葛根素治療去卵巢小鼠骨量丟失的療效及對RANKL/RANK/OPG信號通路的影響

許曉山 龐正寶 楊軍 周一峰 夏臣杰 丁心逸

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis,PMOP）是一類以骨量流失，骨微結構異常導致骨骼脆性增加的代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計，我國約有25.6%的50歲以上婦女患有PMOP[1]，并由此導致的脆性骨折發(fā)生率高達40%[2]。盡管市場上存在各類抗PMOP的藥物，如二磷酸鹽、活性維生素D等，但由于這些化學合成藥物存在毒副反應且適應性不廣，使得天然植物來源的中草藥逐漸成了新藥研發(fā)的熱點[3]。葛根素是中藥葛根最主要的活性成分之一，臨床和動物實驗發(fā)現(xiàn)，其能夠有效延緩PMOP，改善機體骨量丟失[4-5]。葛根素的分子結構與雌激素相似，能夠與破骨細胞上的雌激素受體結合，抑制破骨細胞的增殖、分化和成熟，影響骨吸收的過程[6-7]。然而，目前葛根素抗PMOP的分子靶點及相關的信號通路尚不清楚。雌激素缺乏導致成骨-破骨耦聯(lián)失衡是PMOP重要的發(fā)病機制[8-9]。其中，核因子κB受體活化因子（receptor activator ofnuclear factor kappa-B ligand，RANKL）/核因子 κB 受體活化因子配體（receptor activator ofnuclear factor kappa-B,RANK）/骨保護素（osteoprotegerin,OPG）信號通路參與并調(diào)控破骨細胞的骨吸收功能，與PMOP的發(fā)生、發(fā)展密切相關[10]。本實驗通過葛根素干預去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型，驗證葛根素防治PMOP的療效，并進一步探討其對破骨細胞和RANKL/RANK/OPG信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 雌性12周齡C57BL/6小鼠30只，體重（24±2）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。

1.2 藥物、試劑及儀器 戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，批號：921019）；4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：P1110）；固綠染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G2551）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，Trap）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1492）；核酸檢測試劑盒（日本Takara公司，批號：9534）；β-Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽（β-cross-linked C-terminal telopeptide of type I collagen，β-CTX）ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H287）；抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，Trap5b）ELISA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：H377-1-1）；骨形態(tài)計量儀（美國Osteometrics公司）；熒光定量PCR儀（美國Termor公司）；蔡司顯微鏡（德國Zeiss公司）；微型計算機斷層掃描（micro computed tomography，Micro-CT）儀（型號：Skyscan 1170，比利時 Bruker公司）。

1.3 小鼠造模及分組藥物干預 采用隨機數(shù)字表法將30只小鼠分為假手術組、模型組和葛根素治療組，每組10只。小鼠接受0.3%戊巴比妥（0.1 ml/10 g）腹腔注射麻醉后，常規(guī)剃毛消毒。于背部正中線作長約1.5 cm的切口，沿背部肋弓緣、腰椎旁逐層進入腹腔，暴露兩側卵巢及輸卵管。模型組和葛根素治療組小鼠切除雙側卵巢并結扎輸卵管，假手術組小鼠去除卵巢周圍等量的脂肪組織。檢查無活動性出血，逐層縫合傷口。術后連續(xù)2 d腹腔注射青霉素。第3天起開始藥物干預。根據(jù)成人與小鼠的體表面積藥物換算比例，葛根素治療組小鼠予100 mg/kg劑量的葛根素（溶于0.4 ml 0.9%氯化鈉溶液）灌胃干預，隔天1次，持續(xù)8周。模型組小鼠給予0.4 ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃，隔天1次，持續(xù)8周。假手術組小鼠不作處理。

1.4 Micro-CT檢測 造模8周后，獲取各組小鼠右側股骨組織，剔除周圍的肌肉和韌帶。將樣本放置于Micro-CT儀內(nèi)，進行掃描及圖像重構。具體檢測參數(shù)如下：骨密度（BMD）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）和骨小梁間距（Tb.Sp）。

1.5 血清β-CTX和Trap5b水平檢測 采用ELISA法。造模8周后，摘除小鼠眼球取全血約0.8 ml。靜置2 h后，4℃1 500 r/min離心30 min，取上清液0.4 ml。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清β-CTX和Trap5b水平。

1.6 Trap染色及定量分析 掃描完畢后，將股骨組織置于4%多聚甲醛中固定48～72 h。隨后將樣本進行脫鈣、脫水及石蠟包埋處理，制作成3μm厚的石蠟切片。完成脫蠟復水后，按照Trap染色試劑盒操作手冊，先后將切片置于Trap孵育液反應60 min和甲基綠染液染色3 min。純水清洗，95%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，透明樹脂封片。使用骨形態(tài)計量儀對破骨細胞數(shù)量和骨小梁面積分數(shù)進行定量分析。

1.7 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達水平檢測 采用qRT-PCR法。獲取小鼠左側股骨，PBS反復清洗3遍，采用Trizol法萃取總mRNA。根據(jù)核酸檢測試劑盒操作手冊，獲取建立10μl反應體系，并置于PCR儀中進行熒光定量檢測。RANKL上游引物：5'-CCTGAGACTCCATGAAAACGC-3'， 下 游 引 物 ：5'-TAACCCTTAGTTTTCCGTTGC-3'；OPG 上 游 引 物 ：5'-TCCTGCCACCTACCTAAAACAGCA-3'，下游引物：5'-CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG-3'。循環(huán)參數(shù)設置：預變性95℃ 5 min，變性 95℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s；循環(huán)33次。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠Micro-CT骨微結構參數(shù)結果比較 與假手術組比較，模型組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均減少，Tb.Sp增寬，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；葛根素治療組Tb.N減少，Tb.Sp增寬，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，葛根素治療組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N均增加，Tb.Sp變窄，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05），見表 1。

