哺乳動(dòng)物卵泡相關(guān)代謝組學(xué)研究進(jìn)展

毛菲，馮睿芝，錢(qián)云

近年隨著生活環(huán)境、社會(huì)壓力等因素的改變，人群不孕不育的發(fā)病率越來(lái)越高[1]。我國(guó)目前有25%的育齡夫婦受到不孕不育的困擾[2]，輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）的發(fā)展為眾多不孕不育家庭帶來(lái)了希望。而輔助生殖周期的成功高度依賴(lài)于精卵質(zhì)量和胚胎質(zhì)量，其中卵母細(xì)胞質(zhì)量是決定妊娠結(jié)局的一項(xiàng)重要因素[3]。目前用于評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量的主要方法尚停留在形態(tài)學(xué)階段，但這些帶有主觀性的形態(tài)學(xué)指標(biāo)并不能完全代表卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力。新興的代謝組學(xué)研究有望為評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量提供新方法，已有研究證實(shí)不同狀態(tài)下的卵泡代謝存在較大差異[4-5]。卵母細(xì)胞周?chē)念w粒細(xì)胞及卵泡液作為卵母細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育微環(huán)境的重要組成部分，對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育都具有重要意義。充分了解卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞相關(guān)的代謝，篩選出標(biāo)志代謝物，有助于更好地評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量，提高妊娠率?，F(xiàn)綜述近年哺乳動(dòng)物卵泡代謝組學(xué)的研究進(jìn)展，探討卵泡細(xì)胞代謝的特點(diǎn)，以期為臨床不孕癥的診斷和治療提供新的思路。

1 代謝組學(xué)與女性生殖

代謝組學(xué)是指對(duì)中小分子物質(zhì)進(jìn)行定性和量化，被廣泛認(rèn)為是最接近表型和功能的組學(xué)。與基因和蛋白相比，代謝物更加容易獲得，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于篩選[6]。另外，代謝物位于基因功能的下游，能在生理水平上更好地衡量細(xì)胞活動(dòng)。由于代謝組學(xué)固有的敏感性，可以檢測(cè)到生物事件中細(xì)微的變化，它的出現(xiàn)為深入了解體內(nèi)各種生理、病理過(guò)程（包括疾病）提供了條件。

近年代謝組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，核磁共振技術(shù)（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 技 術(shù)（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）已被廣泛應(yīng)用于女性生殖方面。目前與女性生殖相關(guān)的代謝組學(xué)研究對(duì)象主要包括卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡液、卵母細(xì)胞培養(yǎng)液、胚胎培養(yǎng)液和子宮內(nèi)膜液等。多種女性生殖相關(guān)疾病如多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）、肥胖和子宮內(nèi)膜異位癥等引起的不孕已被證實(shí)與一些差異代謝物有關(guān)[4，7-8]。因此，代謝組學(xué)在尋找女性不孕相關(guān)機(jī)制、篩選標(biāo)志物和臨床診斷方面均有廣泛的應(yīng)用前景。

2 卵泡相關(guān)代謝組學(xué)研究

女性出生時(shí)卵巢原始卵泡池已存在，阻滯在第一次減數(shù)分裂（meiosisⅠ，MⅠ）前期的初級(jí)卵母細(xì)胞被單層梭形的前顆粒細(xì)胞和基底膜包繞形成原始卵泡，這是女性生殖的基本單位，也是卵母細(xì)胞的儲(chǔ)備形式。部分原始卵泡因刺激激活后形成初級(jí)卵泡，其周?chē)幸粚恿⒎叫蔚念w粒細(xì)胞[9]。在顆粒細(xì)胞層逐漸增加后形成次級(jí)卵泡。在卵泡增大的過(guò)程中，卵泡內(nèi)逐漸形成卵泡腔。當(dāng)卵泡腔達(dá)到一定大小時(shí)，在促性腺激素的刺激下，部分卵泡發(fā)生排卵。此時(shí)的卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，排出第一極體形成第二次減數(shù)分裂（meiosisⅡ，MⅡ）中期的卵母細(xì)胞，并在輸卵管中等待受精。

2.1 卵母細(xì)胞代謝組學(xué)研究研究表明卵泡的代謝會(huì)隨著卵泡的發(fā)育進(jìn)展而動(dòng)態(tài)變化[5，10-11]。卵母細(xì)胞質(zhì)量是決定妊娠成功與否的關(guān)鍵因素，充分了解其本身的代謝情況對(duì)篩選優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞至關(guān)重要。然而，由于代謝組學(xué)研究需要大量的樣本，而卵母細(xì)胞取材相對(duì)困難，因此針對(duì)卵母細(xì)胞本身的代謝組學(xué)研究相對(duì)較少，近年才有所發(fā)展。

