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    漢灘病毒感染誘導血管內(nèi)皮細胞多糖包被損傷及其機制初步研究

    2021-03-25 08:10:26王曉艷申煥君王平忠
    傳染病信息 2021年1期
    關(guān)鍵詞:肌醇聚糖磷脂

    杜 虹,王曉艷,李 璟,姜 泓,申煥君,王平忠

    漢灘病毒(hantaan virus,HTNV)是布尼亞病毒科漢坦病毒屬中的一種主要血清型,可引起以發(fā)熱、休克、出血和腎臟損害為主要臨床特征的腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)[1]。HTNV主要感染血管內(nèi)皮細胞,可引起血管滲漏和通透性增加[2],但其機制尚不清楚。

    多糖包被(glycocalyx,GCX)是內(nèi)皮細胞屏障結(jié)構(gòu)的重要組成部分,在維持血管內(nèi)皮完整性方面發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn),在感染或致炎因素作用下,細胞中某些酶(統(tǒng)稱為“脫落酶”)的表達或活性增加,它們可分解GCX,致GCX損傷,并釋放其組成成分[4]。保護或修復損傷的GCX對防止血管滲漏具有重要作用,可能成為潛在的治療靶點。然而,HTNV感染是否誘導血管內(nèi)皮細胞GCX損傷,其機制如何,目前尚不清楚。為此,本研究以HTNV感染的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells,HUVECs)為模型,以GCX為切入點,應用ELISA、間接免疫熒光(indirect immunofluorescence assay,IFA)、Western blot、實時定量PCR等技術(shù),探討HTNV感染誘導血管內(nèi)皮細胞GCX的損傷及其初步機制,為HFRS發(fā)病機制和治療靶點的研究提供新的資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料 VERO E6、HUVECs和HTNV 76-118株(HTNV 76-118,以下簡稱HTNV)均由本實驗室保存。VERO E6使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,HUVECs使用內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基(ScienCell,1001),培養(yǎng)條件為37 ℃ 5%CO2。硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)、透明質(zhì)酸(haluronic acid,HA)、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖的ELISA試劑盒均購自上海西唐生物科技有限公司。一抗抗體均購自abcam公司。

    1.2 ELISA檢測 應用HTNV感染HUVECs,收取不同感染時間點(0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h)細胞上清進行ELISA檢測。每一時間點,HS、CS、HA、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖均測定2次,取均值。以血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)和TNF-α刺激作為陽性對照,NC作為陰性對照。具體方法參照說明書。

    1.3 實時定量PCR檢測 收取HTNV感染不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h)的細胞沉淀,利用Trizol試劑提取總RNA。將每管中加入200 μl氯仿;離心后取上清液,加入等量的異丙醇過夜沉淀;離心后用75%的無水乙醇清洗沉淀;將沉淀晾干,每管中加入20 μl DEPC水溶解RNA;最后進行RNA濃度測量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒和2×SYBR染料進行實時定量PCR,檢測細胞中相關(guān)基因的mRNA表達水平。引物序列由上海生工公司進行合成,GAPDH作為內(nèi)參。

    1.4 Western blot檢測 利用蛋白裂解液收取HTNV感染不同時間點(0 h、1 h、6 h、12 h、18 h、24 h、48 h、72 h)的HUVECs,首先使用BCA試劑盒進行蛋白定量;其次用5×Loading Buffer在100 ℃條件下加熱10 min制樣;最后進行Western blot檢測,每孔上樣20 μg,利用GAPDH作內(nèi)參。

    1.5 免疫熒光檢測 HTNV感染HUVECs 48 h后,用4%多聚甲醛固定15 min;0.3% TritonX-100處理5 min;5% BSA室溫封閉2 h;一抗4 ℃過夜孵育;羊抗兔FITC二抗室溫孵育1 h;DAPI染色5 min;加入抗熒光猝滅劑封片,在顯微鏡下觀察拍照。

