小麥TaHPPR基因的克隆與表達(dá)分析

郝小聰，王偉偉，張風(fēng)廷，孫 瑞，房兆峰，柳 珊，曹志琛，朱文根，趙昌平，汪德州，唐益苗

（北京市農(nóng)林科學(xué)院雜交小麥工程技術(shù)研究中心，北京100097）

0 引言

羥基苯丙酮酸還原酶(Hydroxyphenylpyruvate Reductase-HPPR)屬于D-異構(gòu)體特異性2-羥基酸脫氫酶家族[1]。該家族中的酶以NADH或NADPH作為輔酶催化2-酮酸可逆地還原成D-2-羥基酸，糖酵解和檸檬酸循環(huán)是產(chǎn)生NADH的主要來源，NADH分子是線粒體中能量生產(chǎn)的控制指標(biāo)[2]。研究發(fā)現(xiàn)HPPR對4-羥苯基丙酮酸(pHPP)具有最高的親和力，其中pHPP是植物光合作用的重要組成[3-4]，HPPR催化pHPP還原為4-羥苯基乳酸(pHPL)，是酪氨酸生物合成迷迭香酸Rosmarinic acid(RA)的關(guān)鍵酶[5-6]。

HPPR基因廣泛存在于植物中，擬南芥HPPR家族包含 4個HPPR基因 ，HPR1，HPPR2(AT1G79870)，HPPR3(AT1G12550)和HPPR4(AT2G45630)，其 中HPPR2和HPPR3編碼功能性羥基苯丙酮酸還原酶[7]。擬南芥中的HPR1是一種過氧化物酶體酶，參與了光呼吸循環(huán)，HPPR2、HPPR3和HPPR4負(fù)責(zé)將酪氨酸轉(zhuǎn)化為酚類化合物，并在胞質(zhì)溶膠中為光呼吸循環(huán)提供支路，其中HPPR4催化活性較低可能參與其他生物學(xué)過程[8-9]。為進(jìn)一步分析HPPR基因的時空表達(dá)模式，構(gòu)建擬南芥過表達(dá)相應(yīng)啟動子-GUS載體的轉(zhuǎn)基因植株，在幼苗中，HPPR2在植株中非特異性表達(dá)，HPPR3主要在根中表達(dá)，HPPR4主要在毛狀根和葉脈中毛狀體表達(dá)；在花序中，HPPR2再次廣泛表達(dá)，HPPR3和HPPR4在幼花的雄蕊中觀察到表達(dá)。其中HPPR4是花藥壁特異性基因，在花藥中特異性表達(dá)的，在特定階段阻斷了花藥的發(fā)育途徑，從而導(dǎo)致花藥發(fā)育異常[10]。丹參羥基苯丙酮酸還原酶(HPPR)基因SmHPPR在RA的生物合成中起重要作用。SmHPPR在莖和根中高度表達(dá)但在葉中弱表達(dá)，SmHPPR定位于細(xì)胞質(zhì)中，SmHPPR含有特定的催化結(jié)構(gòu)域與NAD(P)H結(jié)合，可能是光呼吸活性的細(xì)胞溶質(zhì)NADPH依賴性羥基丙酮酸還原酶[11]。夏枯草羥基苯丙酮酸還原酶基因(PvHPPR)屬于2-羥基酸脫氫酶家族，PvHPPR基因在根中的相對表達(dá)量最高，受水楊酸和乙烯的調(diào)節(jié)，PvHPPR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，過表達(dá)PvHPPR基因發(fā)現(xiàn)PvHPPR蛋白參與夏枯草中迷迭香酸的生物合成，并獲得較高RA含量的毛狀根株系[12]。在紫蘇中擴(kuò)增HPPR基因的啟動子序列，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)其啟動子序列包含多種順式作用元件，包括激素響應(yīng)相關(guān)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件、光周期響應(yīng)元件等[13]。但小麥HPPR基因的研究還未見報道。

小麥?zhǔn)侵袊闹饕Z食作物，也是能最大限度適應(yīng)惡劣環(huán)境條件的主要作物[14]，在全球范圍內(nèi)也被廣泛種植[15]。逆境脅迫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的主要因素，其中高溫、干旱和鹽堿是限制作物產(chǎn)量的主要非生物脅迫因素，嚴(yán)重影響了作物生長、發(fā)育、結(jié)實(shí)，是全球減產(chǎn)的重要原因[16-17]。探明小麥抗逆機(jī)理對小麥育種和栽培具有重要意義。

