黔東南州紅心獼猴桃葉尖干枯病病原鑒定

張國(guó)輝，李向陽，顧煥先，張文華，佀勝利，李榮玉，李 明

（1凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州凱里556011；2貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴陽550025；3凱里市林業(yè)局森林植物防治檢疫站，貴州凱里556000）

0 引言

紅心獼猴桃屬中華獼猴桃中的紅肉獼猴桃變種，是早熟紅心品種和藥食兩用的珍稀品種，對(duì)人體有補(bǔ)血養(yǎng)顏和排毒防癌等的保健功效，對(duì)Vc缺乏癥、高血壓、心腦血管病和癌癥等有輔助療效[1-5]。紅心獼猴桃已成為貴州省黔東南州農(nóng)民增收的支柱產(chǎn)業(yè)，但果農(nóng)缺乏對(duì)獼猴桃病害知識(shí)和科學(xué)防控技術(shù)的了解，導(dǎo)致部分地區(qū)的果園病害日趨嚴(yán)重，影響了當(dāng)?shù)孬J猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。1998年，黃亞軍和戚佩坤首次采用常規(guī)分離病組織的手段對(duì)廣東省獼猴桃根腐病進(jìn)行了報(bào)道[6]，此后陸續(xù)報(bào)道有獼猴桃褐斑病[7-11]、炭疽病[12-15]、黑斑病[16]、黃化病[17-20]、細(xì)菌性葉枯病[21-24]、軟腐病[25-26]和根結(jié)線蟲病[27-30]等真菌病害，其中褐斑病、炭疽病、細(xì)菌性葉枯病、黑班病和黃化病均為葉部病害，是已報(bào)道的病害占比最多的。目前，國(guó)內(nèi)外尚無紅心獼猴桃葉尖干枯病的研究報(bào)道，此病害對(duì)紅心獼猴桃的危害遠(yuǎn)大于其他葉部病害的危害，嚴(yán)重者可導(dǎo)致整株死亡。筆者針對(duì)紅心獼猴桃葉尖干枯病的發(fā)病癥狀和病原鑒定進(jìn)行研究，采集標(biāo)本并進(jìn)行室內(nèi)病原分析，以期為紅心獼猴桃病害進(jìn)行補(bǔ)充并為后期的病害防治提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病害標(biāo)本 2019年10月—2020年5月在貴州省黔東南苗族侗族自治州黃平縣岑花村半坡組的紅心獼猴桃種植基地采集病株，并記錄該病害的發(fā)生癥狀。采集新鮮標(biāo)本于凱里市林業(yè)局檢驗(yàn)檢疫站用于病原菌的分離和鑒定。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PSA培養(yǎng)基。馬鈴薯削皮切塊，稱取200 g，1000 mL沸水中煮20 min，過濾加入蔗糖15 g，瓊脂粉17 g，加水補(bǔ)足1000 mL，分裝三角瓶，放于高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20～30 min。

1.1.3 儀器與試劑 高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、超凈工作臺(tái)、移植針、剪刀、鑷子、電磁爐、微波爐等。75%乙醇、0.1%升汞溶液、無菌水和工業(yè)酒精。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 癥狀的觀察和描述 觀察并描述紅心獼猴桃發(fā)病部位的病斑形態(tài)、顏色和發(fā)病部位及危害程度等，同時(shí)對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行拍照。

1.2.2 病原菌的分離純化和病原鑒定 采用組織分離法對(duì)紅心獼猴桃的病葉和病莖進(jìn)行組織分離，即用剪刀剪取病組織3塊，在0.1%升汞溶液中浸泡2～3 min，然后放于75%乙醇浸泡2～3 s，再用無菌水漂洗3次，最后用鑷子夾取漂洗好的病組織呈“品”字形放于PSA固體培養(yǎng)基中，并將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)5～7天。用移植針對(duì)長(zhǎng)成的菌落進(jìn)行2次純化，直至獲得純培養(yǎng)為止。當(dāng)純化后的菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)基，取菌落中央部分的菌絲挑取一點(diǎn)放于載玻片上，在顯微鏡下進(jìn)行對(duì)病原菌的典型形態(tài)特征進(jìn)行鏡檢拍照，同時(shí)對(duì)孢子大小和菌絲進(jìn)行觀察、測(cè)量和記錄。

采用核糖體rDNA-ITS(Internal transcribed spacer)區(qū)序列分析法進(jìn)行DNA測(cè)序，將ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，使用MEGA 4.0軟件構(gòu)建分子進(jìn)化樹，最后結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果對(duì)致病菌進(jìn)行分類鑒定。

1.3 病原回接

將純化后的病原真菌先在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7天，用無菌水反洗下的孢子液配制成濃度為106個(gè)/mL的菌懸液，采用針刺法和噴霧法在紅心獼猴桃的新鮮葉片進(jìn)行菌懸液接種。待葉片產(chǎn)生典型病斑后，根據(jù)柯赫氏法則，再采用組織分離法對(duì)病斑進(jìn)行分離和純化，最后將分離到的病原菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀的觀察和描述

