SARS-CoV-2核酸復(fù)陽(yáng)患者臨床特點(diǎn)及不同標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果分析

姜 芬，丁 坤，李紹先，徐 軍，徐艷麗

2019新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在全球200多個(gè)國(guó)家和地區(qū)持續(xù)暴發(fā)[1-2]，病原體為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2），屬β冠狀病毒[3]。是繼中東呼吸綜合征冠狀病毒和嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒之后的第三種引起人類嚴(yán)重呼吸道疾病的人畜共患病冠狀病毒，也是近20年來第一種引發(fā)全球大流行的冠狀病毒。

對(duì)潛伏期患者、無癥狀感染者SARS-CoV-2脫落和播散的研究[4-5]以及從糞便中持續(xù)檢出SARSCoV-2的報(bào)道引發(fā)了相關(guān)研究者對(duì)該感染性疾病管理控制的廣泛關(guān)注[6-7]。某些COVID-19患者病毒核酸檢測(cè)出現(xiàn)復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象，盡管大多推測(cè)與檢測(cè)靈敏度有關(guān)[8]，但亦可能與病毒載量低或病毒脫落規(guī)律不同有關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在出院患者中病毒核酸檢測(cè)在短暫連續(xù)2次或以上陰性后復(fù)陽(yáng)的患者數(shù)占出院患者總數(shù)的21.4%[9]；此外，超過20.0%的患者在呼吸道標(biāo)本病毒核酸轉(zhuǎn)陰后，其糞便標(biāo)本的病毒核酸檢測(cè)仍呈陽(yáng)性[10]，部分出院患者胃腸道標(biāo)本中病毒核酸檢測(cè)持續(xù)陽(yáng)性[11]。推測(cè)SARSCoV-2可能通過糞-口途徑傳播，增加了二次傳播的風(fēng)險(xiǎn)，也解釋了醫(yī)院感染的原因，如何根據(jù)各類患者特征進(jìn)行針對(duì)性管理和預(yù)防控制尤為重要。本研究對(duì)COVID-19出院患者鼻咽拭子和糞便標(biāo)本病毒脫落時(shí)間進(jìn)行隨訪，以評(píng)價(jià)復(fù)陽(yáng)患者的臨床特征和病毒轉(zhuǎn)陰時(shí)間，以期為COVID-19患者管理控制提供針對(duì)性指導(dǎo)意見。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2019年1月15日—2020年2月10日煙臺(tái)市奇山醫(yī)院收治的43例COVID-19確診患者為研究對(duì)象。根據(jù)住院期間是否出現(xiàn)鼻咽拭子或痰液標(biāo)本病毒核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)，將患者分為復(fù)陽(yáng)組（n=15）與未復(fù)陽(yáng)組（n=28）。出院后隔離期間每4～7 d復(fù)查鼻咽拭子和糞便標(biāo)本病毒核酸，因患者咳痰癥狀均已消失，遂出院隨訪未采集痰液標(biāo)本。本研究符合1975年赫爾斯基宣言并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意。

1.2 方法 收集所有研究對(duì)象的一般資料及臨床特征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、治療措施（包括抗病毒、免疫調(diào)節(jié)劑、呼吸支持、抗生素治療等）、流行病學(xué)史資料以及病毒核酸檢測(cè)結(jié)果。所有患者均按照國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》[12]進(jìn)行診斷和治療；采用實(shí)時(shí)熒光反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

1.3 相關(guān)定義及標(biāo)準(zhǔn) 患者出院標(biāo)準(zhǔn)：①體溫恢復(fù)正常3 d以上（不使用皮質(zhì)類固醇或退熱劑）；②呼吸道癥狀明顯好轉(zhuǎn)；③肺部影像學(xué)顯示炎癥明顯吸收；④連續(xù)2次呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陰性（采樣時(shí)間間隔≥24 h）。初始病毒核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間：SARS-CoV-2核酸檢測(cè)至少2次連續(xù)陰性結(jié)果中首次陰性的時(shí)間。病毒核酸復(fù)陽(yáng)患者：在至少連續(xù)3次病毒核酸檢測(cè)陰性后（采樣時(shí)間間隔＞24 h），再次出現(xiàn)病毒核酸陽(yáng)性者。病毒最長(zhǎng)脫落時(shí)間：從發(fā)病之日起至連續(xù)2次病毒核酸檢測(cè)陰性之日為止，且在至少2周的隨訪期間未出現(xiàn)核酸檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果。其中，對(duì)于病毒核酸復(fù)陽(yáng)患者，病毒最長(zhǎng)脫落時(shí)間為從發(fā)病之日起至隨訪期間最后一次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)呈陽(yáng)性之日。間斷陰性狀態(tài)：連續(xù)2次或以上病毒核酸RT-PCR檢測(cè)為陰性后病毒核酸復(fù)陽(yáng)之前的狀態(tài)，時(shí)間計(jì)算為從第1 d核酸檢測(cè)為陰性到連續(xù)陰性檢測(cè)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)正常參考值：白細(xì)胞計(jì)數(shù)（3.5～9.5）×109/L、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（1.8～6.3）×109/L、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（1.1～3.2）×109/L、血小板計(jì)數(shù)（125～ 350）×109/L、CRP 0～5 mg/L、血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A,SAA）＜10 mg/L。

