乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移術(shù)中檢測進(jìn)展：一步法核酸擴(kuò)增技術(shù)

張璐，白俊文

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科，內(nèi)蒙古呼和浩特010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特010050）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球最新癌癥數(shù)據(jù)表明，乳腺癌取代肺癌，成為全球第一大癌，隨著乳腺癌發(fā)病率及病死率的增加，乳腺癌的治療越趨重要[1-2]。腋窩淋巴結(jié)（axillary lymph node，ALN）轉(zhuǎn)移情況已成為乳腺癌患者整體生存最重要的預(yù)后指標(biāo)，因此腋窩淋巴結(jié)清掃術(shù)（axillary lymph node dissection，ALND）是早期乳腺癌手術(shù)治療的一部分，亦是造成上肢淋巴水腫等乳腺癌術(shù)后并發(fā)癥的主要原因[3]。20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)的一種微創(chuàng)、能高度準(zhǔn)確檢測ALN 轉(zhuǎn)移的方法，即前哨淋巴結(jié)活檢（sentinel lymph node biopsy，SLNB），歷經(jīng)數(shù)十年發(fā)展，SLNB 已成為早期乳腺癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法[4-5]。一系列大樣本前瞻性臨床試驗(yàn)證實(shí)了SLNB 的安全性，SLNB 可以提供準(zhǔn)確的ALN 分期，前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node，SLN）陰性及低負(fù)荷SLN 陽性患者SLNB 替代ALND 的腋窩復(fù)發(fā)率和并發(fā)癥發(fā)生率很低，為其提供了循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)[6-13]。準(zhǔn)確、快速的SLN 術(shù)中診斷變得尤為重要，冷凍切片（frozen section，F(xiàn)S）和印片細(xì)胞學(xué)（touch imprint cytology，TIC）是術(shù)中病理檢查的常用方法，F(xiàn)S 特異度幾乎100%，敏感度也較細(xì)胞學(xué)高，但假陰性率約為10%～20%；TIC特異度高但敏感度低，所以兩者的準(zhǔn)確性都受到限制，敏感度在57%到74%之間[14-15]。FS 和TIC 沒有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此，臨床上迫切需要一種結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡便的新型檢測方法。一步法核酸擴(kuò)增（one-step nucleic acid amplification，OSNA）是一種通過細(xì)胞角蛋白（cytokeratin 19，CK19）檢測SLN 轉(zhuǎn)移的方法，既簡便又快速，適合于SLN 轉(zhuǎn)移的術(shù)中檢測[16]。

1 乳腺癌SLN檢測的臨床意義及現(xiàn)狀

乳腺癌目前治療方式仍以手術(shù)治療為主。隨著乳腺外科保守理念的流行，不僅乳房能保留，腋窩也可以有條件的保留[17]。SLNB 無疑是乳腺外科領(lǐng)域的一個(gè)跳躍式的進(jìn)展。將SLN 定義為從原發(fā)腫瘤向區(qū)域淋巴結(jié)引流的第一站淋巴結(jié)，它可以為1 個(gè)或1 組，是乳腺腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移首先經(jīng)過的解剖位置。以SLN 的狀態(tài)評價(jià)整個(gè)區(qū)域淋巴結(jié)的狀態(tài)，即以SLNB 病理結(jié)果評價(jià)區(qū)域淋巴結(jié)有無受侵，其重要性及有效性毋庸置疑，目前腋窩SLNB 已成為乳腺癌患者手術(shù)治療的標(biāo)準(zhǔn)處理模式[18-22]。當(dāng)檢出SLN 陰性可避免ALND，同時(shí)也可避免術(shù)后上肢淋巴水腫等乳腺癌術(shù)后并發(fā)癥；檢出SLN 陽性患者可一次完成ALND，可以避免患者二次手術(shù)費(fèi)用的負(fù)擔(dān)和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，減少住院時(shí)間。SLNB 與示蹤劑的關(guān)系密不可分，臨床中常用的是亞甲藍(lán)注射液聯(lián)合核素示蹤劑（99mTc 標(biāo)記的硫膠體），可使檢出率增加的同時(shí)降低假陰性率[23]。在臨床工作中，SLN 是否轉(zhuǎn)移通過FS 的組織病理學(xué)或TIC 檢測，并通過術(shù)后常規(guī)的病理學(xué)檢測來確認(rèn)SLN 是否有轉(zhuǎn)移。

