類風濕關節(jié)炎患者滑膜組織自身抗原及瓜氨酸化修飾的質(zhì)譜鑒定*

管曉龍，周 瑩，殷 茵，劉 菲，李曉軍，虞 偉，許曉紅△

(1.安徽醫(yī)科大學附屬婦幼保健院/安徽省婦幼保健院檢驗科，安徽合肥 230001；2.東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院中心實驗室，江蘇南京 210002；3.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，安徽合肥 230601)

類風濕關節(jié)炎(RA)是一種以滑膜慢性炎性反應、軟骨畸形、骨質(zhì)損傷、多種自身抗體產(chǎn)生及多器官功能障礙為特征的全身免疫性疾病[1]。瓜氨酸化作為一種經(jīng)典的翻譯后修飾，其誘導產(chǎn)生的抗瓜氨酸化蛋白抗體可出現(xiàn)在約70%的RA患者體內(nèi)，并且與疾病的進展密切相關[2-5]。目前，已有少數(shù)抗瓜氨酸化蛋白抗體應用于RA的實驗室診斷，如抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體，但由于靈敏度較低，導致部分患者漏診[2,5]。近年來，RA瓜氨酸蛋白質(zhì)組學研究成為熱點，CHANG等[6]將10例RA患者滑膜組織蛋白提取物進行合并，利用二維凝膠印跡、免疫共沉淀、質(zhì)譜技術，鑒定出7種瓜氨酸化抗原，包括α-1-抗胰蛋白酶、纖維蛋白原、角蛋白84和波形蛋白等。VAN BEERS等[7]先用凝膠電泳將RA患者滑膜液進行分餾、轉染，再使用多種抗體對其中的瓜氨酸蛋白進行標記，將其中2份富含多種瓜氨酸多肽的滑膜液進行質(zhì)譜分析，共鑒定出53條瓜氨酸多肽，血清學驗證后發(fā)現(xiàn)了3種新的自身抗原，分別是載脂蛋白E、髓核分化抗原、β-肌動蛋白，并提出只有少數(shù)瓜氨酸蛋白具有免疫原性。WANG等[8]采用類似的技術路線，利用基質(zhì)輔助串聯(lián)時間飛行質(zhì)譜在RA患者滑膜液中發(fā)現(xiàn)182種瓜氨酸肽段碎片，但未進行大樣本血清學驗證。目前的技術手段僅鑒定到部分瓜氨酸抗原，特別是抗CCP抗體(-)RA患者的瓜氨酸蛋白譜尚不十分清楚。因此，本研究主要借助免疫蛋白質(zhì)組學技術，以揭示RA特別是抗CCP抗體(-)患者滑膜的蛋白譜，為后續(xù)篩選相關生物標志物提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2013年1月至2016年1月收治的RA患者55例納入RA組，其中抗CCP抗體(+)RA組41例，抗CCP抗體(-)RA組14例，選擇同期系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者、健康體檢人群各41例分別納入SLE組及健康對照組。

1.2儀器與試劑 電泳儀購自BIO-RAD公司，超聲細胞粉碎機購自美國Sonics公司，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自美國Thermo-Fisher公司。磷酸鹽緩沖液、硼酸緩沖液、聚乙二醇6000購自美國Sigma公司，瓊脂糖珠protein A購自美國GE Healthcare公司，胰蛋白酶購自美國Promega公司，蛋白酶抑制劑、組織蛋白裂解液購自美國Thermo-Fisher公司。

1.3方法

1.3.1標本采集 留取抗CCP抗體(+)、抗CCP抗體(-)RA患者滑膜組織，骨性關節(jié)炎及創(chuàng)傷性關節(jié)炎患者手術切除的滑膜組織標本各1份。采集所有研究對象血液標本，分離血清。

1.3.2分離血清中IgG-γ球蛋白 (1)先將各組研究對象的血清標本分別等量混合，各取0.1 mL混合血清加入0.2 mL硼酸緩沖液混勻，之后每管加入0.3 mL聚乙二醇6000，析出沉淀后放入冰箱4 ℃過夜；(2)另取4個EP管，離心后各取0.6 mL血清上清液，每管緩慢加入0.6 mL飽和硫酸銨溶液，靜置30 min后離心；(3)沉淀物用46%飽和硫酸銨洗滌后離心，然后溶解于50 μL磷酸鹽緩沖液備用。

1.3.3提取滑膜組織蛋白組分 分別稱取20 mg滑膜組織放于EP管中，每管加入500 μL組織蛋白裂解液和50 μL蛋白酶抑制劑，剪碎后再用超聲細胞粉碎機粉碎，離心后取上清液備用(均在冰上操作)。

1.3.4免疫共沉淀 (1)先取3 μL血清IgG-γ球蛋白和40 μL瓊脂糖珠protein A相結合，NP-40裂解液洗滌后棄去上清液；(2)再分別加入200 μg滑膜蛋白提取液混勻后靜置2 h，離心后棄上清液。