為獲得卵母細(xì)胞本身發(fā)育過(guò)程中的完整代謝圖譜，Li等[5]首次對(duì)處于生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期、生發(fā)泡破裂（GV breakdown，GVBD）期和MⅡ期的卵母細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)分析。研究者主要聚焦于脂質(zhì)代謝，發(fā)現(xiàn)兩種完全不同的脂質(zhì)代謝模式。與未成熟的GV期卵母細(xì)胞相比，GVBD期的卵母細(xì)胞中肉堿和棕櫚酰肉堿的水平顯著升高，而其他大多數(shù)脂質(zhì)代謝相關(guān)產(chǎn)物（即花生四烯酸、二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸等）隨著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程而減少[5]。脂肪酸β-氧化被認(rèn)為對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的成熟具有重要意義，肉堿和棕櫚酰肉堿是β-氧化的相關(guān)代謝物，肉堿是將脂肪酸從細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)骄€粒體的必需物質(zhì)，其抗氧化作用也有益于卵母細(xì)胞的發(fā)育，具有調(diào)節(jié)女性生殖系統(tǒng)氧化代謝狀態(tài)的功能[12]。補(bǔ)充左旋肉堿已被證明可以改善衰老、PCOS和子宮內(nèi)膜異位癥等生殖相關(guān)因素引起的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降[13-15]，顯著改善輔助生殖的妊娠結(jié)局[16]。因此，有學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了深入研究，蛋白質(zhì)組學(xué)顯示在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ水平顯著上調(diào)，脂肪酸降解相關(guān)酶在MⅡ期卵母細(xì)胞中也顯著增高[5]，表明在小鼠卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中脂肪酸的利用增強(qiáng)。相反，在培養(yǎng)液中添加花生四烯酸會(huì)影響卵母細(xì)胞紡錘體形成和染色體排列，從而阻礙其成熟[5]。二十烷類(lèi)化合物由花生四烯酸合成，用于合成前列腺素和白三烯，促進(jìn)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，氨基酸代謝也發(fā)生了顯著變化，絲氨酸、谷氨酸和組氨酸的含量在減數(shù)分裂恢復(fù)期顯著增加，在成熟卵母細(xì)胞中減少[5]。研究表明一方面卵母細(xì)胞可利用絲氨酸合成谷胱甘肽以減少氧化應(yīng)激；另一方面，絲氨酸可用于卵母細(xì)胞的一碳代謝以合成核苷酸[5，17]。研究已知在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，碳水化合物代謝逐漸增強(qiáng)，主要富集于三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA循環(huán)）和磷酸戊糖途徑[5]。TCA循環(huán)在卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），用于紡錘體的組裝和染色體的運(yùn)動(dòng)。該研究中，糖酵解相關(guān)代謝物和相關(guān)酶的水平未發(fā)生明顯變化，相比之下，磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸和葡萄糖酸內(nèi)酯在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中增加了約30倍，葡萄糖醛酸增加約10倍，降低關(guān)鍵酶的表達(dá)后卵母細(xì)胞發(fā)育停滯，證實(shí)了磷酸戊糖途徑對(duì)于卵母細(xì)胞發(fā)育具有重要作用[5]。而Xie等[18]發(fā)現(xiàn)與敲低3-磷酸甘油醛脫氫酶相比，敲低卵丘細(xì)胞中的磷酸戊糖途徑關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶后，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降更加顯著。因此，相比較于糖酵解途徑，磷酸戊糖途徑可能對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟具有更加重要的作用[5，18]。Li等[5]建立了整個(gè)卵母細(xì)胞在體內(nèi)成熟期間的時(shí)間代謝圖譜，并利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究以支持代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)的研究提供了一個(gè)有力的理論支持。

2.2 顆粒細(xì)胞代謝組學(xué)研究卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的雙向通信對(duì)于卵母細(xì)胞正常生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。一方面卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞可以通過(guò)縫隙連接直接與卵母細(xì)胞相連，為兩者之間的分子交換提供條件；另一方面兩種細(xì)胞均會(huì)產(chǎn)生旁分泌因子來(lái)調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)和顆粒細(xì)胞的增殖與分化。由于顆粒細(xì)胞在臨床取樣過(guò)程中易獲得，收集顆粒細(xì)胞進(jìn)行代謝標(biāo)志物的檢測(cè)不會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量造成損傷。因此，對(duì)顆粒細(xì)胞代謝的進(jìn)一步研究有望為無(wú)創(chuàng)評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量提供新方法。

卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞在代謝上存在重要的協(xié)同作用[10，19]。Uhde等[10]認(rèn)為卵母細(xì)胞在卵丘細(xì)胞存在的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)后，卵母細(xì)胞的發(fā)育潛力更高，而卵丘細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物肉堿可能是其中一項(xiàng)關(guān)鍵因素。Li等[5]的研究證實(shí)在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的過(guò)程中，卵母細(xì)胞中的肉堿含量升高，卵丘細(xì)胞能夠分泌關(guān)鍵的代謝產(chǎn)物以滿足卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的需求。另有研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞中的TCA循環(huán)中間體隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，而培養(yǎng)液中的這些成分卻隨時(shí)間增加[10]。牛卵母細(xì)胞在與草酰乙酸和蘋(píng)果酸共培養(yǎng)體外成熟時(shí)，MⅡ期卵母細(xì)胞的比例會(huì)顯著增加[20]。因此，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞還可以向卵母細(xì)胞提供草酰乙酸、蘋(píng)果酸等氧化代謝中間體，維持氧化還原平衡，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。為滿足體外培養(yǎng)條件下卵母細(xì)胞的需求，卵丘細(xì)胞還會(huì)調(diào)節(jié)自身代謝，升高糖酵解比例，增加脂質(zhì)的合成，減少脂質(zhì)的氧化，提高氨基酸的合成來(lái)滿足卵母細(xì)胞的代謝需求[19]。綜上，卵丘細(xì)胞在卵母細(xì)胞體外成熟的過(guò)程中，通過(guò)代謝協(xié)同作用為卵母細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)有利的微環(huán)境，并為卵母細(xì)胞后續(xù)的發(fā)育提供能量和其他的小分子物質(zhì)，它們之間存在復(fù)雜的相互作用。

2.3 卵泡液代謝組學(xué)研究在人類(lèi)輔助生殖周期中，雖然會(huì)根據(jù)個(gè)體差異選擇不同的促排卵方案，但仍會(huì)出現(xiàn)卵泡發(fā)育不一致、大小差異較大的情況。既往研究認(rèn)為大卵泡中獲得的卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能高于小卵泡中的卵母細(xì)胞，因此臨床取卵時(shí)應(yīng)選擇相對(duì)較大的卵泡[21]。然而，近年越來(lái)越多的研究者認(rèn)為卵泡的大小與卵母細(xì)胞的受精率及胚胎發(fā)育率無(wú)明顯相關(guān)性[22-23]。因此，單純通過(guò)卵泡大小來(lái)判斷卵母細(xì)胞質(zhì)量缺乏可靠依據(jù)。卵泡液由血漿通過(guò)血液卵泡屏障轉(zhuǎn)移的小分子物質(zhì)、顆粒細(xì)胞以及膜細(xì)胞分泌的代謝物組成，為卵母細(xì)胞發(fā)育提供了微環(huán)境?？梢院侠淼卣J(rèn)為，卵泡液的某些生化標(biāo)志物可以反映卵母細(xì)胞質(zhì)量、受精能力及隨后的胚胎發(fā)育潛能。由于卵泡液獲取方法相對(duì)簡(jiǎn)單，且不影響卵母細(xì)胞本身的質(zhì)量，尋找卵泡液中的代謝標(biāo)志物評(píng)估卵母細(xì)胞質(zhì)量將更有預(yù)測(cè)價(jià)值[24-26]。