1.4 標(biāo)本采集 采集患者鼻咽拭子、痰和糞便標(biāo)本，并將樣本存放于2～8 ℃的病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中。痰液標(biāo)本，鼓勵(lì)患者嚴(yán)重咳嗽，將痰液收集到一次性無菌旋轉(zhuǎn)蓋取樣杯中，加入2 ml蛋白酶K（1 g/L），30 min內(nèi)進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)；血清樣本收集于血清分離管中進(jìn)行離心操作。

1.5 SARS-CoV-2核酸檢測(cè) 使用QIAamp病毒核酸迷你試劑盒試劑（德國(guó)凱杰）提取和純化核酸。使用SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因，中國(guó)廣州）進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，針對(duì)SARS-CoV-2基因組的Orf1ab區(qū)域和N基因，使用QuantStudio 5 RT-PCR系統(tǒng)（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。陽(yáng)性定義為2次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)至少1次成功擴(kuò)增，周期閾值為40。中間陰性RT-PCR結(jié)果持續(xù)＜3 d或＜2次連續(xù)試驗(yàn)視為無效或假陰性結(jié)果[9]?；颊呷朐汉?，每隔1 d采集鼻咽拭子標(biāo)本和痰標(biāo)本進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，直至患者符合出院標(biāo)準(zhǔn)。出院后每4～7 d收集患者鼻咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本，進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS 9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般特征 43例患者中男性22例（51.2%），女性21例（48.8%），中位年齡47.0（37.0，54.0）歲，入院時(shí)發(fā)病中位時(shí)間為3.0（2.0，6.0）d，住院中位時(shí)間為25.0（19.0，29.0） d，10例（23.3%）患者具有基礎(chǔ)疾病史（高血壓、糖尿病、支氣管哮喘、潰瘍性結(jié)腸炎、冠心病及貧血），5例（11.6%）患者為重癥患者。所有患者均接受抗病毒藥物（利托那韋/洛匹那韋）治療；21例（48.8%）患者接受經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療；41例（95.3%）患者從入院開始接受吸入IFN治療（8000 U，2噴/次，3次/d）；12例（27.9%）患者CD4淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)異常下降，接受胸腺肽皮下注射治療（1.6 mg，2次/周）；8例（18.6%）患者接受氧療；經(jīng)治療后所有患者均完全康復(fù)。復(fù)陽(yáng)組和未復(fù)陽(yáng)組在年齡、性別、入院時(shí)發(fā)病時(shí)間、基礎(chǔ)疾病史等方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），復(fù)陽(yáng)組患者住院時(shí)間更長(zhǎng)（Z=0.425，P=0.016）。未復(fù)陽(yáng)組患者接受抗生素治療比例高于復(fù)陽(yáng)組（P＜0.05）。詳見表1。

表1 43例COVID-19患者的一般資料Table 1 General information of 43 COVID-19 patients

2.2 臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果 43例患者最常見的癥狀為咳嗽（88.4%）、咳痰（79.1%）和發(fā)熱（76.7%），上述癥狀的中位持續(xù)時(shí)間分別為18.0（8.0，26.0） d、10.5（5.0，20.0） d和7.0（3.5，10.5） d；大約1/3的患者伴有胸痛、焦慮/失眠等癥狀。入院時(shí)實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示25.6%患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，20.9%患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降，34.9%患者CRP水平升高，20.9%患者SAA水平升高。與未復(fù)陽(yáng)組相比，復(fù)陽(yáng)組患者均為普通型，最高體溫更低，咳痰持續(xù)時(shí)間更短，ESR、CRP、SAA水平更低（P均＜0.05）。詳見表2。

