白樺脂醛對裸鼠移植瘤生長的抑制作用及機制研究

黃攀豪，湯紫照，聶方欽，符陽霞，晏欣，李岱，郭韌

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院藥學(xué)部，湖南長沙410013；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院I期臨床試驗中心，湖南長沙410008）

中國傳統(tǒng)醫(yī)藥及其在臨床疾病中的應(yīng)用為提高全世界人民的健康水平做出了巨大貢獻。近幾十年來，青蒿素在治療瘧疾、三氧化二砷在治療白血病等方面取得的重大成就，證實了中國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的發(fā)展前景[1-2]。在前期的篩查研究中，筆者提取了部分中藥單體有效成分，并通過高通量篩選技術(shù)篩選出了一些具有明顯抗癌活性的中藥提取物，其中篩選出的提取物白樺脂醛對A549 細胞活性展現(xiàn)出了較大的抑制作用。筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選白樺脂醛作用于肺癌的靶點時，發(fā)現(xiàn)EGFR 是其潛在靶點，而EGFR 可調(diào)控Raf/MEK/ERK 和PI3K/Akt/mTOR 等通路，起到調(diào)節(jié)腫瘤細胞增值、分化和侵襲轉(zhuǎn)移的作用；IL-6/JAK/STAT3 也是EGFR 下游的重要信號傳導(dǎo)途徑，在調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖過程中起重要作用。因此，筆者猜想白樺脂醛白樺脂醛的抑瘤作用可能和Akt、ERK、STAT3 通路有關(guān)。由于自噬在腫瘤進展中起著重要的作用，故白樺脂醛也有可能通過調(diào)節(jié)A549 細胞的自噬水平發(fā)揮抑瘤作用。因此，本研究擬通過運用裸鼠皮下成瘤實驗進一步在整體動物上觀察白樺脂醛的抑瘤作用，并通過分子生物學(xué)實驗手段確定白樺脂醛抑瘤作用可能的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

白樺脂醛購美國MCE 公司， 分子式為C30H48O2，分子量440.70，純度= 98.56%；TUNEL 試劑盒 （KGA704） 購自凱基生物 （KeyGEN BioTECH）；蘇木素伊紅（HE） 染色試劑盒購自Wellbio 公司；抗Akt、磷酸化AKT （P-Akt）、抗ERK、抗STAT3、抗LC3、抗p62、抗actin 抗體購自美國Proteintech 公司；磷酸化ERK （P-ERK） 和磷酸化STAT3 （P-STAT3） 抗體購自英國Abcam 公司；DMEM（含4 500 mg/L D-葡萄糖）培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Sigma 公司。

1.2 實驗細胞和動物

人非小細胞肺癌細胞A549 購自上海中喬新舟公司，培養(yǎng)于DMEM 高糖培基含10%胎牛血清，置37 ℃恒溫含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 周齡SPF 級雄性裸鼠，12～15 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SYXK （湘） 2020-0019。

1.3 實驗方法

1.3.1 成瘤模型的建立和分組給藥 白樺脂醛溶解于DMSO 配置成20 mg/mL 儲備液。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按2×106個/100 μL 人非小細胞肺癌細胞A549通過腋下皮下注射植入裸鼠，待瘤體生長到合適大小，隨機分成4 組，每組7 只裸鼠，分別為對照組（DMSO），白樺脂醛低劑量組（50 mg/kg），中劑量組（100 mg/kg），白樺脂醛高劑量組（200 mg/kg），腹腔注射給藥干預(yù)持續(xù)1 周，1 次/d。

1.3.2 腫瘤生長曲線和抑瘤率測定 成瘤后每周進行2 次瘤體測量，腫瘤大小用用游標卡尺測定長軸（A） 和短軸（B） 計算，計算公式為V （cm3） =A×B2/2。種瘤21 d 后，采用頸椎脫臼處死裸鼠。