卵泡液中的脂質(zhì)代謝物種類(lèi)繁多，近年來(lái)多項(xiàng)研究關(guān)注于脂質(zhì)相關(guān)代謝對(duì)于卵母細(xì)胞質(zhì)量的影響[11，25-26]。脂肪酸是脂質(zhì)的一種，對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量有重要影響。人卵泡液中最豐富的脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸[27]，棕櫚酸和硬脂酸為飽和脂肪酸，油酸、亞油酸為不飽和脂肪酸。研究表明培養(yǎng)液中添加高濃度的棕櫚酸會(huì)通過(guò)增加卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的脂質(zhì)和神經(jīng)酰胺，誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙，導(dǎo)致顆粒細(xì)胞的活力和增殖能力降低，繼而降低卵母細(xì)胞質(zhì)量[28-29]。在肥胖母馬的卵泡液中，硬脂酸濃度升高會(huì)抑制顆粒細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡[30]。而在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的卵泡液中，油酸的含量下降[31]，油酸能夠降低飽和脂肪酸對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的不利影響，且可以調(diào)節(jié)脂肪酸的代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，降低氧化應(yīng)激，從而促進(jìn)卵母細(xì)胞和植入前胚胎的發(fā)育[32]。因此，在卵泡液中，良好的飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例對(duì)卵母細(xì)胞的質(zhì)量至關(guān)重要。卵泡液中的類(lèi)固醇也被認(rèn)為對(duì)卵母細(xì)胞及隨后胚胎發(fā)育潛力具有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。邢亞楠等[33]研究發(fā)現(xiàn)，與小卵泡相比，母馬大卵泡的卵泡液中的類(lèi)固醇含量顯著上調(diào)，類(lèi)固醇激素是促使卵泡發(fā)育的主要代謝物。而脫氫表雄酮為類(lèi)固醇生物合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)，可轉(zhuǎn)化為更活躍的睪酮、雌二醇和雄烯二酮。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者的卵泡液中，脫氫表雄酮含量升高[31]，且被認(rèn)為與卵母細(xì)胞成熟率及優(yōu)質(zhì)胚胎率呈負(fù)相關(guān)[11]，對(duì)于妊娠結(jié)局具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。PCOS是育齡婦女最復(fù)雜和最普遍的內(nèi)分泌疾病之一[34]。一項(xiàng)類(lèi)固醇代謝組學(xué)研究顯示，PCOS患者卵泡液中類(lèi)固醇的合成普遍減少[35]。而Sun等[36]發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡液中游離脂肪酸、3-羥基壬酰肉堿和二十碳五烯酸水平顯著升高。Chen等[37]則認(rèn)為PCOS患者卵泡液中的膽固醇產(chǎn)物對(duì)卵母細(xì)胞質(zhì)量具有預(yù)測(cè)價(jià)值。因此，生殖相關(guān)疾病引起的代謝改變往往是一類(lèi)物質(zhì)，使用單一物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量的可靠性相對(duì)較低，多種脂質(zhì)代謝物聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于卵母細(xì)胞及隨后胚胎發(fā)育的預(yù)測(cè)價(jià)值較高，但仍需要進(jìn)一步研究以篩選出合適的標(biāo)志物。

除了脂質(zhì)，氨基酸也與生殖密切相關(guān)。對(duì)于繁殖能力低下的母豬，其卵泡液中精氨酸和脯氨酸濃度升高，而代謝產(chǎn)物減少，尿液中則完全相反，表明精氨酸和脯氨酸的利用率降低會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞發(fā)育受限，影響繁殖能力[38]。而在卵泡的發(fā)育過(guò)程中，為滿足卵母細(xì)胞逐漸增加能量的需求，氨基酸也能夠轉(zhuǎn)化為能源物質(zhì)以支持卵母細(xì)胞的發(fā)育。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶在牛卵丘細(xì)胞中具有較高的活性，能夠?qū)⑻於彼徂D(zhuǎn)化為草酰乙酸，進(jìn)入TCA循環(huán)[10]。天冬氨酸的濃度被證實(shí)與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，年輕女性卵泡液中的天冬氨酸水平顯著高于高齡女性[4]，其濃度的降低與繁殖力降低有關(guān)[38]。因此，天冬氨酸可能在卵母細(xì)胞能量代謝中起著重要作用，影響女性的生殖能力。另外，研究已證實(shí)纈氨酸和亮氨酸均能被卵母細(xì)胞消耗用以供能[39]。綜上，氨基酸在卵泡的生長(zhǎng)過(guò)程中具有多種功能，氨基酸水平降低可能預(yù)示著某些生殖相關(guān)疾病導(dǎo)致的卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。

卵泡液代表著卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的生存環(huán)境，由于其取材相對(duì)簡(jiǎn)單，較易獲得，相關(guān)研究較多，但仍未有一個(gè)統(tǒng)一的代謝物評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。因此，卵泡液中標(biāo)志物的選擇還有待進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)語(yǔ)

近年代謝組學(xué)正逐漸成為診斷和治療女性生殖相關(guān)疾病的重要方法，對(duì)卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的相關(guān)代謝研究有助于了解兩者各自的生理和病理狀態(tài)，卵泡液的代謝研究則展示了卵母細(xì)胞及顆粒細(xì)胞的共同代謝狀態(tài)及生存環(huán)境。由于代謝組學(xué)是最接近表型和功能的組學(xué)，且代謝物易獲得，眾多研究者希望從中尋找特殊代謝物質(zhì)來(lái)評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞質(zhì)量。然而，代謝組學(xué)研究需要的樣本量大，篩選出的代謝物種類(lèi)多，部分難以鑒別，致使目前代謝組學(xué)分析仍然是一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)。發(fā)展單細(xì)胞的代謝組學(xué)分析技術(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)的通用代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)將顯著提高對(duì)卵母細(xì)胞代謝的理解。因此，代謝組學(xué)的研究具有重要價(jià)值，發(fā)展新的代謝組學(xué)技術(shù)、提高代謝組學(xué)的研究效率，有望大幅提高輔助生殖的成功率，改善人群的生育率。