表2 43例COVID-19患者的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果[例(%)]Table 2 Clinical manifestations and laboratory test results of 43 COVID-19 patients[cases(%)]

2.3 實(shí)驗(yàn)室檢查

2.3.1 呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2脫落時(shí)間 43例患者鼻咽拭子和痰液標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸轉(zhuǎn)陰的中位時(shí)間分別為15.5（13.0，23.0）d和24.0（14.0，31.0）d，鼻咽拭子短于痰液樣本。雖然2組患者鼻咽拭子標(biāo)本病毒核酸初始轉(zhuǎn)陰時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但復(fù)陽(yáng)組鼻咽拭子標(biāo)本病毒最長(zhǎng)脫落時(shí)間顯著延長(zhǎng)，痰液標(biāo)本中病毒脫落時(shí)間較未復(fù)陽(yáng)組也顯著延長(zhǎng)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見表3。住院期間復(fù)陽(yáng)組患者中以鼻咽拭子標(biāo)本復(fù)陽(yáng)比例較高為93.3%（14/15），痰液標(biāo)本病毒核酸較少出現(xiàn)復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象，僅1例。

表3 43例 COVID-19患者的病毒核酸檢測(cè)/持續(xù)時(shí)間（d）Table 3 Viral nucleic acid test/duration of 43 COVID-19 patients(d)

2.3.2 糞便標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果及出院后隨訪 本研究中共采集了10例患者住院期間的糞便標(biāo)本并進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，其中4例顯示陽(yáng)性，均為復(fù)陽(yáng)組患者。更值得注意的是，這4例患者中，有3例在鼻咽拭子標(biāo)本核酸檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰后糞便標(biāo)本中仍能檢測(cè)到病毒核酸。為進(jìn)一步研究復(fù)陽(yáng)患者病毒脫落模式，對(duì)康復(fù)患者鼻咽拭子和糞便樣本病毒核酸進(jìn)行追蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)共有7例患者治愈出院后經(jīng)隨訪檢測(cè)到病毒核酸陽(yáng)性（5例糞便標(biāo)本病毒核酸陽(yáng)性，3例鼻咽拭子病毒核酸陽(yáng)性），其中1例鼻咽拭子和糞便標(biāo)本同時(shí)復(fù)陽(yáng)。上述出院后隨訪病毒檢測(cè)陽(yáng)性者均為住院期間鼻咽拭子病毒復(fù)陽(yáng)組患者，且患者糞便標(biāo)本病毒核酸陽(yáng)性持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)出院后19 d。

2.4 胸部CT 典型COVID-19患者胸部CT表現(xiàn)呈雙肺多發(fā)斑片狀磨玻璃影。本研究中所有患者出院時(shí)胸部CT表現(xiàn)均有改善，而呼吸道標(biāo)本SARS-CoV-2核酸復(fù)陽(yáng)和糞便標(biāo)本中病毒核酸持續(xù)陽(yáng)性患者均未發(fā)現(xiàn)胸部CT較前改變。

3 討 論

目前，SARS-CoV-2核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象被認(rèn)為是RT-PCR檢測(cè)假陰性的結(jié)果[11]，但尚未排除其他可能性。牛衛(wèi)東等[13]的研究表明痰液標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于咽拭子標(biāo)本和鼻拭子標(biāo)本。病毒脫落通常被視作傳染性的標(biāo)志[14]，研究表明，非危重患者呼吸道標(biāo)本中SARS-CoV-2脫落中位時(shí)間約為18～20 d，下呼吸道比上呼吸道標(biāo)本病毒脫落時(shí)間更長(zhǎng)[15-19]。另有報(bào)道稱約21.4%的患者在連續(xù)2次SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰后出現(xiàn)復(fù)陽(yáng)，連續(xù)3次鼻咽拭子陰性的患者肺中仍然有SARS-CoV-2殘留[9]。本研究中34.9%的患者在短暫的病毒核酸檢測(cè)轉(zhuǎn)陰后又復(fù)陽(yáng)，且與未復(fù)陽(yáng)組患者相比，該類患者多表現(xiàn)為輕度感染、輕度發(fā)熱、咳痰時(shí)間短，痰液標(biāo)本中病毒脫落時(shí)間較上呼吸道標(biāo)本更長(zhǎng)，糞便標(biāo)本病毒核酸陽(yáng)性率更高，與上述研究結(jié)果吻合。有研究結(jié)果顯示，在患者腸道原位檢測(cè)到病毒復(fù)制信號(hào)[20]或腸道高表達(dá)SARS-CoV-2感染所需受體[21]。根據(jù)本研究中病毒核酸復(fù)陽(yáng)患者不同部位采集標(biāo)本病毒清除時(shí)間、病毒持續(xù)脫落趨勢(shì)特征，推測(cè)胃腸道存在病毒受體的可能。有學(xué)者將患者病毒核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象歸因于取樣、RT-PCR檢測(cè)假陰性和核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間延長(zhǎng)等因素，然而，病毒感染在某些靶細(xì)胞潛伏或與相應(yīng)受體反應(yīng)的可能性并沒有被排除，這須要進(jìn)一步研究病毒載量、分離測(cè)序病毒株等。