1.1 SLN轉(zhuǎn)移灶類型判定標(biāo)準(zhǔn)

SLN 的準(zhǔn)確診斷對于腋窩的準(zhǔn)確分期、確定術(shù)后治療方案及降低術(shù)后腋窩并發(fā)癥等至關(guān)重要。根據(jù)AJCC 乳腺癌TNM 分期第8 版，SLN 轉(zhuǎn)移分為宏轉(zhuǎn)移、微轉(zhuǎn)移和孤立腫瘤細(xì)胞（isolated tumor cell，ITC）。宏轉(zhuǎn)移：病理學(xué)檢測的陽性淋巴結(jié)存在1 個(gè)以上＞2 mm 的腫瘤病灶，其他陽性淋巴結(jié)至少存在微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移：腫瘤病灶最大徑＞0.2～2 mm，或單張組織切片不連續(xù)，抑或接近連續(xù)的細(xì)胞簇＜200 個(gè)細(xì)胞。ITC：單個(gè)細(xì)胞或最大徑≤0.2 mm的小細(xì)胞簇，單張組織切片不連續(xù)或接近連續(xù)的細(xì)胞簇≤200 個(gè)細(xì)胞簇。

1.2 FS快速病理檢查

目前FS 在SLN 是否轉(zhuǎn)移中的診斷應(yīng)用非常廣泛，Godazande 等[24]報(bào)道的FS 的準(zhǔn)確率為78.4%，假陰性率為20.9%，并認(rèn)為在評估低腫瘤負(fù)荷（＜2 mm的微轉(zhuǎn)移灶）的淋巴結(jié)時(shí)敏感度較低。2011年一項(xiàng)包括13 062 例患者的Meta 分析[25]顯示，F(xiàn)S 對任何SLN 轉(zhuǎn)移灶的總體敏感度為73.0%，其中宏轉(zhuǎn)移的敏感度為94.0%，微轉(zhuǎn)移和ITC 的敏感度為40%。Lanitis 等[26]研究表明，F(xiàn)S 的準(zhǔn)確率為96.1%，假陰性率為11.7% （ITC：6.8%，微轉(zhuǎn)移：7.7%，宏轉(zhuǎn)移：4.0%）這也說明FS 在SLN 宏轉(zhuǎn)移檢出率更高。Shojaee 等[27]結(jié)果認(rèn)為，F(xiàn)S 的敏感度，特異度和診斷準(zhǔn)確性分別為24%、90%和43%，在FS 中，SLN陽性和陰性分別為15.7%和84.3%，而在最終病理中，SLN 陽性和陰性分別為41.0%和58.8%。這一差異源于FS 的假陰性率，為31.3%。總而言之，F(xiàn)S 有較高的準(zhǔn)確率和較低的假陰性率，但其缺點(diǎn)是切片較厚，染色欠佳，與常規(guī)石蠟病理不能完全符合，而且易耗損組織。

1.3 TIC病理檢查

TIC 是檢測SLN 轉(zhuǎn)移的一種簡單且經(jīng)濟(jì)高效的技術(shù)。Uno 等[28]對367 例患者507 枚淋巴結(jié)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，TIC 診斷SLN 轉(zhuǎn)移的敏感度為84.1%，特異度為100.0%，準(zhǔn)確率為97.4%；TIC 可檢測出全部的宏轉(zhuǎn)移，而只檢出約50.0%的微轉(zhuǎn)移，未檢測出ITC。一項(xiàng)回顧性研究[29]對1 227 例乳腺癌患者評估TIC 檢測SLN 的敏感度，結(jié)果表明，TIC 的敏感度為68.6%，特異度為99.8%。Hashmi 等[30]比較114 例患者TIC 和FS 檢測SLN 轉(zhuǎn)移的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明，TIC 的敏感度，特異度和診斷準(zhǔn)確率分別為83.7%、98.5%和92.1%，而FS 的敏感度，特異度和診斷準(zhǔn)確性分別為93.9%、100%和97.4%；檢測微轉(zhuǎn)移時(shí)TIC 和FS 的敏感度分別為14.3% 和57.1%， 診斷準(zhǔn)確率分別為90.3% 和95.8%；檢測宏轉(zhuǎn)移時(shí)TIC 的敏感度和特異度分別為95.2% 和98.5%，而FS 的敏感度和特異度為100%。盡管FS 的總體敏感度高于TIC，但TIC 檢測宏轉(zhuǎn)移的敏感度與FS 相當(dāng)。綜上，TIC 具有不耗損標(biāo)本、操作簡便、廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，而且通過增加取樣面積和多層面印片提高診斷的準(zhǔn)確率。