1.3.3 HE 染色 烤片，二甲苯脫蠟；梯度濃度的乙醇中復(fù)水；用蘇木素染細胞核，蒸餾水沖洗后用PBS 返藍；伊紅染染細胞核，蒸餾水沖洗，再用梯度酒精脫水，取出后置于二甲苯；中性樹膠封片，用光學(xué)顯微鏡觀察陽性細胞。

1.3.4 TUNEL 染色 烘片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水合；高碘酸封閉后依次加Proteinase K 工作液、內(nèi)源性親和素封閉A 液和內(nèi)源性生物素封閉B 液孵育，再加TdT 酶反應(yīng)液和Streptavidin-HRP 標記液和DAB 工作液反應(yīng)，漂洗后加蘇木素染液染色；1%鹽酸甲醇中分化；梯度無水乙醇脫水，晾干后加中性樹膠和蓋玻片，用光學(xué)顯微鏡觀察拍照TUNEL 陽性細胞。

1.3.5 Western blot 檢測蛋白表達水平 取各組腫瘤組織加RIPA 裂解，提取組織總蛋白；取蛋白上清，蛋白定量；10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉，依次加一抗和二抗孵育；ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光，顯影沖洗；掃描底片，用Quantity one 軟件統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 軟件（IBM，USA）進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用方差分析，進一步多組內(nèi)兩兩比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠成瘤實驗結(jié)果

裸鼠成瘤實驗顯示，各組小鼠接種A549 細胞3 周后，接種部位均出現(xiàn)明顯腫瘤。于第3 周實驗結(jié)束時，各組裸鼠移植瘤情況見圖1；不同劑量的白樺脂醛均可一定程度地減慢移植瘤的生長，并呈一定的劑量依賴性，3 周后，中、高劑量白樺脂醛處理組移植瘤體積與對照組的差異有統(tǒng)計學(xué)意義[（0.33±2.57）cm3vs.（0.53±0.10）cm3；（0.24±5.42）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，均P＜0.01]，而低劑量白樺脂醛處理組移植瘤體積與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義[（0.43±1.70）cm3vs.（0.53±0.10）cm3，P＞0.05]（圖2）。

圖1 各組裸鼠移植瘤生長情況

圖2 各組移植瘤體積變化曲線

2.2 移植瘤組織病理情況比較

各組裸鼠移植瘤呈圓形、橢圓形或分葉狀包塊，包膜完整，與周圍組織分界清楚。HE 染色后顯微鏡下可觀察到不同白樺脂醛劑量組小鼠瘤體組織呈現(xiàn)出不同程度的退行性病變，部分區(qū)域出現(xiàn)明顯細胞壞死區(qū)，在高劑量白樺脂醛處理組較為明顯。對照組腫瘤細胞生長旺盛，大小不一，有一定異型性，細胞核較大，瘤體組織未見明顯壞死（圖3）。

圖3 各組瘤體組織HE染色情況（×100）

2.3 各組瘤體組織細胞增凋亡平比較

使用TUNEL 染色檢測了腫瘤組織中細胞的凋亡比例，結(jié)果顯示，不同劑量的白樺脂醛處理成瘤小鼠后，使瘤體組織中TUNEL 染色陽性細胞數(shù)明顯增加，并且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

圖4 各組瘤體組織TUNEL染色結(jié)果（×100）

2.4 白樺脂醛對腫瘤組織細胞內(nèi)增殖信號通路的影響

通過Western blot 法檢測白樺脂醛給藥后對瘤體組織細胞中Akt、ERK、STAT 信號通路的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白樺脂醛可呈劑量依賴性地抑制Akt、ERK、STAT 信號通路的活化，表現(xiàn)為p-Akt、p-ERK、p-STAT3 表達的明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 白樺脂醛對細胞內(nèi)增殖信號通路相關(guān)蛋白水平的影響

2.5 白樺脂醛對腫瘤組織自噬水平的影響

本研究還觀察了白樺脂醛對瘤體組織的自噬水平的影響，結(jié)果顯示，白樺脂醛可呈劑量依賴性地提升瘤體組織的自噬水平，表現(xiàn)為p62 表達的降低及LC3 II/I 水平的升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖6）。

