環(huán)狀RNA在多囊卵巢綜合征發(fā)生發(fā)展中的作用

皇靈俐，馮睿芝，錢云

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡婦女無排卵性不孕的常見病因，在世界范圍內(nèi)患病率約5%～20%[1]。PCOS是以無排卵或稀發(fā)排卵、高雄激素和卵巢多囊樣改變?yōu)樘卣鞯漠愘|(zhì)性綜合征，PCOS患者罹患不孕、胰島素抵抗和2型糖尿病、心血管疾病和子宮內(nèi)膜癌等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加。雖然PCOS的病因仍未完全明確，但研究認(rèn)為PCOS是多因素致病，其中遺傳因素在其發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是由真核生物的前體mRNA反向剪接產(chǎn)生的，具有細(xì)胞特異性和組織特異性。circRNA的產(chǎn)生依靠剪接體機(jī)制，且受順式作用元件和反式作用因子的調(diào)節(jié)[3]。隨著RNA測(cè)序技術(shù)和新型生物信息化方法的發(fā)展，最新的一些研究已在卵巢和胎盤等多種組織中檢測(cè)并鑒定出了豐富多樣的circRNA[4-5]，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的circRNA在PCOS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[6-7]，這促進(jìn)了PCOS與circRNA關(guān)系的研究。關(guān)于circRNA與PCOS發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究仍處于初步階段，現(xiàn)就目前circRNA在PCOS發(fā)病中可能的作用進(jìn)行綜述。

1 circRNA概述

circRNA是通過特殊的選擇性反向剪接方式產(chǎn)生的，即外顯子的3′端通過3′，5′-磷酸二酯鍵與其自身的5′端或上游外顯子連接，形成具有反向剪接連接位點(diǎn)的封閉環(huán)[8]。circRNA形成的剪接方式主要有2種：套索模型和直接反向剪接模型[9-10]。在套索模型中，反向剪接的外顯子跳躍形成內(nèi)含子套索，內(nèi)含子進(jìn)一步反向剪接形成circRNA。在直接反向剪接模型中，前體mRNA直接發(fā)生反向剪接形成circRNA。研究表明由外顯子形成的circRNA通常定位于細(xì)胞質(zhì)[11]，少數(shù)外顯子circRNA定位于細(xì)胞核，且細(xì)胞核內(nèi)circRNA的作用主要是為染色質(zhì)招募蛋白質(zhì)[12]。Li等[13]發(fā)現(xiàn)某些含有內(nèi)含子的circRNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，主要調(diào)節(jié)其親本基因表達(dá)。細(xì)胞外間隙中的外泌體中也發(fā)現(xiàn)circRNA的存在[14]，外泌體中的circRNA異常表達(dá)在疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，胃癌中的circRNA可以通過外泌體轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中，表明外泌體circRNA在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[15]。circRNA的表達(dá)水平一般較低，且具有細(xì)胞特異性和組織特異性[16]。Rybak-Wolf等[17]觀察到circRNA在哺乳動(dòng)物的大腦中顯著富集。Conn等[18]發(fā)現(xiàn)circRNA在人類上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等某些生物過程中也顯著富集。

雖然circRNA的表達(dá)量普遍較低，但circRNA可在分子水平上通過不同的作用方式在生理和病理?xiàng)l件下發(fā)揮潛在的重要作用。circRNA的生物功能：①circRNA通過形成RNA-DNA雜交體與宿主基因的合成位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄暫?；蚪K止，從而上調(diào)外顯子跳躍或截短的轉(zhuǎn)錄本水平。②外顯子-內(nèi)含子circRNA與U1小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein particles，snRNP）結(jié)合，然后與DNA聚合酶Ⅱ相互作用，增強(qiáng)親本基因的表達(dá)。③circRNA可作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）通過微小RNA（microRNA，miRNA）的反應(yīng)元件與miRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，間接調(diào)節(jié)miRNA靶向mRNA的表達(dá)。④circRNA可以與蛋白質(zhì)相互作用。⑤含有內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）的circRNA可以直接招募核糖體并被翻譯。⑥YTH結(jié)構(gòu)域家族蛋白3（YTH domain family protein 3，YTHDF3）可以識(shí)別含有N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine，m6A）的circRNA，YTHDF3招募真核翻譯起始因子4G2（eukaryotic initiation factor 4G2，eIF4G2），從而觸發(fā)翻譯。這一過程可被甲基轉(zhuǎn)移 酶 樣3/14（methyltransferase like protein 3/14，Mettl3/14）增強(qiáng)，被脂肪量和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity-associated，F(xiàn)TO）抑制[8]。見圖1[8]。

圖1 circRNA生物學(xué)功能[8]

2 circRNA在PCOS患者中的差異表達(dá)