1.4 術(shù)后常規(guī)病理檢查

中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2019年版）[31]推薦SLN 術(shù)后常規(guī)病理檢查的金標(biāo)準(zhǔn)是逐層切片行病理檢測。推薦將SLN 沿長軸切成2 mm 厚的組織塊，對每個(gè)組織塊進(jìn)行逐層或連續(xù)切片病理檢測，3 層切片間距為0.2～0.5 mm。而常規(guī)病理檢測技術(shù)中也存在著一些缺點(diǎn)，其不能對大量的SLN 進(jìn)行分析、細(xì)胞學(xué)的敏感度在33.0%～73.0%，在微轉(zhuǎn)移和浸潤性小葉癌中常常出現(xiàn)假陰性結(jié)果，而且病理組織學(xué)分析是一種昂貴的分析SLN 方法，還需要病理學(xué)家分析標(biāo)本以得出最終的結(jié)論[32]。

2 OSNA檢測乳腺癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

在當(dāng)今的精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，應(yīng)準(zhǔn)確評估SLN 是否轉(zhuǎn)移。常規(guī)的FS 和TIC 對SLN 診斷具有較高的敏感度和特異度，但其存在主觀性、非標(biāo)準(zhǔn)化、檢測的組織量少等缺點(diǎn)，需要尋求更為準(zhǔn)確的術(shù)中快速分子診斷技術(shù)。OSNA 是一種僅需一步操作即可以勻漿標(biāo)本做為模板，對靶向核酸基因擴(kuò)增并檢測的技術(shù)。采用OSNA 技術(shù)，可以對淋巴結(jié)中的目標(biāo)基因進(jìn)行高精度、快速、簡便的檢測。

2.1 OSNA的原理

OSNA 在選擇目的基因的標(biāo)記物時(shí)，先從人類遺傳基因數(shù)據(jù)庫中選擇了45 個(gè)在乳腺/乳腺癌組織中高表達(dá)，而在正常淋巴結(jié)組織中低表達(dá)的遺傳基因，然后使用定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈技術(shù)的方法，篩選出在轉(zhuǎn)移陽性的淋巴結(jié)組織中高表達(dá)，而在轉(zhuǎn)移陰性的淋巴結(jié)組織中低表達(dá)的7 個(gè)候選遺傳基因。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這7 個(gè)候選遺傳基因在轉(zhuǎn)移陽性和轉(zhuǎn)移陰性的淋巴結(jié)組織中表達(dá)量存在很大的差異。最終將在轉(zhuǎn)移陽性淋巴結(jié)組織中表達(dá)量最高的CK19mRNA 選為最適合于乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測的遺傳基因標(biāo)志物，CK19 標(biāo)記物在95%以上的乳腺癌中均有表達(dá)，避免了基因組DNA 擴(kuò)增（或CK19 基因假擴(kuò)增）[33-34]。CK19 在乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)，而在淋巴結(jié)中不表達(dá)，當(dāng)檢測到SLN 中CK19 mRNA 擴(kuò)增時(shí)，高度懷疑該淋巴結(jié)有乳腺癌轉(zhuǎn)移[35]。近年來發(fā)展的定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈技術(shù)檢測一般需要數(shù)小時(shí)，包括mRNA 的提取、純化和cDNA 合成等多個(gè)步驟，不適于術(shù)中檢測SLN[35]。為了減少術(shù)中檢查所需的時(shí)間，OSNA 依據(jù)反轉(zhuǎn)錄-環(huán)狀介導(dǎo)等溫DNA 擴(kuò)增方法，在mRNA 不純化的情況下進(jìn)行基因擴(kuò)增，通過在恒定溫度下用引物和DNA 聚合酶II 的混合物對樣本完成檢測[36]。OSNA可同時(shí)檢測4 個(gè)完整的SLN，僅需30～40 min[16]。

