多囊卵巢綜合征顆粒細胞線粒體功能障礙的研究進展

宋琳奕，俞瑾，俞超芹*

1中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院中醫(yī)科，浙江寧波 315000；2海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)婦科，上海 200433

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡女性常見的內(nèi)分泌、代謝紊亂性疾病，其對生殖力的影響貫穿于整個生育期[1]，臨床上主要表現(xiàn)為卵泡發(fā)育異常、排卵障礙及流產(chǎn)等[2-3]，根據(jù)不同的人群及診斷標(biāo)準(zhǔn)，其患病率為5%～15%[4]。PCOS是無排卵性不孕的最常見病因，占無排卵性不孕的70%[5]。PCOS患者的卵泡發(fā)育障礙主要表現(xiàn)為竇前卵泡過多、竇狀卵泡生長障礙及卵泡閉鎖等?；颊唠p側(cè)卵巢雖有大量竇卵泡，但不能周期性形成優(yōu)勢的成熟卵泡是導(dǎo)致不孕的重要原因。同時，PCOS患者行體外受精移植(in-vitrofertilization-embryo transfer，IVF-ET)時，雖然獲卵數(shù)目明顯增加，但卵母細胞質(zhì)量通常不佳，從而導(dǎo)致移植周期取消率高及受精率低[6]。

全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome wide association study，GWAS)及對核基因組進行的其他研究未能為PCOS發(fā)病的精確機制提供相關(guān)線索，而越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙可能是卵泡發(fā)育障礙的重要原因之一[7-8]。本文對近年來PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的相關(guān)研究進展進行綜述，以探討PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的發(fā)生機制及其改善途徑和方法。

1 線粒體功能與卵泡發(fā)育

線粒體是重要的細胞器之一，含量較為豐富，是細胞代謝的重要場所。線粒體由內(nèi)膜、外膜、膜間隙及基質(zhì)等構(gòu)成。其中，線粒體內(nèi)膜深度內(nèi)陷形成線粒體嵴，為線粒體中各種呼吸鏈復(fù)合物及各種脂類合成代謝相關(guān)酶提供附著位點及反應(yīng)場所。線粒體在決定生殖過程的眾多因素中起關(guān)鍵作用，如卵母細胞質(zhì)量、卵泡生長發(fā)育和顆粒細胞增殖等[9]。線粒體還介導(dǎo)多種細胞過程，包括細胞凋亡、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)調(diào)控、鈣信號傳導(dǎo)，以及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、嘧啶、鐵硫蛋白(iron sulfur proteins，F(xiàn)e-S)的合成等[10]。

線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)是獨立于細胞核之外的遺傳物質(zhì)，可以完整地傳達遺傳信息。mtDNA是一種具有16 569個堿基對的閉合雙鏈環(huán)狀分子，編碼22個轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)，以及獨立的D-loop區(qū)，兩個核糖體RNA(rRNA，12S和16S)和13個氧化磷酸化蛋白亞單位。mtDNA損傷或突變都可能誘導(dǎo)線粒體功能障礙，從而影響能量的產(chǎn)生以及組織、器官的功能[11]。

線粒體是卵母細胞質(zhì)中含量最為豐富的細胞器，幾乎提供了卵母細胞生命活動中的全部能量。線粒體是胚胎內(nèi)數(shù)量最多的母系嫡傳細胞器，胚胎中的線粒體全部來自于卵母細胞，卵子內(nèi)線粒體的數(shù)量及功能與胚胎質(zhì)量密切相關(guān)[12]。

線粒體在顆粒細胞中的含量也非常豐富，參與了顆粒細胞的細胞周期、代謝及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的調(diào)節(jié)[13]。顆粒細胞線粒體可通過能量代謝途徑為卵母細胞減數(shù)分裂、受精直至早期胚胎發(fā)育提供能量支持[14]，也為甾體激素如孕酮、雄激素、雌激素等的合成提供能量支撐[15]。線粒體發(fā)生異?？捎绊懠毎恼９δ埽踔琳T導(dǎo)細胞死亡。有學(xué)者對3名婦女凍存的卵巢組織原始卵泡和初級卵泡中的顆粒細胞轉(zhuǎn)錄組進行類比研究發(fā)現(xiàn)，在來自原始卵泡的顆粒細胞中，包括編碼自由基清除劑過氧化物還原酶5(PRDX5)及硫氧化還原蛋白2(TXN2)等在內(nèi)的30個基因與線粒體功能障礙相關(guān)，提示原始卵泡顆粒細胞發(fā)育過程中有大量的能量產(chǎn)生和自由基清除，其線粒體功能障礙將影響原始卵泡的進一步發(fā)育，推測這可能是PCOS形成的潛在機制之一[16]。