高通量測(cè)序和基因芯片的迅速發(fā)展推動(dòng)了對(duì)circRNA在PCOS發(fā)病機(jī)制中的研究。為了研究circRNA的潛在作用，Wang等[19]對(duì)PCOS患者卵泡液外泌體中的RNA進(jìn)行了circRNA測(cè)序，共鑒定出167個(gè)上調(diào)和245個(gè)下調(diào)的circRNA，進(jìn)一步的功能分析表明，PCOS患者與細(xì)菌感染、慢性炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)的通路可能受不同的circRNA調(diào)節(jié)。Huang等[20]也研究了PCOS患者卵泡液外泌體中差異表達(dá)的circRNA，發(fā)現(xiàn)16個(gè)circRNA的表達(dá)具有顯著差異，并證實(shí)了其中的hsa_circ_0006877（circLDLR）對(duì)顆粒細(xì)胞的增殖、凋亡以及激素分泌均有影響。

更多學(xué)者對(duì)顆粒細(xì)胞中circRNA的表達(dá)譜進(jìn)行了研究。Che等[21]檢測(cè)了PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中circRNA的表達(dá)譜，共鑒定出1 032個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中311個(gè)表達(dá)上調(diào)，721個(gè)表達(dá)下調(diào)。該研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）方法對(duì)測(cè)序結(jié)果中表達(dá)下調(diào)的4個(gè)circRNA（包括hsa_circ_0083952、hsa_cic_0082709、hsa_circ_0002425和hsa_circ_0015168）進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示這4種circRNA在PCOS患者顆粒細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。Ma等[4]收集6例PCOS患者和6例因輸卵管因素等器質(zhì)性病變行輔助生殖技術(shù)患者（對(duì)照組）的顆粒細(xì)胞進(jìn)行circRNA基因芯片分析，結(jié)果鑒定出286個(gè)差異表達(dá)的circRNA（上調(diào)167個(gè)，下調(diào)119個(gè)），經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，PCOS組hsa_circ_0043533和hsa_circ_0043532的 表 達(dá) 水平顯著升高，hsa_circ_0097636的表達(dá)水平顯著降低；而Zhang等[22]在15例PCOS患者顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)4個(gè)circRNA上調(diào)，23個(gè)下調(diào)，后續(xù)qRT-PCR證實(shí)PCOS患者中hsa_circ_0001577基因表達(dá)上調(diào)，hsa_circ_0020093基因表達(dá)下調(diào)，提示這些circRNA參與了PCOS的發(fā)生發(fā)展，可能作為PCOS潛在生物標(biāo)志物。

另有學(xué)者認(rèn)為，PCOS孕婦的病理生理可能會(huì)導(dǎo)致胎兒表觀遺傳在子宮的重新編程，從而導(dǎo)致其后代生殖功能的異常[23]。Zhao等[5]發(fā)現(xiàn)，與正常產(chǎn)婦相比，PCOS患者的胎盤胎兒面組織中的circRNA有14個(gè)顯著上調(diào)，101個(gè)顯著下調(diào)。

3 circRNA異常表達(dá)在PCOS發(fā)病機(jī)制中的研究

3.1 circLDLR雄激素的產(chǎn)生受細(xì)胞色素P450家族19亞 家 族A成 員1（cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1，CYP19A1）基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，CYP19A1編碼細(xì)胞色素P450芳香化酶。在卵巢中，芳香化酶負(fù)責(zé)將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，其在PCOS卵母細(xì)胞發(fā)育障礙中發(fā)揮重要作用[24]。研究證明，在PCOS患者的卵巢組織中，CYP19A1的表達(dá)水平較低，卵巢芳香化酶活性和雌二醇產(chǎn)生減少[25]。

已有研究表明，circRNA通過與CYP19A1的相互作用在PCOS的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Huang等[20]比較了PCOS患者和因輸卵管因素等器質(zhì)性病變行輔助生殖技術(shù)助孕患者（對(duì)照組）卵泡液外泌體中的circRNA表達(dá)譜，結(jié)果顯示16個(gè)circRNA表達(dá)差異顯著，其中下調(diào)的circLDLR是從其親本低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）基因加工而來，該基因參與了卵巢類固醇合成調(diào)節(jié)。該研究通過Cytoscape軟件預(yù)測(cè)了circLDLR-miR-1294-CYP19A1 ceRNA網(wǎng)絡(luò)，并通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circLDLR是miR-1294的分子海綿。人卵巢顆粒細(xì)胞瘤KGN細(xì)胞過表達(dá)circLDLR伴隨著miR-1294的下調(diào)、CYP19A1蛋白表達(dá)上調(diào)和雌二醇分泌增加；circLDLR水平下調(diào)導(dǎo)致miR-1294上調(diào)、CYP19A1蛋白表達(dá)下調(diào)以及雌二醇分泌減少。同時(shí)，轉(zhuǎn)染miR-1294類似物可以挽救KGN細(xì)胞外泌體中circLDLR的下調(diào)對(duì)CYP19A1表達(dá)和活性的影響?；诜枷慊冈谛奂に剞D(zhuǎn)化為雌二醇過程中發(fā)揮重要作用，circLDLR基因的異常表達(dá)可能是PCOS患者高雄激素血癥的重要發(fā)病機(jī)制之一。