2.2 OSNA的結(jié)果分析

從每個(gè)SLN的中心取出1個(gè)非常薄的切片（1 mm）進(jìn)行病理檢查后，剩余的淋巴結(jié)切片在4 mL 的Lynorhag 裂解緩沖液（Sysmex，Kobe，Japan）pH 為3.5 中均化，并在室溫下進(jìn)行短暫離心，然后使用RT-LAMP 對RD-100i 系統(tǒng)中的2 μL 上清液進(jìn)行分析。結(jié)果分為陰性（＜2.5×102拷貝/μL）、（+）即微轉(zhuǎn)移（＞2.5×102拷貝/μL，＜5.0×103拷貝/μL）、（++）即宏轉(zhuǎn)移（＞5.0×103拷貝/μL）和+i（常規(guī)樣品抑制，稀釋樣品≥2.5×102拷貝/μL）。分類為+i 的患者也被認(rèn)為是陽性[37]。

2.3 OSNA在臨床中的應(yīng)用

OSNA 從2007年開始應(yīng)用于臨床，無論在術(shù)中還是術(shù)后都是一種準(zhǔn)確的檢測SLN 轉(zhuǎn)移的方法[38]。這種新興技術(shù)具有半定量、可重復(fù)性、準(zhǔn)確性和分析整個(gè)SLN 的優(yōu)點(diǎn)，被越來越多的中心所采用[39]。Szychta 等[40]分析了105 個(gè)SLN，中心1 mm 的SLN 切片用于FS 檢查，用OSNA 分析SLN 的2 個(gè)層面，結(jié)果表明，與FS 相比，OSNA 更容易檢出SLN轉(zhuǎn)移（P＜0.000 1）；不一致的結(jié)果有8 個(gè)SLN，OSNA 檢測為陽性（2 個(gè)檢測結(jié)果為ITC，6 個(gè)檢測結(jié)果為微轉(zhuǎn)移）而FS 檢測為陰性；OSNA 的敏感度為100%，特異度為90.47%。Hintzen等[41]分析了271例患者459 個(gè)SLN，對比常規(guī)組織學(xué)檢查和OSNA 檢查結(jié)果，表明兩組之間的宏轉(zhuǎn)移相似，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（組織學(xué)檢出率為17.9%，OSNA 檢出率為16.2%，P=0.715）；在微轉(zhuǎn)移方面，OSNA 優(yōu)于常規(guī)組織學(xué)檢測（組織學(xué)檢出率為11.4%，OSNA 為25.0%，P=0.004）；在分析乳腺癌中SLN 是否轉(zhuǎn)移，OSNA 是一項(xiàng)高度敏感的技術(shù)，在微轉(zhuǎn)移方面更勝一籌。Santaballa 等[37]研究也表明，OSNA 較病理學(xué)更易檢出SLN 微轉(zhuǎn)移（P=0.000 7）。在常規(guī)病理學(xué)檢測為ITC 時(shí)，據(jù)報(bào)道，OSNA 對小體積轉(zhuǎn)移灶的檢測更敏感，OSNA 檢測有時(shí)會受到抑制，這會導(dǎo)致假陰性結(jié)果（＜250 拷貝/μL），如在稀釋樣品中（＞250 拷貝/μL）就為陽性[42]。有研究者[43]認(rèn)為當(dāng)結(jié)果為（100～250 拷貝/μL）相當(dāng)于ITC，還有待進(jìn)一步研究確定。國內(nèi)王永勝等[9]入組了全國5 個(gè)乳腺病中心552 例原發(fā)性乳腺癌患者，共探及SLN 1 188 枚，OSNA 的準(zhǔn)確度、敏感度、特異度分別為91.4%、83.7%和92.9%，對于SLN微轉(zhuǎn)移，OSNA的敏感度優(yōu)于FS（P=0.289），顯著優(yōu)于TIC（P=0.007）。