本研究根據(jù)擬南芥中RA生物合成相關(guān)基因HPPR4(AT2G45630)的序列信息，通過同源克隆獲得HPPR4直系同源基因TaHPPR，并對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)特異性分析。通過非生物脅迫處理，在鹽脅迫下該基因表達(dá)的抑制效果最顯著。以小麥抗鹽品種‘京冬8’、較敏感品種‘京411’和敏感品種‘小白麥’為研究對象[18]，進(jìn)行小麥抗鹽性表達(dá)特性分析，為研究其對逆境脅迫應(yīng)答的反應(yīng)及對小麥抗鹽性的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其處理

本實(shí)驗(yàn)室保存的‘太原806’、‘小白麥’、‘京冬8’及‘京411’為供試材料[19]。將‘太原806’種子在25℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行16 h/d的光照水培培養(yǎng)。幼苗水培生長2周（14天）后，進(jìn)行干旱（濾紙吸干水，空氣中晾干）、脫落酸(200 mol/L ABA)、高 鹽(250 mmol/L NaCl)、低溫(4℃)的脅迫處理，然后取各種幼苗處理0、2、5、8、12、24 h后的葉片[20]。以同樣的條件對‘京冬8’、‘京411’、‘小白麥’種子進(jìn)行高鹽(200 mmol/L NaCl)[21]脅迫處理，然后取各幼苗葉片，液氮冷凍，置于-80℃冰箱備用，便于進(jìn)行接下來的目的基因脅迫表達(dá)分析。

取北京海淀種植的開花15天后‘太原806’的不同組織：根、莖、葉、小花（除雄蕊）、穎殼、葉鞘，液氮冷凍[22]，置于-80℃冰箱備用，便于進(jìn)行接下來的目的基因組織特異性表達(dá)分析。

取均勻一致的‘京冬8’、‘京411’及‘小白麥’的種子，用0.1% HgCl2消毒5 min，清水沖洗干凈。發(fā)芽前未進(jìn)行鹽脅迫處理，在25℃的培養(yǎng)室中進(jìn)行每天16 h的光照水培培養(yǎng)，種子萌發(fā)3天后，選取萌發(fā)一致的小麥種子放入96孔水培盒中。將水培盒置于15℃的光照培養(yǎng)箱中，每天12 h光照，12 h黑暗，3個品種都進(jìn)行0、200 mmol/L的2個濃度梯度水平的鹽脅迫處理，培養(yǎng)8天，然后統(tǒng)計(jì)根長、株高、干重、鮮重和根數(shù)的數(shù)據(jù)，用于分析小麥不同品種在鹽脅迫下幼苗生長狀況[23]。

1.2 提取RNA及合成cDNA

小麥不同組織器官和幼苗總RNA提取的主要試劑是Trizol、氯仿、異丙醇、無RNase的水[24]，在提取過程中，要盡量減少RNA的降解。提取完成的RNA測定OD260/280值，同時通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，置于-80℃冰箱備用。用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)。合成后的cDNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小麥HPPR蛋白TaHPPR編碼基因克隆

利用NCBI網(wǎng)站下載小麥基因TraesCS2B02G048000的序列。根據(jù)下載的序列設(shè)計(jì)引物TaHPPR-F/TaHPPR-R（表1），使用‘太原 806’的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系50 μL，包括2×Phanta Max Master Mix（Vazyme，南京）25 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 2 μL、模板DNA(100 ng/L)2 μL、ddH2O 19 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端，為了保證擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，目的片段經(jīng)膠回收純化，并克隆到pEASY?-Blunt Cloning Ki（tTransGen，北京）載體上，加連接產(chǎn)物于Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜，PCR鑒定陽性克隆，正確后每個樣品選取3個獨(dú)立克隆進(jìn)行測序（北京六合華大基因公司）。

表1 引物名稱及序列

1.4 TaHPPR蛋白的生物信息學(xué)分析

從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站下載該基因的蛋白序列；利用Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站預(yù)測TaHPPR蛋白結(jié)構(gòu)。以TaHPPR的蛋白序列為目標(biāo)序列，在Gramene(WWW.gramene.org/)網(wǎng)站搜索，下載粗山羊草(Aegilops tauschii)、二粒小麥(Triticum dicoccoides)、短柄草(Brachypodium distachyon)、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)、水 稻 (Oryza sativa)、大 豆(Glycine max)的同源蛋白序列，并在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站中對上述蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，使用DNAMAN8軟件輸出序列比對結(jié)果。對于系統(tǒng)發(fā)育分析，使用MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)進(jìn)行多序列比對分析（參數(shù)使用網(wǎng)站默認(rèn)參數(shù)），Alignment導(dǎo)出比對結(jié)果，在MEGA6.0軟件中創(chuàng)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，使用鄰接法和泊松校正模型，其中檢驗(yàn)建樹質(zhì)量的Bootstrap method（步長檢驗(yàn)）值設(shè)置為1000次重復(fù)。

