超基因：基因表達的“多面手”

劉 濤，王樹森，3，4，楊 磊，時 喬，沈中陽，3，4

天津市第一中心醫(yī)院 1中國醫(yī)學科學院移植醫(yī)學重點實驗室 2國家衛(wèi)生健康委員會危重病急救醫(yī)學重點實驗室3天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心 4器官移植中心 5檢驗科，天津 300192 6天津中醫(yī)藥大學研究生院，天津 301617

在生物體中，將遺傳密碼體現(xiàn)為生物的性狀及各種生理活動過程，都離不開基因的表達，即基因組DNA轉(zhuǎn)錄生成信使RNA(messenger RNA，mRNA)等，并參與翻譯生成蛋白質(zhì)。在基因表達過程中，早期的觀點主要集中在“中心法則”，即遺傳信息按照“DNA-RNA-蛋白”的方向進行表達。然而，在龐大的基因組中，編碼蛋白的序列所占的比例不足全部序列的2%[1]，這一現(xiàn)象曾令科學家感到困惑。近年來，發(fā)現(xiàn)基因組的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中不僅有可編碼蛋白的RNA，還有很多非編碼RNA，主要包括微RNA(microRNA，miRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)等。據(jù)估計，人類細胞中約有60%的序列能夠被轉(zhuǎn)錄[2]。這些非編碼RNA的功能雖已有一定的研究，但相對于編碼RNA來說，非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄模式和功能還遠未完全闡明。

非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄模式較為復雜。有些非編碼RNA可能依靠其獨立的啟動子起始轉(zhuǎn)錄，但更多的非編碼RNA轉(zhuǎn)錄元件與編碼RNA具有一定的聯(lián)系。一些非編碼RNA可與鄰近的編碼RNA共同轉(zhuǎn)錄[3- 4]，或轉(zhuǎn)錄自蛋白編碼基因的啟動子區(qū)域[5- 6]或增強子區(qū)域[7- 8]。另一些非編碼RNA可能由編碼RNA前體的可變剪接生成[9]。此外，非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄還存在細胞和組織特異性[10]。如果一個轉(zhuǎn)錄位點在特定的條件下，可轉(zhuǎn)錄生成一個以上的RNA產(chǎn)物(包括編碼RNA和非編碼RNA)，則該基因位點被稱為“超基因”。超基因共分為3種類型，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，本文分別介紹各型超基因的轉(zhuǎn)錄特征，并以實例的方式闡述其在細胞中的調(diào)控作用，特別是在腫瘤細胞中的生物學活性。

Ⅰ型超基因

Ⅰ型超基因是指同一個基因位點在不同的條件下，能夠生成不同起止位點的RNA轉(zhuǎn)錄本，且這些不同的RNA可能分別作為編碼RNA或非編碼RNA。這類超基因的數(shù)量較少，常見的發(fā)生條件是細胞遭受紫外線照射等應激過程。例如，活化信號合成物復合體亞單位3(activating signal cointegrator 1 complex subunit 3，ASCC3)是一個較為典型的Ⅰ型超基因，該基因在細胞遭受紫外線照射損傷后的不同階段，能夠生成不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。具體來說，當細胞被紫外線照射后，細胞將啟動損傷修復過程，同時細胞中大多數(shù)基因的轉(zhuǎn)錄過程被抑制，避免生成錯誤的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在這一過程中，ASCC3主要生成編碼mRNA，其蛋白產(chǎn)物是維持細胞轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)的關鍵因子。而在DNA損傷修復的后期，ASCC3改為轉(zhuǎn)錄生成一段較短的非編碼RNA，該RNA能夠?qū)笰SCC3蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用，從而使細胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄過程逐漸恢復正常[11]。類似地，整合因子復合體亞單位(identified integrator complex subunit，INTS)6也具有Ⅰ型超基因的調(diào)控特點。在正常情況下，INTS6轉(zhuǎn)錄并編碼生成由887個氨基酸構(gòu)成的蛋白產(chǎn)物。而在細胞遭受紫外線照射后，INTS6轉(zhuǎn)錄生成一段較短的RNA，編碼僅115個氨基酸的蛋白片段。INTS6與INTS3等因子相互作用，構(gòu)成單鏈DNA結(jié)合蛋白1復合物，參與DNA同源重組形式的損傷修復過程[12]。通過 Ⅰ 型超基因這種精巧的調(diào)節(jié)機制，ASCC3、INTS6等基因位點在DNA受到紫外線損傷的不同階段生成具有不同長度和功能的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在DNA損傷修復過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