1.3.5蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解 (1)利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳將滑膜組織抗原成分進行分離，目標條帶脫色至清晰后備用；(2)將每個目標條帶切成6個大小適宜小膠條，加入脫色液后脫色至無色；(3)加入乙腈潤洗后用真空離心濃縮儀進行脫水干燥，再加入500 μL純水振蕩洗滌后棄上清液；(4)加入NH4HCO3溶液振蕩洗滌后棄上清液；(5)加入10 μL胰蛋白酶，膠條搗碎后37 ℃孵育過夜；(6)每管加入200 μL純乙腈，靜置離心后吸取溶液收集備用；(7)每管加入100 μL萃取液，孵育30 min后加入200 μL純乙腈，靜置離心后吸取上清液，將前后兩次收集的上清液進行合并，其中輕鏈與重鏈兩管合并，其余4管合并，真空凍干后備用。

1.3.6質(zhì)譜鑒定 將標本凍干粉溶解于含5%甲醇及0.2%甲酸的溶液中，取20%含重鏈與輕鏈成分的溶液上樣，取50%含其他組分的溶液上樣，每份樣品進行2個循環(huán)檢測。樣品進入C18色譜柱后進行分離，依次進入高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行檢測。再利用Mascot軟件在美國國家生物技術信息中心(NCBI)參考序列數(shù)據(jù)庫中進行檢索匹配。

1.4統(tǒng)計學處理 蛋白篩選必須滿足未卡離子分數(shù)值≥20，且特有肽段碎片個數(shù)≥1個。RA組蛋白FOT值>SLE組和健康對照組FOT值的3倍即判定為上調(diào)蛋白，F(xiàn)OT值

2 結 果

2.1RA滑膜總蛋白譜鑒定結果 利用質(zhì)譜技術共鑒定出594種蛋白，其中抗CCP抗體(+)RA組鑒定出278種蛋白，抗CCP抗體(-)RA組鑒定出255種蛋白，SLE組鑒定出395種蛋白，健康對照組鑒定出191種蛋白?？笴CP抗體(+)RA組有125種上調(diào)蛋白，抗CCP抗體(-)RA組有87種上調(diào)蛋白；抗CCP抗體(+)RA組有18種下調(diào)蛋白，抗CCP抗體(-)RA組有40種下調(diào)蛋白。

僅在抗CCP抗體(+)RA組中特異表達的蛋白有60種，F(xiàn)OT值最高的前10種蛋白為角蛋白15、肌動蛋白、AATF蛋白、DNA結合蛋白5、Meckelin蛋白、中心體相關蛋白350、Ⅱ型肌醇3、G蛋白偶聯(lián)受體、纖毛內(nèi)轉運蛋白81、纖維調(diào)節(jié)蛋白；而在抗CCP抗體(-)RA滑膜中特異表達蛋白有69種，F(xiàn)OT值最高的前10種蛋白為角蛋白31、角蛋白36、角蛋白19、角蛋白73、組蛋白H2B 1-K型、組蛋白H2A 3型、胰蛋白酶6、角蛋白83、過氧化物酶4型、黏蛋白樣蛋白1。

2.2瓜氨酸修飾蛋白譜鑒定結果 RA組共鑒定出17種瓜氨酸修飾蛋白，其中抗CCP抗體(+)RA組有10種瓜氨酸化蛋白，包括半胱氨酸蛋白酶14、聚吡啶結合蛋白1、組蛋白H2A 2C型、角蛋白1、角蛋白2、Ⅵ膠原α-2鏈、角蛋白 9、角蛋白5、角蛋白10、Ⅵ膠原α-3鏈?？笴CP抗體(-)RA組有14種瓜氨酸化蛋白，包括載脂蛋白D、髓過氧化物酶、角蛋白16、角蛋白14、組蛋白H2A 3型、組蛋白 H2A 2-C型、角蛋白2、角蛋白 9、角蛋白1、角蛋白5、角蛋白10、Ⅵ膠原α-3鏈、肌動蛋白、顆粒酶H。

2.3瓜氨酸修飾短肽序列鑒定結果 取精氨酸及左右相鄰7個氨基酸組成一條瓜氨酸短肽(共15個氨基酸序列)，抗CCP抗體(+)RA組有12條瓜氨酸短肽過表達，抗CCP抗體(-)RA組有10條瓜氨酸短肽過表達，其中角蛋白2的3條瓜氨酸短肽在RA組中均表達上調(diào)，見表1、2。