    1.6 TEER檢測 HTNV感染被彈性蛋白酶抑制劑(1 μM)預處理的HUVECs,于不同時間點(0 h、6 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h)應用跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance,TEER)檢測HUVECs的跨膜電阻。

    1.7 統(tǒng)計學處理 應用Graphpad統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。蛋白用半定量描述,核酸用定量描述,2組間定量資料比較用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 細胞上清液中HS、CS、HA、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖的表達水平 利用ELISA檢測細胞上清液中HS、CS、HA、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖的表達,結(jié)果如圖1所示。HTNV感染后,細胞培養(yǎng)液中HA表達先上升后下降,HS和CS表達逐漸上升;可溶性CD138中LPS組和TNF-α組在24 h達到最高峰,HTNV、VEGF在24 h達到最高峰并維持至48 h;磷脂酰肌醇聚糖的表達與可溶性CD138相似。

    圖1 不同時間點HUVECs上清液中GCX表達變化Figure 1 Change of expression of glycocalyx in supernatant of HUVECs at different time points

    2.2 HTNV感染HUVECs后CD44、CD138和磷脂酰肌醇聚糖的表達 利用實時定量PCR和Western blot檢測HTNV感染不同時間點CD138、磷脂酰肌醇聚糖和CD44的表達,結(jié)果如圖2所示。隨著HTNV感染的持續(xù),CD138 mRNA表達水平先上升后下降,在48 h達到最高峰,上調(diào)3.68倍(U=6.350,P=0.000);CD138蛋白表達水平逐漸升高,并持續(xù)至72 h。磷脂酰肌醇聚糖mRNA表達水平逐漸上升,在72 h上調(diào)2.47倍(U=9.404,P=0.011);磷脂酰肌醇聚糖蛋白表達水平在12 h出現(xiàn)上調(diào),并持續(xù)升高至72 h。CD44 mRNA表達水平在12 h達到最高值,隨后逐漸下降,但差異并無統(tǒng)計學意義(U=2.389,P=0.134);CD44蛋白表達水平在24 h達到最高峰。

    圖2 不同時間點HUVEC細胞中GCX表達變化*.與1 h比較,P<0.05Figure 2 Change of expression of glycocalyx in HUVECs at different time points

    2.3 HTNV感染HUVECs后麥胚凝集素(wheat germ agglutinin,WGA)的分布 利用間接免疫熒光法觀察HTNV感染HUVECs 48 h后,WGA的細胞分布。WGA能與N-乙酰糖胺結(jié)合,可識別糖蛋白和糖肽中,特別是細胞膜中復雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)。由于HS、HA和CS均屬糖蛋白,因此用FITC標記的WGA染色細胞,其結(jié)果反映了細胞膜上總的糖蛋白分布。結(jié)果如圖3所示,與未處理組相比,HTNV感染后細胞上綠色熒光減少。

    圖3 HTNV感染HUVECs后WGA分布NC.正常對照;Merge.WGA與DAPI染色合并處理Figure 3 WGA distribution in HUVECs after HTNV infection

    2.4 HTNV感染HUVECs后乙酰肝素酶、透明質(zhì)酸酶和中性粒細胞彈性蛋白酶的表達 利用實時定量PCR和Western blot檢測HTNV感染不同時間點乙酰肝素酶、透明質(zhì)酸酶和中性粒細胞彈性蛋白酶的表達,結(jié)果如圖4所示。隨著感染時間的持續(xù),乙酰肝素酶mRNA表達水平在48 h上調(diào)2.23倍(U=9.782,P=0.002);蛋白表達水平先上升后下降,在24 h達到最高峰。中性粒細胞彈性蛋白酶mRNA表達水平逐漸上升,在24 h上調(diào)2.76倍(U=18.870,P=0.000);蛋白表達水平同樣在24 h顯著性上調(diào)。透明質(zhì)酸酶mRNA表達水平逐漸上升,但差異無統(tǒng)計學意義(U=2.076,P=0.106)。

