外泌體來源的微RNA在心血管疾病中的作用及中藥干預(yù)的研究進(jìn)展

楊林靜，宗文靜

(首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京 100069)

《中國(guó)心血管病報(bào)告2018》顯示，我國(guó)心血管病的患病率和病死率仍處于上升階段，目前我國(guó)心血管病患病人數(shù)約為2.9億，病死率超過40%[1]。心血管疾病嚴(yán)重危害人類的身心健康，防治心血管疾病已成為目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。外泌體介導(dǎo)了心臟細(xì)胞間的信息傳遞，隨著其內(nèi)容物微RNA(microRNA，miRNA)的發(fā)現(xiàn)，外泌體來源的miRNA在心血管系統(tǒng)中的作用機(jī)制逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究表明，外泌體來源的miRNA與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。外泌體內(nèi)的特定miRNA參與心血管的病理、生理及修復(fù)再生等環(huán)節(jié)，具有促進(jìn)血管生成、細(xì)胞增殖以及抑制纖維化、抗炎等作用[3]。目前雖然已進(jìn)行了大量研究，但外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的調(diào)控機(jī)制仍不明確。傳統(tǒng)中藥對(duì)心血管疾病有較好的療效，但存在有效成分溶解率低、生物利用度不高、療程較長(zhǎng)等不足，而利用外泌體可以更好地遞送中藥的有效成分[4]。部分研究者也正聚焦于中藥對(duì)心血管疾病中外泌體來源的miRNA作用機(jī)制的研究[5]，期待可以更好地發(fā)揮中藥的療效?，F(xiàn)就外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的作用及中藥干預(yù)機(jī)制的研究進(jìn)展予以綜述。

1 外泌體的基本特征

1.1外泌體的構(gòu)成 外泌體是由細(xì)胞分泌至細(xì)胞外的直徑為30～100 nm的雙層囊泡狀小體[6]，攜帶多種信息成分，包括蛋白質(zhì)、脂類、miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA和信使RNA等。研究顯示，外泌體表面已被識(shí)別的蛋白包括熱激蛋白、轉(zhuǎn)膜蛋白和融合蛋白、多囊泡體生成相關(guān)蛋白、四次跨膜蛋白(如CD9、CD63、CD81和CD82)、脂質(zhì)相關(guān)蛋白以及外泌體來源的細(xì)胞特異性蛋白等[7]。雖然外泌體的外膜也是脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，但雙層脂質(zhì)膜可為外泌體內(nèi)容物提供保護(hù)，防止miRNA被分解，保證了miRNA在體液中有較好的穩(wěn)定性[8]。

1.2外泌體的形成和分泌 不同來源的細(xì)胞均可形成外泌體，其形成機(jī)制大致相同。首先，細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)涵體通過向細(xì)胞腔內(nèi)發(fā)芽而形成多囊泡體，此過程需要在內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體及相關(guān)蛋白(如腫瘤易感基因101、CD63)的調(diào)控下進(jìn)行；隨后，在Rab家族鳥苷三磷酸酶的作用下，多囊泡體與細(xì)胞膜融合，并將腔內(nèi)的多個(gè)囊泡釋放到細(xì)胞外基質(zhì)中，形成外泌體[9]。多種不同類型的細(xì)胞均可分泌外泌體，如血細(xì)胞、干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板以及平滑肌細(xì)胞等[10]；外泌體廣泛存在于體液中，如尿液、唾液、乳液、血液、胸腔積液、心包積液以及腦脊液等[11]。

2 外泌體來源的miRNA及其生物學(xué)特征

2007年，Valadi等[12]首次于肥大細(xì)胞分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)了miRNA，自此有關(guān)外泌體來源的miRNA的研究越來越多。研究證實(shí)，外泌體來源的miRNA參與心血管發(fā)育、再生和修復(fù)過程，對(duì)心臟功能具有促進(jìn)或抑制作用[13]。

miRNA是一段長(zhǎng)為19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA分子，細(xì)胞核內(nèi)的miRNA相關(guān)基因序列經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、切割，生成前體miRNA，再由蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)一步剪切修飾為成熟的雙鏈RNA，其中一條單鏈作為客鏈被降解，另一條單鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體結(jié)合形成成熟的miRNA[14-16]；隨后，miRNA與信使RNA 3′端的堿基序列互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致RNA降解或抑制信使RNA靶蛋白的翻譯，調(diào)節(jié)基因表達(dá)[17]。目前研究證實(shí)，外泌體來源的miRNA有兩大功能：①常規(guī)功能，即基因調(diào)控功能，一個(gè)miRNA往往能夠調(diào)控上百個(gè)信使RNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)；②配體功能，外泌體來源的miRNA可以作為配體與Toll樣受體結(jié)合[18]。miRNA被包裹在外泌體內(nèi)，通過自分泌、旁分泌的方式作用于靶細(xì)胞，影響細(xì)胞功能，以此介導(dǎo)細(xì)胞間的信號(hào)傳遞[19]。這一過程依賴于外泌體雙層脂質(zhì)膜良好的穩(wěn)定性，防止miRNA在循環(huán)中被核酸酶降解，同時(shí)，外泌體膜還可抵御不同的低溫環(huán)境，為其內(nèi)容物提供良好的儲(chǔ)存條件[20]。