表1 3組小鼠Micro-CT骨微結構參數(shù)結果比較

2.2 3組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比較 與假手術組比較，模型組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 3組小鼠血清β-CTX和Trap5b水平比較

2.3 3組小鼠Trap染色及骨組織形態(tài)定量分析結果比較 Trap染色結果顯示：模型組小鼠骨小梁結構稀疏、紊亂，部分骨質(zhì)斷裂，破骨細胞數(shù)量增加；葛根素治療組小鼠骨小梁增粗變壯，破骨細胞數(shù)量減少，見圖1（插頁）。骨組織形態(tài)定量分析結果顯示：與假手術組比較，模型組小鼠破骨細胞數(shù)量增加，骨小梁面積分數(shù)減小，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠破骨細胞數(shù)量減少，骨小梁面積分數(shù)變大，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 3組小鼠骨組織形態(tài)定量分析結果比較

圖1 3組小鼠股骨病理檢查所見[a：假手術組；b：模型組；c：葛根素治療組；破骨細胞呈現(xiàn)紅色（由黑色箭頭標記），骨小梁呈現(xiàn)綠色；抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）染色，×100]

2.4 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達水平比較 與假手術組比較，模型組小鼠股骨組織RANKL mRNA表達水平升高，OPG mRNA表達水平、OPG/RANKL比值均降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；與模型組比較，葛根素治療組小鼠股骨組織RANKL mRNA表達水平降低，OPG mRNA表達水平、OPG/RANKL比值均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 3組小鼠股骨組織RANKL和OPG mRNA表達水平比較

3 討論

骨骼是一類動態(tài)的活性組織，即成骨細胞介導骨形成與破骨細胞介導骨吸收時刻處于動態(tài)平衡，使骨組織不斷更新，以維持骨骼的強度和彈性[11]。雌激素缺乏會持續(xù)激活破骨細胞，打破成骨-破骨耦聯(lián)平衡，使骨的吸收遠大于骨的形成，最終導致PMOP的發(fā)生、發(fā)展。

RANKL/RANK/OPG信號通路在破骨細胞活化及骨吸收中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12]。RANKL與破骨細胞表面上的RANK結合，促進其分化、成熟和活化，并抑制其凋亡。OPG可競爭性阻止RANKL與RANK的結合，起負調(diào)節(jié)作用，抑制破骨細胞的骨吸收。OPG/RANKL比值能夠有效地反映骨重建過程中破骨細胞的骨吸收功能，是評估成骨-破骨耦聯(lián)平衡重要的依據(jù)[13]。研究表明敲除RANKL基因或過表達OPG基因，會抑制骨的吸收，顯著增強機體骨量[14-15]。因此，RANKL/RANK/OPG信號通路是防治PMOP重要的分子靶點。

葛根素是中藥葛根主要的成分，其分子結構與雌激素相似，具有雌激素樣活性，能夠提高機體的BMD和骨量。但與雌激素不同，葛根素不會增加乳腺癌、子宮癌等發(fā)生風險，具有成為理想抗PMOP藥物的潛力。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，葛根素通過調(diào)控RANKL/RANK/OPG信號通路，可影響破骨前體細胞的增殖、分化和成熟[5，16]。由此提示，葛根素能夠有效緩解PMOP極有可能是通過作用于RANKL/RANK/OPG信號通路，進而抑制破骨細胞的骨細胞功能實現(xiàn)的。

本研究應用成熟的去卵巢小鼠模型來模擬婦女PMOP的生理狀態(tài)。Micro-CT結果顯示：模型組小鼠BMD下降，骨微結構破壞明顯，提示PMOP小鼠模型成功建立。葛根素能夠有效減少去卵巢小鼠骨量丟失，緩解PMOP的進展。血清ELISA結果顯示：模型組小鼠血清中β-CTX和Trap5b水平增加，提示骨吸收增強；葛根素能夠有效降低去卵巢小鼠β-CTX和Trap5b水平，抑制破骨細胞的骨吸收。Trap染色結果顯示：造模組小鼠存在大量的破骨細胞，骨小梁稀疏、破壞；葛根素治療后，破骨細胞的數(shù)量減少，骨小梁變壯增粗。上述結果提示：葛根素治療去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松可能是通過抑制破骨細胞介導的骨吸收過程實現(xiàn)的。進一步qRTPCR結果顯示：去卵巢造模后，小鼠股骨RANKL mRNA表達水平升高，OPG mRNA表達水平、OPG/RANKL比值降低，可導致破骨細胞數(shù)量增加、活性增強。葛根素能夠促進OPG表達，降低RANKL表達，改善OPG/RANKL比值，抑制破骨細胞的形成和吸收功能。

綜上所述，葛根素可以促進骨組織中OPG表達，抑制RANKL表達，降低OPG/RANKL比值，從而抑制破骨細胞的功能，防治去卵巢小鼠骨量丟失和骨微結構破壞。但本研究尚存在若干不足：（1）本研究未通過細胞實驗來進一步明確葛根素對破骨細胞的體外分化及活性的影響；（2）動物實驗過程中未增設高、中、低劑量組來明確葛根素的最佳藥物濃度；（3）整個實驗主要從骨吸收角度研究葛根素抗骨質(zhì)疏松療效及作用機制，缺少其對成骨細胞及骨形成影響的論述。