    圖4 HTNV感染HUVECs后分解酶的變化*.與1 h比較,P<0.05Figure 4 Changes of decomposition enzymes in HUVECs after HTNV infection

    2.5 彈性蛋白酶抑制劑處理HUVECs Western blot結(jié)果顯示,隨著彈性蛋白酶抑制劑濃度的升高,中性粒細胞彈性蛋白酶的蛋白表達水平逐漸下降(圖5A)。選取抑制劑最佳處理濃度(1 μM)預處理HUVECs,聯(lián)合HTNV感染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HTNV感染24 h和48 h時,CD44的蛋白表達水平均低于HTNV組(圖5B)。TEER檢測結(jié)果顯示,HTNV處理HUVECs后TEER值逐漸下降;在給予彈性蛋白酶抑制劑(1 μM)預處理后,TEER值上升(圖5C)。

    圖5 彈性蛋白酶抑制劑處理HUVECs后CD44和通透性的變化Figure 5 Changes of CD44 and permeability in HUVECs after elastase inhibitor treatment

    3 討 論

    GCX主要由蛋白聚糖(proteoglycans,PGs)及其與氨基葡聚糖(glycosaminoglycans,GAG)共價鍵結(jié)合的復合體構(gòu)成。PGs的核心蛋白主要是多配體蛋白聚糖(syndecans,其中syndecan-1即為CD138)和磷脂酰肌醇聚糖。GAG的主要成分包括HS、CS和HA[5]。HA可與細胞表面受體CD44結(jié)合,保持親水特性,起到穩(wěn)定GCX結(jié)構(gòu)的作用。有研究認為,GCX在微血管生理,尤其是在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮通透性、血管緊張度及凝血方面起到重要作用[6]。目前,針對病毒感染誘導GCX損傷的相關(guān)研究較少,包括艾滋病患者接受抗病毒治療過程中出現(xiàn)腎臟血管內(nèi)皮GCX破壞繼而引發(fā)腎功能不全[7]、登革熱患者血清中HA和HS水平變化與疾病嚴重程度相關(guān)[8]、登革病毒(dengue virus,DENV)NS1蛋白通過MIF1引起GCX降解的基礎(chǔ)研究等。但是至今尚未查閱到關(guān)于HTNV誘導血管內(nèi)皮細胞GCX損傷的基礎(chǔ)研究報道。

    本研究觀察到,HTNV感染HUVECs后,隨著時間的延長,細胞上清液中HA、HS、CS、可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖的水平均有升高,表明HTNV感染或LPS、VEGF、TNF-α處理HUVECs后均可出現(xiàn)GCX破壞。這與Glasner等[9]的研究結(jié)果相似,DENV非結(jié)核蛋白NS1通過破壞內(nèi)皮細胞GCX,誘導人肺血管內(nèi)皮細胞(DENV主要感染的靶細胞)的高透通性。本課題組前期研究顯示,不同分型及分期HFRS患者外周血可溶性CD138水平出現(xiàn)明顯變化,可溶性CD138可作為重癥HFRS早期預警及預后評估的標志物[10]。Steppan等[11]研究發(fā)現(xiàn),循環(huán)中syndecan-1(可溶性CD138)水平與膿毒癥患者預后密切相關(guān),與對照組相比,膿毒癥及手術(shù)組患者血清syndecan-1表達顯著升高;膿毒癥患者syndecan-1較手術(shù)組表達更高;膿毒癥和手術(shù)組syndecan-1與IL-6之間存在很強的相關(guān)性。也有研究顯示,膿毒性休克患者外周血HS碎片表達水平明顯升高[12]。這提示HTNV感染引起的GCX脫落,可作為內(nèi)皮損傷的靶向標志物。