2 卵巢顆粒細胞與卵泡發(fā)育

卵母細胞、顆粒細胞和卵泡膜細胞是卵泡的主要組成部分。卵泡發(fā)育是一個復(fù)雜的生理過程，顆粒細胞的生長分化是其重要標(biāo)志。生長期卵泡的發(fā)育及卵泡閉鎖是通過受體介導(dǎo)途徑調(diào)控的，顆粒細胞自分泌及旁分泌的物質(zhì)可促進顆粒細胞增殖及卵泡生長[17]，同時顆粒細胞與膜細胞的相互作用是卵泡發(fā)育和維持正常功能的重要條件，因此，顆粒細胞在原始卵泡的啟動和生長發(fā)育中起著重要的調(diào)控作用[18]，顆粒細胞代謝、生長分化及凋亡率的改變與卵泡發(fā)育成熟或閉鎖息息相關(guān)，甚至可能影響胚胎的質(zhì)量及最終的受孕結(jié)果[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，顆粒細胞線粒體質(zhì)量下降，及其結(jié)構(gòu)、功能和mtDNA拷貝數(shù)量異常是卵泡發(fā)育障礙的重要原因之一[20-21]。

3 卵巢顆粒細胞線粒體功能與卵母細胞質(zhì)量

目前，在生殖醫(yī)學(xué)中，多基于胚胎形態(tài)(如形態(tài)計量及形態(tài)分析等)及反映胚胎活力的發(fā)育動力學(xué)指標(biāo)評估卵母細胞質(zhì)量[22]。然而，上述評估標(biāo)準(zhǔn)的信息量非常有限，且很難在不改變其完整性的情況下進行研究，操作上仍存在局限性[23]，因此，目前研究者正試圖探索其他可靠的、非侵入性的可提示胚胎功能的生物標(biāo)志物[24]。

研究卵母細胞周圍的微環(huán)境如壁層顆粒細胞、卵丘細胞、卵泡液，以及其與臨床參數(shù)的相關(guān)性具有重要意義[25]。人類在胎兒期就已形成始基卵泡儲備，顆粒細胞自始基卵泡時期就圍繞在卵母細胞周圍，與卵母細胞處于同一卵泡環(huán)境中，兩者之間通過緊密接觸和縫隙連接進行物質(zhì)交換及信息溝通，因而研究顆粒細胞的功能可以反映卵母細胞的發(fā)育和質(zhì)量[26-27]。卵母細胞在氧化磷酸化過程中合成ATP的底物丙酮酸鹽即是由顆粒細胞提供的。丙酮酸鹽是顆粒細胞葡萄糖糖酵解過程中產(chǎn)生的中間代謝物。由于顆粒細胞相對容易獲取，且可間接反映卵母細胞質(zhì)量，因此，著眼于卵巢顆粒細胞的研究被認(rèn)為是評價卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛力的最佳無創(chuàng)性方法之一[28-29]。

顆粒細胞線粒體作為能量代謝途徑的關(guān)鍵因素，直接參與了卵泡發(fā)生過程中卵母細胞功能的建立[13]。因此，線粒體功能對于顆粒細胞的能量生產(chǎn)，進而作為卵母細胞成熟的能量來源是至關(guān)重要的。將顆粒細胞線粒體作為評估卵母細胞質(zhì)量的指標(biāo)有一定的可行性及可操作性[30]。

研究表明，PCOS患者卵母細胞有低糖酵解活性，并優(yōu)先攝取顆粒細胞提供的能量底物來維持能量平衡[31]。顆粒細胞功能失調(diào)可導(dǎo)致嚴(yán)重的細胞損傷，影響卵母細胞成熟，最終使PCOS患者生成異常卵泡[32-33]及卵母細胞核成熟和受精率下降[34]。因此，顆粒細胞對維持卵母細胞的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。有研究指出，在PCOS患者的卵泡發(fā)生過程中，卵母細胞從氧化磷酸化到糖酵解的代謝轉(zhuǎn)化紊亂可歸因于顆粒細胞的線粒體功能障礙[32]。

4 PCOS顆粒細胞線粒體功能障礙的發(fā)生機制

4.1mtDNA拷貝數(shù)改變 PCOS患者mtDNA拷貝數(shù)異常及線粒體基因突變一直是研究的重點，而功能性線粒體疾病已逐漸被視為PCOS發(fā)病的相關(guān)因素[35]。

mtDNA拷貝數(shù)是衡量線粒體數(shù)量的相對指標(biāo)。維持mtDNA拷貝數(shù)對于保持線粒體功能和細胞生長至關(guān)重要[36]。在卵母細胞成熟過程中，mtDNA不斷復(fù)制，發(fā)育至成熟卵母細胞時其拷貝數(shù)已增加30倍以上[37]，通常包含至少1×105個mtDNA拷貝，這是正常卵泡發(fā)育和成熟所必需的[38]。