有研究報(bào)道，較高病毒載量、上呼吸道較長(zhǎng)的病毒脫落時(shí)間與疾病嚴(yán)重程度有關(guān)[14，16，22]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)病毒脫落時(shí)間延長(zhǎng)與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)的證據(jù)，恰恰相反，本研究中復(fù)陽(yáng)組患者更多表現(xiàn)為輕癥，且5例重癥患者均未發(fā)生病毒核酸檢測(cè)結(jié)果復(fù)陽(yáng)的現(xiàn)象?？紤]結(jié)論不一致的原因可能為多方面，首先，本研究中的復(fù)陽(yáng)組并不能代表全部病毒清除延遲患者群體；其次，考慮慢性病毒脫落或病毒變異株產(chǎn)生[23-24]、機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答變化等因素導(dǎo)致患者病毒核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)或病毒清除延遲，而與疾病嚴(yán)重程度無關(guān)。

最近從COVID-19患者糞便樣本中分離得到SARS-CoV-2的研究證實(shí)，該病毒可能通過胃腸道傳播[25-28]，其他研究也發(fā)現(xiàn)57.1%的病毒核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)患者在其糞便樣本中檢測(cè)出SARS-CoV-2核酸，且持續(xù)時(shí)間比呼吸道樣本更長(zhǎng)，病毒載量峰值出現(xiàn)更晚[29-31]。本研究中也存在部分復(fù)陽(yáng)患者在其呼吸道樣本中幾乎檢測(cè)不到病毒核酸的情況下，糞便標(biāo)本依然呈現(xiàn)持續(xù)病毒核酸陽(yáng)性，且無臨床癥狀，與上述研究結(jié)果吻合，提示糞便標(biāo)本病毒檢測(cè)是判斷患者出院和解除隔離的另一種可行性指標(biāo)，特別是針對(duì)核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)患者。另外，本研究中未發(fā)現(xiàn)糞便標(biāo)本中病毒核酸檢出率和持續(xù)時(shí)間與疾病嚴(yán)重程度、疾病進(jìn)展的關(guān)系，與既往研究一致[32]，考慮可能與宿主免疫應(yīng)答或胃腸道黏膜免疫有關(guān)[33]。

綜上所述，SARS-CoV-2核酸復(fù)陽(yáng)患者更可能表現(xiàn)為輕癥感染，同時(shí)該類患者存在痰液標(biāo)本病毒脫落延遲和糞便標(biāo)本病毒核酸持續(xù)陽(yáng)性的特點(diǎn)，因而對(duì)病毒核酸復(fù)陽(yáng)患者應(yīng)給予特別關(guān)注和更長(zhǎng)時(shí)間的醫(yī)學(xué)觀察，以預(yù)防和控制疫情的再次傳播。

當(dāng)然，本研究也存在一定局限性，首先，本研究樣本量較小，對(duì)COVID-19患者的治療方案是經(jīng)驗(yàn)性的，實(shí)施的藥物干預(yù)特別是抗病毒藥物和免疫調(diào)節(jié)劑對(duì)病毒排出的影響尚未確定被排除；其次，本研究未進(jìn)行病毒載量和活病毒顆粒分離，不能從病毒核酸痕跡中得出具體的傳染性結(jié)論；再次，未進(jìn)行SARS-CoV-2的IgG或IgM抗體檢測(cè)來描述不同標(biāo)本陽(yáng)性檢測(cè)的精確時(shí)間窗。COVID-19作為一種新發(fā)傳染病，我們對(duì)于SARSCoV-2在臨床特征等方面的認(rèn)識(shí)尚有不足，仍須進(jìn)一步持續(xù)跟蹤探究，用以指導(dǎo)臨床、預(yù)后判斷和和傳播控制。