3 外泌體來源的miRNA在心血管疾病中的作用

3.1動(dòng)脈粥樣硬化 動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞增殖、血栓形成以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等密切相關(guān)。Hergenreider等[21]將表達(dá)Krüppel樣因子2的血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體注入高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠動(dòng)脈粥樣硬化面積顯著縮?。贿M(jìn)一步研究證實(shí)，外泌體內(nèi)富含的miR-143和miR-145被平滑肌細(xì)胞攝取，抑制了平滑肌細(xì)胞增殖，發(fā)揮了抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。有研究顯示，外泌體來源的miR-126可以為內(nèi)皮細(xì)胞提供保護(hù)，miR-126通過調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子16，縮小斑塊面積，減少巨噬細(xì)胞滲透[22]。還有研究顯示，血小板來源的外泌體富含的miR-320可以下調(diào)細(xì)胞間黏附分子1的表達(dá)，減少炎癥和血栓形成，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[23]。Yao等[24]研究表明，血小板來源的外泌體富含的miR-25-3p可抑制ApoE-/-小鼠冠狀血管內(nèi)皮的炎癥反應(yīng)，其機(jī)制是外泌體富含的miR-25-3p通過抑制核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路延緩炎癥進(jìn)程，進(jìn)而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展。另有研究表明，經(jīng)氧化型低密度脂蛋白處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞可激活NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)miR-505表達(dá)增加和網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成，加重動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[25]。由此可見，外泌體來源的miRNA不僅可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，還可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。血管平滑肌細(xì)胞分泌的外泌體miR-155從平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而破壞內(nèi)皮屏障的完整性，導(dǎo)致內(nèi)皮通透性增加和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展增強(qiáng)，該過程可能與Krüppel樣因子5有關(guān)，而阻斷外泌體介導(dǎo)的miR-155在平滑肌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移，可能成為治療動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)[26]。

此外，炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中也扮演重要角色。巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)炎癥應(yīng)答方面起重要作用，巨噬細(xì)胞來源的外泌體分泌的miR-124升高，抑制了巨噬細(xì)胞活化，使炎癥細(xì)胞滲透減少，發(fā)揮抗炎作用[27]。外泌體來源的miRNA在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)均具有關(guān)鍵作用，如何提高miR-126、miR-25-3p、miR-124等外泌體來源的miRNA的表達(dá)水平可能是未來研究的方向。

3.2心力衰竭 在心力衰竭發(fā)生后，外泌體中的miRNA水平會(huì)發(fā)生改變，如miR-1、miR-21、miR-133a/b以及miR-214水平在心力衰竭過程中會(huì)增高，發(fā)揮保護(hù)心肌細(xì)胞的作用[28]。研究表明，心肌梗死后出現(xiàn)新發(fā)心力衰竭患者的血漿外泌體miR-192、miR-194和miR-34a的表達(dá)水平均增高[29]。Qiao等[30]通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，心力衰竭患者基質(zhì)細(xì)胞來源的外泌體富含的miR-21-5p表達(dá)失調(diào)，恢復(fù)miR-21-5p表達(dá)可改善心肌受損；進(jìn)一步研究表明，miR-21-5p通過抑制人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，增強(qiáng)蛋白激酶B的活性，從而促進(jìn)血管生成和心肌細(xì)胞存活。而間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-221表達(dá)增加可降低p53上調(diào)凋亡調(diào)控因子的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)心臟的保護(hù)作用[31]。