1.5 TaHPPR基因的表達(dá)分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/Wheat Exp/)網(wǎng)站對小麥TaHPPR基因的表達(dá)進(jìn)行預(yù)測分析，根據(jù)TaHPPR基因cDNA序列，避開保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)表達(dá)分析所用引物TaHPPR-qPCR-F/TaHPPR-qPCR-R（表1）。使用Actin作為內(nèi)參基因，將之前提取的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析。PCR反應(yīng)體系為 25 μL，包括 TB Green PremixExTaqTMII(2×)(TliRNaseH Plus)，Bulk 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL、cDNA 模板 2 μL(100 ng)，ddH2O 8.5 μL，輕彈管底將溶液混勻，短暫離心。PCR擴(kuò)增于CFX96 Real-Time PCR Detection System儀（Bio-Rad，美國）上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，進(jìn)行40個循環(huán)后增加熔解曲線環(huán)節(jié)，95℃變性5 s，60℃退火30 s，95℃變性15 s，用擴(kuò)增曲線和熔解曲線鑒定引物特異性。每次反應(yīng)作3次生物學(xué)重復(fù)，并采用2-△△CT法[25]計(jì)算基因相對表達(dá)量，同時計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 小麥TaHPPR亞細(xì)胞定位分析

瞬時表達(dá)載體構(gòu)建：利用同源克隆技術(shù)將小麥的TaHPPR基因CDS序列構(gòu)建到p16318hGFP載體上，引物為TaHPPR-GFP-F/TaHPPR-GFP-R（表1），終載體為p16318hGFP-TaHPPR(35S::TaHPPR::GFP)。

1.7 小麥原生質(zhì)體制備與轉(zhuǎn)化

酶解液溶液配方(10 mL)：15%纖維素酶(CellulaseR10)1 mL，4%離析酶(MacerozymeR10)1 mL，0.8 mol/L甘露醇5 mL，2 mol/L KCl 0.1 mL，0.2 mol/L 2-嗎啉乙磺酸(MES，KOH調(diào)pH至5.7)1 mL，55℃溶解10 min后再加入1 mol/L CaCl20.1 mL，1.5% BSA 1 mL，H2O 0.8 mL。40%(v/v)PEG solution(10mL)：PEG40004g，0.8mol/Lmannitol2.5 mL，1 mol/L CaCl21 mL，H2O 3 mL。W5(500 mL)：NaCl 9.0 g，CaCl218.4 g，2 mol/L KCl 1.25 mL，0.2 mol/L MES 5 mL。MMG solution(50 mL)：MgCl20.152 g，0.2 mol/L MES 1 mL，0.8 mol/L mannitol 25 mL。

新鮮配制酶解液，用0.45 μm的濾頭過濾除菌。幼苗水培1周（7天）后，取葉片制備原生質(zhì)體。剪取中部生長良好的葉片用刀片切成0.5～1 mm寬的葉條，將切好葉條放入酶解液中，并用鑷子讓葉子完全浸入酶解液。用真空泵于黑暗中抽30 min。在室溫中50 r/min 28℃搖動，酶解5 h，酶解液變綠時輕輕搖晃培養(yǎng)皿。用等體積的W5溶液稀釋含有原生質(zhì)體的酶液，過濾除去未溶解的葉片。用2.0 mL的離心管，4℃離心1～2 min沉淀原生質(zhì)體，去上清，然后用1000 μL冰上預(yù)冷的W5溶液輕柔重懸原生質(zhì)體。在冰上靜置30 min。離心去上清，然后用適量MMG溶液，重懸原生質(zhì)體，加入10～20μL的質(zhì)粒DNA，用移液器輕柔混勻后加入110μL PEG溶液，輕柔拍打離心管完全混合，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化混合物20～30 min。室溫下用400～440 μL W5溶液稀釋轉(zhuǎn)化混合液，然后輕柔上下顛倒離心管使之混合完全以終止轉(zhuǎn)化反應(yīng)。室溫下離心2分鐘然后去除上清。再加入1 mL W5溶液懸浮清洗一次，離心2 min去上清。加入200 μL W5溶液25℃過夜避光培養(yǎng)。激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP標(biāo)簽表達(dá)。黃化苗原生質(zhì)體的制備，參照上述方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaHPPR基因的克隆及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