Ⅱ型超基因

與Ⅰ型超基因不同，Ⅱ型超基因轉(zhuǎn)錄生成單一的RNA產(chǎn)物，但通過轉(zhuǎn)錄后剪接和加工等過程，可生成不同序列和不同功能的兩種或多種RNA?？勺兗艚釉谡婧思毎霓D(zhuǎn)錄后加工過程中較為普遍，因此這類超基因的種類較多。根據(jù)生成RNA的種類不同，Ⅱ型超基因可分為以下幾種類型。

源于編碼基因內(nèi)含子的小片段非編碼RNA一些miRNA的轉(zhuǎn)錄生成過程，是隨其“宿主”基因一同轉(zhuǎn)錄后，通過轉(zhuǎn)錄后的剪接過程，產(chǎn)生miRNA的前體，進而生成成熟的miRNA。那些隨著真核細胞mRNA的加工成熟過程，由內(nèi)含子生成的miRNA前體，被稱為“mitron”[13]。例如，心臟特異性的miR- 208源于編碼α肌球蛋白重鏈(α-myosin heavy chain，αMHC)基因的內(nèi)含子，該基因除了編碼αMHC蛋白，參與心肌收縮功能之外，還由其內(nèi)含子生成miR- 208，該miRNA能夠調(diào)控應激和激素反應時的心肌收縮性[14]，從而使這兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物實現(xiàn)協(xié)同作用。類似地，miR- 483- 3p源于胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)的內(nèi)含子，其在多種腫瘤中發(fā)揮抗凋亡的活性。然而，miR- 483- 3p和其宿主基因IGF2的表達水平并無明顯的一致性，該miRNA與IGF2編碼產(chǎn)物是否存在協(xié)同作用有待進一步研究[15]。此外，一些環(huán)狀RNA也來源于編碼基因的內(nèi)含子，這類環(huán)狀RNA伴隨內(nèi)含子的剪接過程而生成，并能夠促進相應宿主基因的表達[16]。

由編碼基因位點生成的內(nèi)源性小干擾RNA小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是一種外源合成后導入細胞，對目的基因的表達進行抑制的短片段雙鏈RNA，常作為基因功能研究的工具。然而，細胞也會產(chǎn)生內(nèi)源性的siRNA(endo-siRNA，esiRNA)。Mg2+/Mn2+依賴性蛋白磷酸酶1K(protein phosphatase，Mg2+/Mn2+dependent 1K，PPM1K)基因的逆向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，即假基因ψPPM1K中包含反向重復序列，能夠產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并加工生成esiRNA，該esiRNA可靶定并抑制非有絲分裂基因A相關激酶8(never in mitosis gene A related expressed kinase 8，NEK8)的表達。在人肝癌細胞中，PPM1K蛋白及ψPPM1K生成的esiRNA表達減低，導致esiRNA對NEK8的抑制作用減弱，引起NEK8的表達升高。NEK8能夠?qū)功譖PM1K對細胞生長的抑制作用，這一過程是肝癌細胞增殖加速的機制之一[17]。

由長鏈非編碼RNA加工生成的小片段非編碼RNA短片段的非編碼RNA除了可以在編碼基因的mRNA加工成熟過程中產(chǎn)生，有時也能由lncRNA的轉(zhuǎn)錄后加工過程產(chǎn)生。例如，lncRNA轉(zhuǎn)移相關肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)在轉(zhuǎn)錄后，即被RNA酶P切割成兩條非編碼RNA，其中位于5’端較長的RNA鏈為MALAT1的成熟序列，位于3’端較短的RNA鏈具有和轉(zhuǎn)運RNA(transfer RNA，tRNA)相似的“三葉草”樣二級結(jié)構(gòu)，最終生成一段61 nt的非編碼RNA。和MALAT1主要定位于細胞核不同，這段短鏈的RNA主要定位于細胞漿，因此被命名為MALAT1相關小胞漿RNA(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA，mascRNA)。mascRNA作為tRNA的類似物，可能參與翻譯過程[18]，并影響單核-巨噬細胞系統(tǒng)，參與心血管系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程[19]。

源于tRNA的小片段非編碼RNAtRNA的前體或成熟體也能夠在5’端或3’端進行剪切，生成與miRNA長度類似的小片段非編碼RNA，這類RNA被稱為tRNA來源的RNA片段(tRNA-derived RNA fragments，tRF)[20]。這些小片段RNA并非tRNA加工過程產(chǎn)生的“廢物”，而是在細胞功能調(diào)控中發(fā)揮作用。例如，tRF- 1001即為一條來源于絲氨酸t(yī)RNA前體的tRF，由核酸內(nèi)切酶elaC Z2切割tRNA前體生成。功能研究表明，tRF- 1001能夠促進多種腫瘤細胞的增殖[20]。