3.3心肌梗死 心肌梗死是心臟疾病中的急危重癥，早期快速診斷對(duì)疾病的治療及預(yù)后均具有重要意義。Kuwabara等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死區(qū)及梗死周邊區(qū)，心肌細(xì)胞受損后其外泌體含有的miR-1和miR-133a釋放入血，導(dǎo)致血漿中的miR-1和miR-133a水平均升高，提示外泌體來源的miRNA可作為診斷心血管疾病的潛在標(biāo)志物，為早期診斷心肌梗死提供幫助。Luo等[33]研究表明，在缺氧誘導(dǎo)過程中，脂肪干細(xì)胞來源的外泌體富含的miR-126過表達(dá)可以下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，減輕H9C2心肌細(xì)胞損傷，促進(jìn)微血管生成和遷移，同時(shí)還可以通過減少纖維化相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)降低心肌纖維化程度，這可能是心肌梗死后外泌體miR-126改善心臟功能的機(jī)制。此外，外泌體來源的miR-1、miR-126還可通過抑制Spred蛋白的表達(dá)，促進(jìn)新生血管的形成[34]；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-132過表達(dá)，可調(diào)節(jié)Ras/促分裂原活化的蛋白激酶通路，促進(jìn)心肌梗死區(qū)新生血管的形成[35]。人子宮內(nèi)膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR-21可促進(jìn)心肌梗死后血管生成，且miR-21對(duì)心臟的保護(hù)作用優(yōu)于骨髓來源和脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，提示人子宮內(nèi)膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可能成為治療心血管疾病的首選細(xì)胞[36]。

心臟祖細(xì)胞來源的外泌體通過miR-146a抑制心肌細(xì)胞的凋亡，減輕心肌缺血再灌注損傷，縮小心肌梗死面積[37]。有研究顯示，向急性心肌梗死小鼠注射胚胎干細(xì)胞來源的含有miR-22的外泌體，可以下調(diào)甲基化CpG結(jié)合蛋白2，從而刺激血管生成，減小梗死面積，改善心臟功能[38]。另外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體分泌的miR-301可能通過抑制心肌細(xì)胞自噬，減少心肌梗死面積[39]。

3.4心肌病 外泌體來源的miRNA在心肌病的發(fā)展過程中也有重要作用。Wang等[40]通過研究糖尿病心肌病小鼠發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞來源的外泌體miR-320水平增高，而胰島素樣生長(zhǎng)因子1、熱激蛋白20和內(nèi)皮素2水平均降低，導(dǎo)致心臟內(nèi)皮血管生成功能受損，敲除miR-320則可以消除心臟內(nèi)皮血管生成受損，這也證實(shí)了miR-320水平增高可抑制小鼠心臟內(nèi)皮細(xì)胞遷移和新生血管形成。另有研究顯示，圍生期心肌病患者內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體miR-146a在催乳素的誘導(dǎo)下表達(dá)增高，從而抑制血管生成[41]。此外，外泌體來源的miRNA也可抑制心肌病的發(fā)展進(jìn)程，保護(hù)心臟功能。間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體分泌的miR-22、miR-146和miR-210均能阻斷糖尿病性心肌病小鼠的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β信號(hào)通路，減輕心肌纖維化，改善心功能[42]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-223在膿毒性心肌病中具有保護(hù)作用，可能是由于miR-223可下調(diào)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)，并可減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生[43]。

3.5心肌纖維化 高血壓使心臟長(zhǎng)期超負(fù)荷、壓力增大，以致發(fā)生病理性心肌重構(gòu)，同時(shí)伴隨心肌肥厚和心肌纖維化形成。研究表明，機(jī)械牽張刺激后，心肌細(xì)胞中的miR-378以外泌體途徑進(jìn)入心肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致miR-378水平增加，并通過調(diào)節(jié)p38促分裂原活化的蛋白激酶和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3信號(hào)通路抑制成纖維細(xì)胞中與纖維化相關(guān)的信使RNA和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而抑制心肌纖維化的形成[44]。還有研究表明，心力衰竭患者血漿細(xì)胞以及經(jīng)血管緊張素Ⅱ處理的心肌成纖維細(xì)胞外泌體中miR-425和miR-744的水平均降低，而miR-425和miR-744可通過抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的表達(dá)，降低受體蛋白的表達(dá)，從而抑制心肌纖維化，提示血漿外泌體中的miR-425和miR-744可能成為預(yù)測(cè)心肌纖維化和心力衰竭的標(biāo)志物[45]。對(duì)于急性心肌梗死導(dǎo)致的心肌纖維化，已有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-22可以通過結(jié)合甲基化CpG結(jié)合蛋白2，抑制心肌細(xì)胞纖維化，減輕急性心肌梗死后心肌壞死纖維化程度[46]。此外，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-29和miR-24的表達(dá)增高以及miR-2、miR-15、miR-34和miR-130等表達(dá)降低，均能夠抑制心肌纖維化及炎癥進(jìn)程，改善心肌梗死后小鼠的心功能[47]。