Wang等[39-40]研究糖尿病小鼠間接提示了周圍顆粒細胞mtDNA與卵母細胞具有相關(guān)性；同樣的結(jié)果也在豬模型的研究中得到驗證[41-42]。在對人類的研究中已證實顆粒細胞mtDNA含量與相應(yīng)卵母細胞的mtDNA含量、胚胎質(zhì)量之間存在相關(guān)性，提示顆粒細胞可能通過提高卵母細胞質(zhì)量，改善卵泡發(fā)育，從而支持足夠的胚胎發(fā)育[43-44]。mtDNA拷貝數(shù)可評估卵母細胞和胚胎發(fā)育的潛能[45-46]。

線粒體拷貝數(shù)目前多采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)進行檢測，后者是一種敏感且較為成熟的檢驗技術(shù)[47-48]。Reddy等[33]發(fā)現(xiàn)在PCOS女性中mtDNA拷貝數(shù)明顯減少。而mtDNA拷貝數(shù)減少可導(dǎo)致mtDNA編碼基因的線粒體功能障礙，使ROS生成增加及PCOS進一步發(fā)展[3,49]。Lewis等[50]發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的mtDNA拷貝數(shù)較正常女性低，且mtDNA拷貝數(shù)與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)水平、腰圍和三酰甘油水平呈負相關(guān)，與性激素結(jié)合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)水平呈正相關(guān)。Ogino等[51]通過檢測卵丘顆粒細胞mtDNA拷貝數(shù)對體外受精過程中的胚胎質(zhì)量進行預(yù)測，其陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值分別為84.4%和82.1%，因此提出顆粒細胞mtDNA可作為預(yù)測胚胎存活率的生物標(biāo)志物。

4.2mtDNA突變 mtDNA較核DNA(nucleus deoxyribonucleic acid，nDNA)更容易受到氧化損傷，并存在更高的突變率，可能的原因包括mtDNA的表達、維持、拷貝數(shù)調(diào)節(jié)及修復(fù)過程依賴于核基因組[52]，缺乏自身保護組蛋白，缺乏有效的DNA修復(fù)能力，以及與電子呼吸鏈關(guān)系密切而接觸到了更多的氧自由基等[33]。

線粒體轉(zhuǎn)運RNA(mitochondrial transfer RNA，mt-tRNA)的突變破壞了mtDNA的結(jié)構(gòu)和功能，影響了mt-tRNA的穩(wěn)態(tài)水平和氨基酰化能力，可能導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)合成缺陷，從而抑制呼吸鏈功能，并導(dǎo)致ATP合成減少和ROS生成增加[53]，可能與PCOS患者線粒體功能障礙的發(fā)生機制有關(guān)。Goto等[54]在PCOS患者外周血中發(fā)現(xiàn)mt-tRNA基因、12S和16S rRNA基因存在變異，這些突變出現(xiàn)在高度保守的tRNA核苷酸中，因此提出mtDNA編碼mttRNA的基因點突變可能與疾病的發(fā)展有關(guān)。Ding等[55]對中國一個有遺傳性IR的漢族家系進行了研究觀察，對其線粒體進行基因組序列分析，此家族中第三代為PCOS患者，全線粒體基因組序列分析結(jié)果顯示，在tRNALeu(UUR)基因的受體臂中存在同源A3302G，此突變破壞了高度保守的堿基配對(2T-71A)。隨后該團隊繼續(xù)對該家系進行線粒體基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)存在同質(zhì)ND5 T12338C和tRNASer (UCN) C7492T突變，其中同源C7492T突變發(fā)生在tRNASer(UCN)編碼基因的反密碼子干26位[56]，影響了tRNA的穩(wěn)態(tài)水平和氨基?；芰?；之后再通過對80例PCOS合并IR女性患者與健康對照組進行mt-tRNA突變檢測，篩選出可能與PCOS合并IR相關(guān)的9個mt-tRNA突變，提出這些突變改變了mt-tRNA的二級結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致mt-tRNA功能障礙[57]。Ding等[58]發(fā)現(xiàn)，PCOS患者存在線粒體基因tRNALeu中的C3275T突變，tRNAGln的反密碼子干中的T4363C突變，以及tRNALys的A8343G突變；生化分析結(jié)果顯示，這些mt-tRNA突變患者的線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)水平、ATP產(chǎn)量及mtDNA拷貝數(shù)均降低，但ROS生成增加，提示這些突變可能導(dǎo)致線粒體功能障礙，進而出現(xiàn)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。Saeed等[49]對PCOS患者的mt-tRNA進行測序并與修正劍橋序列進行比對，證實了上述觀點，且新發(fā)現(xiàn)了mt-tRNALeu(UUR)基因不同類型的突變。