紅心獼猴桃的病葉發(fā)病初期，首先在葉尖正面出現(xiàn)暗褐色變色干枯，后期隨著病害的加重和蔓延，葉尖病斑向葉柄方向大面積擴(kuò)散，病部呈現(xiàn)大面積的深褐色干枯狀壞死，發(fā)病部位的病健組織交界處明顯，病斑邊緣多為不規(guī)則形。獼猴桃葉片發(fā)病后期嚴(yán)重時(shí)，病斑可橫跨葉脈，2/3的葉片呈大面積褐色壞死斑，葉片正面呈焦枯卷曲狀（圖1a）。紅心獼猴桃發(fā)病葉片的背面呈深灰褐色，葉脈呈暗褐色，病健交界處明顯，葉片卷曲和皺縮明顯（圖1b）。且病葉所在的技條外觀正常，但輕折易斷，肉眼可見折斷的莖內(nèi)呈現(xiàn)清晰的環(huán)形褐變，即發(fā)生維管束褐變（圖1c）。

2.2 病原菌的分離純化和病原鑒定

在PSA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)7天后，邊緣規(guī)則圓形，菌絲灰色，氈狀，菌落中心有白色和橘紅色圓形小突起（圖1d）。病原菌可產(chǎn)生2種孢子，厚垣孢子為串生或單生，無色，大小為(6.98～20.45)μm×(5.38～18.26)μm（圖1e）；分生孢子呈長(zhǎng)橢圓形或長(zhǎng)卵圓形，單胞，無色，大小為(0.9～2.9)μm×(0.9～1.2)μm（圖1f）。采用形態(tài)學(xué)觀察及核糖體rDNA-ITS(internal transcribed spacer)區(qū)序列分析法進(jìn)行鑒定。對(duì)ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)，結(jié)合分子進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果（圖2），菌株與Epicoccum sorghinum聚為一類（圖2），確定該致病菌為高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)。鑒于高粱附球菌(E.sorghinum)可導(dǎo)致植物枝枯和葉斑等癥狀，結(jié)合紅心獼猴桃的發(fā)病特點(diǎn)，暫將其命名紅心獼猴桃葉尖干枯病。

圖1 紅心獼猴桃葉尖干枯病的病葉和病原菌

圖2 紅心獼猴桃葉尖干枯病的病原菌的分子進(jìn)化樹

2.3 病原回接

根據(jù)柯赫氏法則，將配制好的孢子懸浮液經(jīng)針刺法接種于紅心獼猴桃的葉片上，3他后，紅心獼猴桃的葉片開始發(fā)病長(zhǎng)出病斑，4天后病斑布滿全葉，病葉深褐色，呈干枯皺縮狀（圖3）。采用組織分離法分離病斑上的病原菌并進(jìn)行顯微鑒定，結(jié)果表明再次分離的菌株與接種的病原菌菌株相同，由此可以證明接種菌株為紅心獼猴桃葉尖干枯病的致病菌。

圖3 病原菌高粱附球菌回接發(fā)病癥狀

3 結(jié)論與討論

貴州省黔東南苗族侗族自治州的紅心獼猴桃產(chǎn)業(yè)對(duì)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民創(chuàng)收有重要作用，為減少經(jīng)濟(jì)損失，特對(duì)產(chǎn)區(qū)當(dāng)前發(fā)生重要病害進(jìn)行病害調(diào)查，結(jié)果表明由病原菌高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)導(dǎo)致的紅心獼猴桃葉尖干枯病的發(fā)病癥狀嚴(yán)重，為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，貴州省黔東南州黃平縣岑花村半坡組的紅心獼猴桃種植基地葉尖干枯病的發(fā)病癥狀較嚴(yán)重，可導(dǎo)致葉片的大面積枯死，并在莖桿處產(chǎn)生維管束的褐變現(xiàn)象。其病原菌為高粱附球菌屬于附球菌屬(Epicoccum)真菌，可引起多種作物的莖枯、枝枯和果腐等癥狀，因此嚴(yán)重地影響了受害植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[31]。至于葉尖干枯病的病原菌報(bào)道，已往的研究報(bào)道多為莖點(diǎn)霉(Phoma lilii)[32]、葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)[33]和葉點(diǎn)霉(Phyllosticta oryzicola)[34]，而在本研究中并未分離到以上這3類病原菌，只分離到高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)，并采用了形態(tài)學(xué)顯微鏡檢鑒定結(jié)合分子生物學(xué)的鑒定方法。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于高粱附球菌的報(bào)道很少?，F(xiàn)有資料表明，高粱附球菌既可以作為病原菌危害作物，又可以作為內(nèi)生菌具有抑菌活性[35]。附球菌屬是小雙腔菌科(Didymellaceae)的一類重要的植物病原真菌[36-37]，可侵染經(jīng)濟(jì)作物、農(nóng)作物、林木、雜草等[38-39]，引起多種作物如皇竹草[40]、火龍果[41]、蘋果[42]、越橘[43]等的莖枯、基腐、葉斑、枝枯、果腐等癥狀，可嚴(yán)重影響被侵染植物的生長(zhǎng)和發(fā)育[44]。本研究未進(jìn)行防控試驗(yàn)，但曾慧蘭等[31]曾詳細(xì)研究報(bào)道由E.sorghinum導(dǎo)致的百合葉尖干枯病，并提出啶酰菌胺對(duì)E.sorghinum的抑制作用最強(qiáng)，考慮到高粱附球菌對(duì)紅心獼猴桃植株產(chǎn)生致命危害，可把啶酰菌胺用于紅心獼猴桃葉尖干枯病的防控藥劑備選。