4 中藥對(duì)心血管疾病中外泌體來源的miRNA的靶向干預(yù)作用

4.1復(fù)方中藥 補(bǔ)陽還五湯是治療因虛致瘀腦卒中后遺癥的常用中藥復(fù)方，在臨床上廣泛應(yīng)用于氣虛血瘀型的心血管疾病，如冠心病、高血壓等，均有較好的療效[48]。研究表明，補(bǔ)陽還五湯的有效成分可增加骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體miR-126表達(dá)，降低miR-221和miR-222的表達(dá)，同時(shí)還可激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管生成，減輕缺血性疾病的損傷[49]。miR-126可促進(jìn)腺苷酸活化蛋白激酶的表達(dá)，而且可激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，促進(jìn)血管生成，說明補(bǔ)陽還五湯中的有效成分能通過外泌體調(diào)控相應(yīng)miRNA的表達(dá)，促進(jìn)血管生成，改善缺血[50]。

通心絡(luò)是由人參、酸棗仁、赤芍、檀香、降香、水蛭、蟬蛻、蜈蚣、全蝎、土鱉蟲、乳香以及冰片12味中藥組成的復(fù)方提取物，臨床可用于冠心病心絞痛、急性心肌梗死以及缺血性腦卒中的治療?，F(xiàn)有研究表明，通心絡(luò)可以減少高脂飲食飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠的斑塊面積，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；通心絡(luò)還可通過抑制外泌體miR-155的分泌、阻斷miR-155的表達(dá)，達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的目的[51]。

4.2中藥單體

4.2.1丹皮酚 丹皮酚是中藥牡丹皮的提取物，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，是治療心血管疾病的常用藥。Liu等[52]研究表明，口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈粥樣斑塊較對(duì)照組(未口服丹皮酚的高脂ApoE-/-小鼠)顯著減少，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丹皮酚可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，增加內(nèi)皮細(xì)胞來源的外泌體miR-223表達(dá)，降低內(nèi)皮細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3和磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3的表達(dá)；同時(shí)進(jìn)一步闡明，丹皮酚在體內(nèi)外對(duì)血管炎癥反應(yīng)的保護(hù)機(jī)制與miR-223相關(guān)，增加miR-223的表達(dá)可降低內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究顯示，丹皮酚可通過增加高脂血癥大鼠血漿外泌體miR-223的表達(dá)，抑制下游核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎癥小體信號(hào)通路，減輕大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥，起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[53]。

4.2.2姜黃素 姜黃素是從姜科姜黃屬植物中提取的多酚類物質(zhì)，藥理作用廣泛，毒性低，耐受性好。現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)，姜黃素具有抗炎、抗血脂、抗氧化以及抑制血小板聚集等特性[54]。高同型半胱氨酸血癥可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，經(jīng)姜黃素處理的細(xì)胞外泌體可以減輕高同型半胱氨酸血癥導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損害，但其具體作用機(jī)制目前尚未明確[55]。另有研究顯示，經(jīng)姜黃素處理后，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞釋放的外泌體組成發(fā)生了改變，其外泌體富含的miR-21進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，從而下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中Ras同源物基因家族成員B的表達(dá)，維持內(nèi)皮屏障穩(wěn)定，同時(shí)姜黃素還減弱了外泌體的促血管生成作用[56]。維持血管內(nèi)皮穩(wěn)定可以減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂的風(fēng)險(xiǎn)，可能為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供新思路。

4.2.3淫羊藿苷 淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[57]。隨著研究的不斷深入，淫羊藿苷對(duì)心血管疾病的防治作用已得到證實(shí)[58]。現(xiàn)有研究證明，淫羊藿苷可以顯著提高缺氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖活性，抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可提高多種促血管生成相關(guān)miRNA在細(xì)胞和外泌體的表達(dá)；低濃度淫羊藿苷對(duì)外泌體miR-126的表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，miR-126經(jīng)過旁分泌的方式作用于心內(nèi)膜，并通過SPRED1(sprouty-related protein with an EVH1 domain 1)和磷酸肌醇-3-激酶調(diào)控亞基2介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和血管生成，在缺血性疾病中發(fā)揮積極作用[59]。

5 小 結(jié)

外泌體參與細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)傳遞，其分泌的miRNA在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。外泌體來源的miRNA具有促進(jìn)血管生成、調(diào)控細(xì)胞凋亡、抗炎、抑制纖維化等作用，在心血管疾病的治療方面有良好的應(yīng)用前景。中藥及其有效成分可以通過調(diào)節(jié)外泌體來源的miRNA的表達(dá)，發(fā)揮對(duì)心血管疾病的調(diào)控作用，這可能為臨床治療及新藥研發(fā)提供新的思路。但該領(lǐng)域的研究尚處于起步階段，仍需進(jìn)一步深入探究中藥對(duì)外泌體來源的miRNA的靶向干預(yù)機(jī)制。此外，對(duì)于同種疾病的不同證型，中藥對(duì)外泌體miRNA的影響是否會(huì)發(fā)生改變等也仍有待深入探討。相信未來外泌體來源的miRNA可能會(huì)成為中醫(yī)藥防治動(dòng)脈粥樣硬化的新靶點(diǎn)。