，進而導致蛋白質(zhì)互相作用異常。由于上述突變所造成的功能異常穩(wěn)定且可在細胞水平進行驗證，故而這些攜帶ANKH突變的細胞同樣具備成為工具細胞的潛質(zhì)。

無論是家族性的焦磷酸鈣蛋白沉積病還是散發(fā)型的焦磷酸鈣蛋白沉積病，目前的治療方法都和骨關節(jié)炎、類風濕性關節(jié)炎乃至痛風類似，主要是對癥及抗炎治療。在疾病的急性發(fā)作期早期或慢性CPP關節(jié)炎的早、中期，均以非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素治療，羥氯喹、甲氨蝶呤等免疫抑制治療為主?？捎糜谥委熗达L的秋水仙堿、白介素- 1抑制劑可能對該病也有效。和OA一樣，在CPPD疾病的終末期關節(jié)置換術仍然是改善癥狀及關節(jié)功能的優(yōu)選治療方案。目前尚無作用于ANKH的減少晶體形成的治療方法。究其緣由，首先，目前尚缺乏高選擇性調(diào)節(jié)ANKH表達水平的治療手段，關節(jié)局部的RNA干擾雖不失為一項有前景的治療方法，但目前尚無此類研究出現(xiàn)。其次，在控制異常鈣鹽沉積的同時如何還能夠不影響正常骨質(zhì)鈣沉積也是有待解決的難題。最后，PPi平衡的穩(wěn)態(tài)同時還受其他基因調(diào)控，單一改變AKNH的表達能否起到預期的結果也不得而知。

綜上，ANKH是骨關節(jié)組織鈣化的重要調(diào)節(jié)物，在AS、CMD、CC等骨關節(jié)病的分子機制中扮演了重要角色。對于AS，雖然ANK無意突變可以導致小鼠與AS類似的表現(xiàn)，但ANKH的SNP與AS的相關性間目前尚有爭議。盡管如此，通過微小RNA對ANKH表達進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)依然可能改善AS的嚴重程度。對于CMD來說，目前人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種ANKH的致病突變形式。破骨細胞生成減少(可能系因ANKH突變導致蛋白構象改變)是導致CMD表型的重要原因。骨髓移植可能成為CMD的治療方法。對于散發(fā)性CPP沉積病，ANKH通過調(diào)節(jié)CPP沉積參與CC、OA等CPPD沉積相關疾病的發(fā)生發(fā)展；對于家族性CPPD，ANKH突變則是主要病因之一。目前研究主要集中于ANKH與上述疾病的易感性、起病及發(fā)展的分子機制，以及使用攜帶該基因突變型的細胞、動物作為疾病和細胞分化異常研究工具。目前尚缺乏的研究方向有：ANKH突變與蛋白構象改變、調(diào)控異常相關性的研究，如何精確地、局部地改變ANKH表達的研究，以及將ANKH作為治療靶點的疾病治療研究。近年，有關該基因的研究和尤其是骨關節(jié)病的研究不多，近年所檢索到的有關ANKH的研究很多是將其作為組織鈣化的標記物。此外，由于ANKH的表達受微小RNA的影響[13，60]，微小RNA及RNA干擾技術可能使ANKH成為治療靶點，具備應用潛質(zhì)，但目前該方向的研究仍極度缺乏，有待研究者們進一步探索。