表1 抗CCP抗體(+)RA組表達上調(diào)的瓜氨酸短肽序列

表2 抗CCP抗體(-)RA組表達上調(diào)的瓜氨酸短肽序列

3 討 論

本研究主要借助免疫蛋白質(zhì)組學技術，利用混合血清分離的IgG-γ球蛋白從滑膜組織中結合抗原分子，揭示了RA患者滑膜組織的自身抗原表達譜。抗CCP抗體(+)RA組上調(diào)蛋白中，纖維調(diào)節(jié)蛋白是一種位于細胞外基質(zhì)中富含亮氨酸的小分子蛋白多糖，該蛋白參與膠原纖維成熟、微血管形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展、動脈粥樣硬化等多種生理、病理過程[9]。纖維調(diào)節(jié)蛋白是關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)的重要組成部分，在幼兒、青少年的關節(jié)軟骨中纖維調(diào)節(jié)蛋白含有較多硫酸角質(zhì)素鏈，硫酸角質(zhì)素鏈的數(shù)量會隨著年齡的增長而減少，而在RA患者中硫酸角質(zhì)素鏈的數(shù)量也減少，提示纖維調(diào)節(jié)蛋白可作為臨床上RA潛在的治療靶點[9]。

抗CCP抗體(-)RA組上調(diào)蛋白中，過氧化物酶4屬于具有抗氧化功能的新蛋白家族成員，能通過調(diào)節(jié)過氧化氫信號傳導、氧化蛋白折疊、干預氧化還原平衡等影響細胞的增殖，還可以通過清除細胞內(nèi)及細胞外活性氧物質(zhì)來發(fā)揮其對抗氧化應激損傷的保護作用[10-11]。CHANG 等[12]同樣發(fā)現(xiàn)過氧化物酶4在RA患者滑膜組織、少數(shù)RA早期患者血漿中均發(fā)生過表達。過氧化物酶4在RA患者體內(nèi)過表達的原因可能是由于隨著病程的進展，加速的氧化應激反應刺激了內(nèi)源性抗氧化劑蛋白保護滑膜組織免受氧化應激的損傷[13]。RA下調(diào)蛋白中，抗CCP抗體(+)RA組有18種蛋白表達下調(diào)，抗CCP抗體(-)RA組有40種蛋白表達下調(diào)，目前RA下調(diào)蛋白缺乏足夠的臨床研究，有待進一步探討。

抗CCP抗體(-)RA患者體內(nèi)同樣存在瓜氨酸修飾的抗原，但只有少數(shù)瓜氨酸化蛋白具有抗體免疫原性，即與抗CCP抗體親和性較低，所以現(xiàn)有市場上使用的第二代和第三代CCP試劑盒仍然具有一定的局限性。WANG等[8]在RA患者滑膜液中發(fā)現(xiàn)多種瓜氨酸修飾的角蛋白，角蛋白是一種與RA發(fā)病存在高相關性的抗原分子[3]，本研究中RA患者體內(nèi)表達上調(diào)的蛋白中也同樣發(fā)現(xiàn)多種角蛋白亞型(如角蛋白1、2、9等)?？菇堑鞍卓贵w(AKA，靶抗原：食道上皮前絲聚蛋白及其酸性異構體)、抗核周因子(APF，靶抗原：前絲聚蛋白去磷酸化產(chǎn)物)、抗絲聚蛋白抗體(AFA)等絲聚蛋白相關的自身抗體作為RA相關生物標志物雖具有較高特異度，但靈敏度較低[3]。角蛋白的亞型較多，本研究發(fā)現(xiàn)角蛋白2的3條瓜氨酸化短肽在抗CCP抗體(+)RA組及抗CCP抗體(-)RA組中均表達，能否成為改進RA輔助診斷的潛在生物標志物仍需進一步驗證。

目前的研究依然存在一定的局限性，首先，可能會對滑膜組織中低豐度蛋白、與IgG親和性較低的部分抗原漏檢[14]。其次，與瓊脂糖珠、免疫復合物結合的非特異性蛋白可能會被識別導致假陽性的產(chǎn)生。為了減少非特異性結合，本研究優(yōu)化了實驗操作期間的洗滌條件，并且采用了具有高度親水性表面活性的瓊脂糖珠，其對蛋白質(zhì)的非特異性結合具有一定抵抗性。最后，目前RA組中僅鑒定出19條上調(diào)的瓜氨酸修飾短肽序列，其中Ⅵ型膠原短肽抗體用于RA的實驗室診斷，靈敏度為65.52%，特異度為78.95%，其在抗CCP抗體(-)RA患者人群中受試者工作特征(ROC)曲線下面積可達到0.956[14]，其余瓜氨酸短肽作為潛在的診斷標志物，尚未完成血清學驗證。后續(xù)工作將進一步比較本研究中RA血清抗體結合反應滑膜組織的抗原譜，以及前期工作中分析的RA患者滑膜組織親和純化免疫復合物中抗原表達譜[15]，兩者之間的差異可有助于明確滑膜組織抗原譜的組成及其來源屬性(游離沉積/原位沉積)。

4 結 論

抗CCP抗體(-)RA患者血清中同樣存在瓜氨酸化抗原，且抗CCP抗體(+)RA患者有12條瓜氨酸短肽表達上調(diào)，抗CCP抗體(-)RA患者有10條瓜氨酸短肽表達上調(diào)，差異蛋白的鑒定為尋找RA新的生物標志物提供了理論依據(jù)。