圖6 白樺脂醛對自噬相關(guān)蛋白水平的影響

3 討論

以往對白樺脂醛作用的研究較少。Chung 等[3]研究表明，白樺脂醛作為一種FtsZ 蛋白抑制劑，能快速抑制金黃色葡萄球菌的生長，發(fā)揮殺菌作用，并與其他抗菌藥物具有協(xié)同作用。此外，有研究[4-5]表明白樺脂醛作為樺木屬植物提取物具有一定的血糖調(diào)節(jié)能力。Yang 等[6]也發(fā)現(xiàn)白樺脂醛是一種天然的RORγt 激動劑，可通過直接與蛋白質(zhì)結(jié)合改變RORγt 的熱穩(wěn)定性。RORγt 的激動劑和抑制劑分別是潛在的腫瘤免疫治療藥物和自身免疫性疾病藥物，提示白樺脂醛可能具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用[7-8]。由于腫瘤細胞較正常細胞表現(xiàn)出特異的代謝活性（偏向于以糖酵解和脂代謝方式供能）和免疫活性，因此白樺脂醛可能通過對代謝和免疫的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，關(guān)于白樺脂醛抗腫瘤作用的實驗數(shù)據(jù)卻未見報道。本研究在前期高通量篩選數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，通過裸鼠皮下成瘤實驗在整體動物上進一步驗證了白樺脂醛的抑瘤作用，并通過分子生物學(xué)技術(shù)確定了其主要參與的分子信號通路。

A549 細胞是一種常用的非小細胞肺癌細胞株，常用于抗腫瘤藥物的藥篩和藥敏實驗，本研究中將其接種于裸鼠皮下1 周后，成瘤率達到了100%，所有接種個體均形成了大小不等的種植瘤。本實驗中設(shè)置了低、中、高劑量的白樺脂醛給藥組，結(jié)果顯示白樺脂醛可明顯降低成瘤小鼠最終的瘤體體積，提示了白樺脂醛在整體動物水平能抑制腫瘤細胞的生長。確定了白樺脂醛抑制腫瘤細胞生長的作用后，進一步對不同處理組的瘤體組織進行了病理學(xué)檢查。瘤體組織HE 染色結(jié)果顯示不同劑量給藥的裸鼠移植瘤鏡下呈現(xiàn)不同程度片狀壞死區(qū)，壞死區(qū)腫瘤細胞結(jié)構(gòu)模糊，細胞核裂解消失，壞死灶周邊有少量殘存的腫瘤細胞。這一結(jié)果提示，白樺脂醛對瘤體組織A549 細胞的活性有明顯的抑制作用。

為了進一步確定白樺脂醛對瘤體組織細胞生長活性的影響，研究中還使用TUNEL 染色檢查了瘤體組織處于凋亡狀態(tài)的細胞數(shù)量，與白樺脂醛的抑瘤作用一致，白樺脂醛處理后瘤體組織中凋亡細胞數(shù)明顯增加，表明白樺脂醛通過對A549 細胞內(nèi)信號通路的調(diào)節(jié)，打破了細胞原有的凋亡狀態(tài)的平衡，使細胞趨向于凋亡。腫瘤細胞與正常細胞相比，其胞內(nèi)促存活信號通路明顯活化，主要包括Akt、ERK、STAT 等信號通路的活化[9-11]。本研究中運用Western blot 的方法檢測了白樺脂醛給藥后對瘤體組織細胞中Akt、ERK、STAT 信號通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白樺脂醛可呈劑量依賴性地抑制Akt、ERK、STAT 信號通路的活化，表明白樺脂醛可通過對多條分子信號通路的影響發(fā)揮抑瘤作用。既往的研究證實了異常的自噬水平參與了腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，但關(guān)于自噬在腫瘤疾病中是起到抑制還是促進的作用，有很多相互矛盾的報道[12-13]。本研究中另一重要發(fā)現(xiàn)是白樺脂醛的抑瘤作用可能與自噬有關(guān)，白樺脂醛可明顯上調(diào)瘤體組織細胞中的自噬水平。由于自噬水平的高低對細胞的代謝和能量供應(yīng)均有密切關(guān)系，因此白樺脂醛的抑瘤作用也可能與其對自噬的調(diào)節(jié)有一定關(guān)系，未來需要更進一步的機制實驗以證明這一關(guān)系。

總之，本研究通過裸鼠皮下種瘤實驗初步證實了一種具有顯著藥理學(xué)活性的植物提取物白樺脂醛，能夠顯著抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，降低A549 細胞的成瘤能力，其機制可能與對種瘤細胞內(nèi)多條促增殖信號通路的抑制有關(guān)。白樺脂醛抑瘤作用的發(fā)掘可能為今后臨床治療肺癌及其他惡性腫瘤提供一定的思路。