mtDNA D-loop區(qū)是線粒體基因組中唯一的非編碼區(qū)，包含了mtDNA重鏈和輕鏈復(fù)制的起點和啟動子；該區(qū)域突變可通過改變mtDNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，而使線粒體功能發(fā)生障礙[59]。Reddy等[33]對南印度PCOS患者與對照組的線粒體D-loop進行測序，發(fā)現(xiàn)D310及A189G單核苷酸多態(tài)性(SNPs)與PCOS之間存在明顯的相關(guān)性，攜帶D310和A189G等位基因的PCOS患者mtDNA拷貝數(shù)明顯低于非攜帶者。

這些結(jié)果表明，PCOS的臨床表型可能與上述突變引起的線粒體功能障礙有關(guān)，但要進一步探討mt-tRNA異常的臨床意義，闡明mt-tRNA突變與PCOS之間的關(guān)系，仍需進行多種族和多中心的深入研究。

5 改善PCOS顆粒細胞線粒體功能的方法

已有團隊在此方面進行了嘗試和探索。Safaei等[60]對脫氫表雄酮(dehydroepiandrosterone，DHEA)誘導(dǎo)培養(yǎng)的PCOS小鼠顆粒細胞研究發(fā)現(xiàn)，采用維生素D3治療的PCOS小鼠中，線粒體生物起源基因過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxlsome proliferator-activated receptor-γ coactlvator-1α，PGC-1α)、核呼吸因子(nuclearrespiratoryfactors，NRFs)、抗氧化劑基因超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、過氧化氫酶(CAT)及抗凋亡基因Bcl-2表達上調(diào)，同時ROS水平降低，提示維生素D3可能通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路來改善線粒體的生物起源基因。此外，該團隊還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)維生素D3處理的PCOS小鼠顆粒細胞mtDNA拷貝數(shù)明顯高于未經(jīng)處理的PCOS顆粒細胞，提示維生素D3可能通過促進PCOS小鼠顆粒細胞線粒體生物合成及細胞膜完整性，增加mtDNA拷貝數(shù)，從而改善卵泡發(fā)育，進而提高卵母細胞的質(zhì)量[61]。

Salehi等[62]對二氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)誘導(dǎo)培養(yǎng)的PCOS大鼠顆粒細胞進行研究發(fā)現(xiàn)，DHT誘導(dǎo)的顆粒細胞動力蛋白相關(guān)蛋白1(Drp1)表達上調(diào)與PCOS大鼠顆粒細胞線粒體過度裂變、巨自噬及細胞凋亡有關(guān)，而外源性促性腺激素可誘導(dǎo)線粒體融合并減輕顆粒細胞的凋亡。

中醫(yī)藥是中華民族的瑰寶，中藥可通過多途徑、多靶點緩解PCOS患者的臨床癥狀，改善卵巢內(nèi)環(huán)境，促進卵泡生長發(fā)育，誘發(fā)排卵。蒼附導(dǎo)痰湯可通過抑制miR-29a靶向結(jié)合PGC-1α的3'端非翻譯區(qū)(3'-UTR)，促進PGC-1α及其下游的核呼吸因子-1抗原(nuclear respiratory factor-1，NRF-1)、雌激素受體相關(guān)受體α(estrogen-related receptor α，ERRα)的mRNA表達，從而促進線粒體生物合成、葡萄糖利用、脂肪酸氧化，并改善PCOS-IR大鼠卵巢顆粒細胞的IR狀態(tài)[63]。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，PCOS患者存在線粒體功能障礙及基因表達異常，而線粒體在生殖細胞中含量豐富，且相對容易獲取，故研究顆粒細胞的線粒體功能是探討PCOS的病理機制、評價卵母細胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛力的最佳無創(chuàng)性方法之一。然而，在PCOS患者顆粒細胞線粒體功能障礙的具體機制、與臨床表型之間的關(guān)系，以及篩選評估預(yù)后的特異性指標(biāo)等方面，目前尚缺乏系統(tǒng)研究，仍有待進一步探索。

在治療方面，線粒體替代或線粒體補充療法用于臨床改善PCOS的卵母細胞及胚胎質(zhì)量是否可行，因倫理爭議和異質(zhì)性風(fēng)險無法開展。目前，我們可以發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢，采用現(xiàn)代藥理學(xué)研究方法，探討中藥對PCOS顆粒細胞線粒體功能的調(diào)節(jié)作用，這對PCOS的治療具有重要的指導(dǎo)意義，也是中醫(yī)藥走向現(xiàn)代化的探索之路。