OSNA 技術(shù)還具有預(yù)測非前哨淋巴結(jié)（nonsentinel lymph node，nSLN） 轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。Cuffolo等[44-45]報(bào)道總腫瘤負(fù)荷（total tumor load，TTL）似乎對nSLN 轉(zhuǎn)移有預(yù)測價(jià)值。TTL 定義為所有陽性SLN 中CK19 mRNA 的總數(shù)。利用TTL 可以確定一個(gè)閾值，在該閾值下可以避免不必要的ALND。Peg等[46]試圖利用TTL 作為早期乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)，對950 例患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，TTL 與無病生存（P=0.000 004）、局部無復(fù)發(fā)生存（P=0.001 4）和總生存（P=0.003 2）相關(guān)；表明TTL 是早期乳腺癌患者評估ALN 轉(zhuǎn)移的一個(gè)潛在預(yù)后分期工具；對于SLN陽性手術(shù)后未進(jìn)行ALND 的患者，這一分組方法（低危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)TTL＜2.5×104拷貝/μL，高危復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)TTL＞2.5×104拷貝/μL）可能會對后續(xù)治療策略有所幫助；這項(xiàng)新的數(shù)據(jù)證實(shí)了TTL 在腋窩轉(zhuǎn)移低負(fù)荷患者中的臨床價(jià)值，可以部分地取代沒有進(jìn)行ALND 患者的腋窩分期信息。TTL 作為一種預(yù)測工具，在應(yīng)用于臨床之前，顯然還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。為避免ALND 的并發(fā)癥，OSNA 預(yù)測nSLN 轉(zhuǎn)移的潛力將繼續(xù)受到關(guān)注。同時(shí)，OSNA 在新輔助治療方面也具有一定的意義。新輔助治療（neoadjuvant treatment，NAC）后淋巴結(jié)常常發(fā)生纖維化或萎縮，導(dǎo)致取材時(shí)難以識別。Pe?a 等[47-48]研究表明在NAC 后患者的SLN 轉(zhuǎn)移檢測能力方面，OSNA 是一種敏感度高、特異度高和可重復(fù)的診斷技術(shù)。Vieites 等[49]對314 例患者行NAC 后進(jìn)行術(shù)中SLN 活檢，結(jié)果表明，TTL 可以預(yù)測nSLN 的轉(zhuǎn)移（曲線下面積=0.87），截止值為1.5×104拷貝/μL時(shí)，陰性預(yù)測值為90.5%；經(jīng)過5年的隨訪，≤2.5×104拷貝/μL 患者的DFS＞2.5×104拷貝/μL 患者（P=0.001 7）。Espinosa-Bravo 等[50]研究表明，針對在NAC 治療后的SLN 陽性患者，OSNA 對SLN 的精確評估可降低18.5%二次ALND 手術(shù)。

3 結(jié) 論

隨著早期乳腺癌檢出的增多，ALN 陰性患者已占據(jù)一半以上，如對所有患者進(jìn)行ALND，將只有一小部分患者受益，大部分患者接受了過度治療。SLN 為腋窩分期的金標(biāo)準(zhǔn)，精準(zhǔn)檢出SLN 是否有轉(zhuǎn)移是外科醫(yī)生所追求的。OSNA 是第一個(gè)對轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中靶基因mRNA 進(jìn)行半定量檢測的方法，初步試驗(yàn)取得令人滿意的效果。在操作時(shí)更標(biāo)準(zhǔn)化，檢測敏感度更高，術(shù)中快速定量可區(qū)分宏轉(zhuǎn)移和微轉(zhuǎn)移，指導(dǎo)手術(shù)方案，運(yùn)用術(shù)中SLN 定量結(jié)果制定預(yù)后模型進(jìn)行深入的臨床分析，操作簡單，可重復(fù)性更高，可更精準(zhǔn)的明確SLN 的轉(zhuǎn)移數(shù)目，同時(shí)可為乳腺癌的腋窩分期提供準(zhǔn)確而及時(shí)的信息，避免患者進(jìn)行二次手術(shù)，以便臨床醫(yī)生制訂后續(xù)的手術(shù)方案及治療措施。該技術(shù)有望成為一種新的手段，服務(wù)于乳腺癌患者，在中國推廣使用。