值得注意的是，tRF分子無論是加工成熟過程還是作用機制，都和miRNA存在相似之處。有些在前期被確認為miRNA的分子，在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)其來源于tRNA，被稱為tRNA來源的小RNA(tRNA-derived small RNA，tsRNA)，其本質(zhì)仍為tRF。在慢性淋巴細胞白血病、肺癌、前列腺癌等腫瘤中，tsRNA發(fā)生特征性的表達譜改變，提示tRF在功能上也和miRNA類似，具有癌基因或抑癌基因的活性[21- 22]。例如，CU1276是一條從人類成熟B細胞中克隆到的tRF分子，長度為22 nt，其被證實來源于多個tRNA的3’端序列。CU1276不僅長度和miRNA相似，其加工成熟過程也和miRNA類似，需要依賴Argonaute蛋白和DICER1蛋白。CU1276的作用機制也與miRNA相似，其通過序列特異性結(jié)合于mRNA 3’非翻譯區(qū)的方式，抑制復制蛋白A1的表達。在功能調(diào)控方面，CU1276抑制細胞的增殖，參與DNA復制和損傷修復過程。在生發(fā)中心淋巴瘤細胞中發(fā)現(xiàn)CU1276表達缺失，造成細胞增殖加速及DNA代謝動力學的紊亂[23]。作為tRF的另一個實例是miR- 3676和miR- 4521，這兩條miRNA來源于蘇氨酸t(yī)RNA的前體，屬于3’tRF，其序列在慢性淋巴細胞白血病和肺癌中發(fā)生突變[21]。tRF在mRNA上的結(jié)合位點序列與一種RNA結(jié)合蛋白，即YBX1的結(jié)合位點序列相同。在乳腺癌細胞遭受缺氧等應激條件下，細胞內(nèi)tRF被誘導而大量生成，并與YBX1競爭性結(jié)合癌基因mRNA的3’非翻譯區(qū)位點，導致mRNA上的YBX1被tRF取代，其結(jié)果是癌基因mRNA加速降解。如果這類抑癌性的tRF生成減少，會導致該抑癌通路效應減低，乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移活性增強[24]。

有些tRF也可能在非惡性腫瘤的病理情況下大量生成，如呼吸道合胞病毒感染后的人肺癌細胞系中，產(chǎn)生大量長度約30 nt的tRF分子，其中一條來源于tRNA-Glu-CTC的tRF能夠促進呼吸道合胞病毒的復制[25]。此外，tRF也能干擾真核細胞的翻譯起始因子，從而抑制蛋白的翻譯[26]。

Ⅲ型超基因

一些基因位點既能直接生成不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其部分轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也能加工生成不同的RNA分子，即同時具備Ⅰ型和Ⅱ型超基因的特點，這類基因稱為Ⅲ型超基因。該類型超基因的典型實例是H19基因位點，該位點的兩個方向均可被轉(zhuǎn)錄，生成4種不同的RNA分子。其正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除lncRNA H19外，在人和小鼠細胞中，H19可作為miR- 675的前體，進一步加工生成成熟的miR- 675[27]。此外，H19基因反向轉(zhuǎn)錄亦可生成兩條RNA，其中一條為lncRNA，作為H19的反向互補序列，該lncRNA被形象地命名為91H，即H19的反向拼寫。另一條RNA可編碼蛋白，被命名為H19反向腫瘤抑制基因(H19 opposite tumor suppressor，HOTS)。

H19基因位點的正向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物—H19/miR- 675H19基因啟動子序列存在單核苷酸多態(tài)性(single-nucleotide polymorphism，SNP)位點，其中3個SNP位點與結(jié)直腸癌的風險和預后相關[28]。但這一調(diào)控機制對基因位點自身轉(zhuǎn)錄過程的影響還不明確。

該基因位點的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物lncRNA H19可在轉(zhuǎn)錄水平上對其他基因進行調(diào)控。H19與S腺苷蛋氨酸水解酶結(jié)合并抑制其功能，H19基因表達被抑制后，可使S腺苷蛋氨酸的水解加速，導致DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3β介導的多個基因的甲基化作用增強，從而影響細胞的功能[29]。

H19/miR- 675對細胞功能的調(diào)控更多發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。在不同的組織和細胞中，H19/miR- 675發(fā)揮的作用不同甚至可能相反[30- 31]。一方面，H19/miR- 675在畸胎瘤、結(jié)腸癌和肝癌等多種腫瘤細胞中具有抑癌基因的活性[32]。在前列腺癌細胞系中過表達H19可使miR- 675水平升高，導致miR- 675的直接靶基因TGFBI的表達被抑制，從而抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移[33]。在非小細胞肺癌中，miR- 675的抑癌活性則是通過調(diào)控其靶基因GPR55實現(xiàn)的[34]。此外，在胚胎發(fā)育過程中，H19能夠減緩細胞增殖，這一效應與伴隨生成的miR- 675相關。在胚胎細胞中過表達miR- 675能夠使增殖減慢，相關靶基因是胰島素樣生長因子1受體[35]。