    本研究還觀察到,GCX骨架中的兩個主要成分(CD138和磷脂酰肌醇聚糖)及HA的主要膜受體CD44 mRNA和蛋白表達在HTNV感染HUVECs 后均出現(xiàn)升高,其中,CD44的表達上調(diào)同細胞上清中HA的表達趨勢一致。究其原因可能與HTNV感染引起GCX主要骨架成分CD138和磷脂酰肌醇聚糖表達上調(diào),隨后伴隨骨架斷裂破壞,導致游離的可溶性CD138和磷脂酰肌醇聚糖水平升高有關(guān)。此外,由CD138和磷脂酰肌醇聚糖側(cè)鏈結(jié)合的GAG組分(HS、CS等)可能同步出現(xiàn)脫落,使HS、CS的水平也升高。

    目前認為,諸多因素如感染、低氧、炎癥因子、高血容量、外傷及心臟大血管手術(shù)等均可造成內(nèi)皮GCX的損傷,除機械或外力因素損傷外,其他損傷機制尚不清楚[13]。尋找切割GCX組分的特異性脫落酶是探索GCX損傷機制的一個關(guān)注點。有研究發(fā)現(xiàn),乙酰肝素酶可從細胞膜表面蛋白如磷脂酰肌醇聚糖切割HS側(cè)鏈,釋放HS。透明質(zhì)酸酶可水解HA中的β-N-乙酰氨基已糖糖苷鍵,釋放HA[14]。本研究顯示,HTNV感染HUVECs后,乙酰肝素酶、透明質(zhì)酸酶、中性粒細胞彈性蛋白酶在蛋白及mRNA表達水平均有升高,其與細胞上清液中HS、HA和可溶性CD138水平變化基本一致,提示HTNV感染HUVECs后,可能通過上調(diào)或活化上述3種酶,致GCX組分酶解、脫落,從而引起HS、CS、HA、CD138等成分水平升高。一些出血熱病毒,如DENV、埃博拉病毒可能也伴隨內(nèi)皮細胞GCX的損傷[9,15-17]。亦有研究認為,漢坦病毒和DENV感染可引起基質(zhì)金屬蛋白酶的活化,后者可能參與syndecans的脫落[18]。通過本研究結(jié)果,我們認為:包括HTNV在內(nèi)的多種出血熱病毒感染可能通過活化或上調(diào)多種脫落酶,降解GCX,致細胞屏障破壞,這為深入探討HTNV感染致血管內(nèi)皮細胞GCX損傷及通透性改變提供了重要資料,抑制切割GCX組分的特異性酶可能作為臨床治療嚴重血管滲漏的一個重要潛在靶點。

    為進一步驗證脫落酶可能參與HTNV感染致HUVECs中GCX損傷,本研究選取了中性粒細胞彈性蛋白酶為代表,應用彈性蛋白酶抑制劑預處理HUVECs,然后用HTNV感染,觀察細胞通透性變化及彈性蛋白酶作用下CD44蛋白的表達有無變化。結(jié)果顯示,經(jīng)彈性蛋白酶抑制劑預處理的HUVECs,其TEER值上升,CD44蛋白表達也低于HTNV組,提示彈性蛋白酶抑制劑可能降低血管通透性。其原因可能是通過抑制中性粒細胞彈性蛋白酶的表達或活性,減少其對CD44的分解,增加HA與CD44的胞膜結(jié)合,進而減少HA的脫落,保護了GCX結(jié)構(gòu)的完整性。

    本研究仍存在一定的局限性。首先,受實驗條件限制,在細胞層面,研究中納入的樣本數(shù)較少,缺少必要的樣本重復,在一定程度上降低了統(tǒng)計學效力;此外,本研究仍為初步研究,不排除研究結(jié)果受多種混雜與偏倚因素的影響。后續(xù)將進一步擴大樣本量,增加重復實驗,對上述結(jié)果行進一步驗證。

    綜上所述,HTNV感染可能引起血管內(nèi)皮細胞GCX損傷,通過上調(diào)或活化某些脫落酶,酶解GCX,致屏障結(jié)構(gòu)破壞,通透性升高,這為闡明HTNV感染致血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制提供了更多理論依據(jù)。

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