可見，卵泡液中外泌體circRNA的變化可能是導(dǎo)致PCOS發(fā)生的重要原因，circLDLR通過海綿吸附miR-1294抑制CYP19A1而發(fā)揮調(diào)節(jié)雌二醇分泌的作用，參與了卵巢類固醇激素的合成，為進(jìn)一步治療PCOS提供新的靶點(diǎn)和策略。

3.2 hsa_circ_0118530顆粒細(xì)胞的增殖分泌功能與卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育密不可分。顆粒細(xì)胞的異常增殖和凋亡影響卵泡成熟，PCOS患者卵泡發(fā)育不成熟則影響排卵，從而導(dǎo)致不孕[26]。Ma等[4]在PCOS患者卵丘顆粒細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)并鑒定出了一種新的表達(dá)增加的circRNA，即hsa_circ_0118530。Jia等[6]進(jìn)一步對(duì)hsa_circ_0118530在PCOS發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行了分子研究，用hsa_circ_0118530小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）轉(zhuǎn)染KGN細(xì)胞，結(jié)果顯示KGN細(xì)胞活力下調(diào)，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞遷移顯著受到抑制；通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并確定了hsa_circ_0118530與miR-136之間的相關(guān)性，在KGN細(xì)胞中抑制miR-136可逆轉(zhuǎn)hsa_circ_0118530 siRNA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。但miR-136對(duì)PCOS發(fā)病機(jī)制的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究?？梢姡琱sa_circ_0118530通過調(diào)節(jié)miR-136促進(jìn)PCOS的發(fā)生，為PCOS提供了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。然而，其是否可以直接或間接地影響卵巢功能，還需要進(jìn)行深入的研究。

3.3 circASPHcircASPH起源于第4～14外顯子的天冬氨酸β-羥化酶（aspartate-β-hydroxylase，ASPH）基因的環(huán)化，在肺腺癌中最早被研究[27]，并且受到高遷移率族蛋白A2（high-mobility group A2，HMGA2）的調(diào)控；circASPH促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Wu等[7]以KGN細(xì)胞為模型研究circASPH在PCOS中的潛在作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)circASPH后KGN細(xì)胞的活力增加、凋亡降低，而敲低circASPH后KGN細(xì)胞的凋亡率明顯升高。同時(shí)，circASPH過表達(dá)顯著降低KGN細(xì)胞內(nèi)活化的多腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）和活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase 3）的蛋白水平，而敲低circASPH使活化的PARP和caspase 3蛋白的水平顯著增加。該研究證實(shí)miR-375是circASPH的靶點(diǎn)，補(bǔ)充miR-375類似物可以挽救KGN細(xì)胞中circASPH的下調(diào)引起的增殖抑制。該研究還發(fā)現(xiàn)，miR-375的下游靶基因是重組人絲裂原激活蛋白激酶激酶6（mitogen-activated protein kinase kinase 6，MAP2K6），在KGN細(xì)胞中與circASPH通過海綿吸附miR-375調(diào)節(jié)MAP2K6的表達(dá)。可見，circASPH在PCOS中起致病作 用，PCOS中 存 在circASPH/miR-375/MAP2K6的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，這對(duì)PCOS的臨床診斷和治療具有重要意義。

3.4 circPUM1Deng等[28]推測(cè)miR-760可能參與了PCOS的進(jìn)展，進(jìn)一步研究表明miR-760在KGN細(xì)胞中表達(dá)降低；miR-760下調(diào)促進(jìn)KGN細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡。該研究應(yīng)用生物信息學(xué)分析、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀法、雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RNA下拉實(shí)驗(yàn)等證明，circPUM1對(duì)miR-760有海綿作用。該研究還發(fā)現(xiàn)circPUM1的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，而miR-760的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)circPUM1下調(diào)對(duì)KGN細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)?？梢?，circPUM1通過海綿吸附miR-760并負(fù)調(diào)控其表達(dá)，調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的功能，揭示了特定的circRNA在PCOS進(jìn)展中的作用，為PCOS分子機(jī)制研究提供了新的思路，并為PCOS的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

4 結(jié)語

PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，circRNA為探索PCOS的病因提供了一個(gè)很好的思路。circRNA可通過吸附miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，參與PCOS類固醇的產(chǎn)生、顆粒細(xì)胞增殖與凋亡，繼而影響卵泡發(fā)育。目前對(duì)circRNA的生物發(fā)生和功能的理解已取得一定進(jìn)展，但關(guān)于circRNA在PCOS中的研究仍處于初步階段，circRNA在PCOS發(fā)病中的具體作用機(jī)制仍需要更多的科學(xué)研究來驗(yàn)證。目前研究表明circRNA的異常表達(dá)在PCOS的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。深入詮釋circRNA的生物發(fā)生和調(diào)控會(huì)加深對(duì)RNA功能及其與PCOS關(guān)系的理解。深入對(duì)circRNA的研究有助于了解PCOS的發(fā)病機(jī)制，為PCOS未來研究方向提供新思路，更為PCOS患者個(gè)體化治療及長(zhǎng)期管理提供更好的理論基礎(chǔ)。