另一方面，在乳腺癌等腫瘤中，H19/miR- 675具有癌基因活性。過表達H19/miR- 675能夠促進乳腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，miR- 675靶定并調(diào)控c-Cbl和Cbl-b的表達，導致Akt和Erk通路持續(xù)活化，細胞的惡性程度增加[36]。在非小細胞肺癌中，H19誘導miR- 675表達升高，使miR- 675的靶基因p53過度抑制，導致腫瘤進程加速[37]。H19也可作為miRNA的吸附物，以競爭性內(nèi)源RNA[38- 39]的方式調(diào)控其他基因的表達。例如，H19作為let- 7家族的生理性吸附物，能夠調(diào)控肌組織的分化[40]。在乳腺癌細胞中，H19能夠競爭性吸附miR- 200b/c和let- 7b，并促進這些miRNA的靶基因如Git2和Cyth3的表達，引起下游一系列細胞信號途徑的改變，最終導致癌細胞的轉(zhuǎn)移加速[41]。H19在食管癌細胞中也作為miR- 22- 3p的吸附物，抑制H19可使miR- 22- 3p的靶基因WNT1表達降低，從而抑制食管癌細胞的增殖和遷移，并增強癌細胞對放療的敏感性[42]。

H19基因位點的反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物—91H和HOTS蛋白根據(jù)目前的研究結(jié)果，作為H19的反向互補序列，lncRNA 91H在腫瘤中主要表現(xiàn)出癌基因的活性。例如在結(jié)腸癌細胞中，91H的表達水平上調(diào)，其通過調(diào)控靶基因HNRNPK促進癌細胞的轉(zhuǎn)移，且91H在血清中的表達水平能夠作為結(jié)腸癌預后的預測指標[43- 44]。在乳腺癌細胞中，91H促進細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制是抑制H19基因位點的甲基化，從而上調(diào)lncRNA H19的表達水平[45]。這一過程提示，該基因位點不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物之間可能存在協(xié)同作用。H19基因位點的另一個反向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物HOTS是蛋白編碼基因，值得注意的是，其編碼產(chǎn)物具有抑癌活性，能夠抑制橫紋肌肉瘤、絨毛膜癌、腎母細胞瘤(Wilms瘤)等腫瘤細胞的生長[46]。

綜上，H19基因位點的各轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在腫瘤細胞中的作用并不一致，各產(chǎn)物之間可能存在協(xié)同作用或拮抗作用，但其相互作用的具體機制目前還不十分清楚，有待進一步研究。

總 結(jié)

傳統(tǒng)觀點認為，原核生物的基因為多順反子，即多數(shù)基因根據(jù)功能的相關性，成簇串聯(lián)形成操縱子，受到統(tǒng)一的調(diào)控。與之對應，真核生物的基因為單順反子，即一個基因通過轉(zhuǎn)錄僅生成一條RNA分子，并編碼一條多肽鏈。但近年來的研究表明，真核生物的一個基因也可能通過不同的轉(zhuǎn)錄起止位點，或經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后剪切過程，生成不止一個RNA轉(zhuǎn)錄本，即所謂的超基因。這一觀點的提出對真核生物單順反子的理論進行了挑戰(zhàn)，這是因為早期對非編碼RNA的研究很少，主要關注編碼基因，而編碼基因大多數(shù)符合單順反子的特征。近年隨著非編碼RNA的逐漸深入，越來越多的非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄特征被明確，發(fā)現(xiàn)很多非編碼RNA是伴隨編碼基因的轉(zhuǎn)錄而生成的，甚至有些超基因位點并不包含編碼基因，僅由長鏈非編碼RNA(如lncRNA)和短鏈非編碼RNA(如miRNA)構(gòu)成。盡管如此，目前對于超基因的研究還處于初級階段，在未來的研究中需要關注的不僅是超基因各RNA是如何轉(zhuǎn)錄的，而應該探索各轉(zhuǎn)錄本的表達如何進行協(xié)同調(diào)控，以及RNA轉(zhuǎn)錄本通過何種調(diào)控機制剪接生成多個RNA產(chǎn)物。超基因這種轉(zhuǎn)錄模式在細胞功能學調(diào)控方面的意義，也需要進一步闡明。隨著研究的深入，超基因這種基因表達的“多面手”將更多地被闡釋，隱藏在生物遺傳密碼當中的奧秘也將越來越多地被揭示。