以‘太原806’的cDNA為模板，利用引物TaHPPRF/TaHPPR-R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到大小為1000 bp左右的單一條帶（如圖1）。將目的片段純化、克隆并測序后，得到長度為975 bp的序列。通過BLAST比對測序結(jié)果確定目的基因結(jié)構(gòu)。TaHPPR轉(zhuǎn)錄本長度為975 bp，編碼324個氨基酸。利用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的 Conserved Domain Search Service(CD Search)，通過分析TaHPPR基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其含有NADB-Rossmann superfamily，TaHPPR屬于HPPR蛋白家族（如圖2）。

圖1 TaHPPR凝膠電泳擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 TaHPPR保守結(jié)構(gòu)域

2.2 TaHPPR同源蛋白序列的比對及進(jìn)化分析

對TaHPPR及其同源蛋白序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其與來源于二粒小麥(TRIDC2BG004220)、粗山羊草(AET2Gv20055400)、短柄草(BRADI_3g19270v3)、水稻(Os04g0107300)、大豆(GLYMA_07G082000)、擬南芥(AT2G45630)的NAD-binding domain蛋白序列相似性分別為100%、84%等。不同物種來源的HPPR蛋白均包含NAD-binding domain結(jié)構(gòu)域，且保守性較高（圖3）。利用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，單子葉和雙子葉植物中HPPR蛋白可分為兩類，其中小麥與二粒小麥親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖3 TaHPPR與其他6種植物HPPR序列比對

圖4 TaHPPR與其他6種植物HPPR系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 TaHPPR基因的組織特異性表達(dá)分析

利用WheatExp(https://wheat.pw.usda.gov/Wheat Exp/)網(wǎng)站下載轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對小麥TaHPPR基因不同組織的表達(dá)分析表明：該基因在籽粒、葉、根、穗、莖中均有表達(dá)，而在根中表達(dá)量最高（圖5）。將1.1中保存的‘太原806’供試材料反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，結(jié)果表明：TaHPPR基因在根中高度表達(dá)，在其他組織中相對表達(dá)量較低，此結(jié)果與小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫結(jié)果基本吻合，TaHPPR基因可能在小麥根器官發(fā)育發(fā)揮作用。

圖5 小麥TaHPPR基因在不同組織器官中的相對表達(dá)量

2.4 TaHPPR基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解TaHPPR基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)，以提取的‘太原806’不同脅迫處理材料的cDNA作為模板，采用熒光定量PCR技術(shù)對高鹽、干旱、低溫和脫落酸(ABA)處理下的小麥幼苗中該基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在高鹽脅迫處理下，TaHPPR表達(dá)量隨處理時間延長持續(xù)下降，說明該基因表達(dá)受高鹽脅迫抑制；在干旱脅迫處理下，該基因表達(dá)量在2 h下降，在5 h上升，然后又持續(xù)下降，但表達(dá)量均低于未處理；在低溫處理下該基因表達(dá)量均有所下降，8 h達(dá)到最低值；在ABA處理下該基因表達(dá)量持續(xù)下降，24 h基本回復(fù)正常水平。以上結(jié)果表明，TaHPPR基因在高鹽、干旱、低溫、ABA誘導(dǎo)下表達(dá)均受到不同程度抑制，其中鹽脅迫下該基因表達(dá)的抑制效果最顯著。

圖6 小麥TaHPPR基因在不同脅迫處理下的相對表達(dá)量

2.5 小麥不同抗鹽性品種中TaHPPR基因的表達(dá)分析

小麥不同品種間抗鹽性存在明顯差異，為進(jìn)一步研究該基因的鹽脅迫調(diào)控模式，選用了已報道過的抗鹽品種‘京冬8’、較敏感品種‘京411’和敏感品種‘小白麥’[18]進(jìn)行鹽脅迫處理。為驗(yàn)證‘京冬8’、‘京411’、‘小白麥’的抗鹽性，本研究對其進(jìn)行了高鹽脅迫的鑒定試驗(yàn)。所用的3個品種在受到相同濃度(200 mmol/L)的NaCl高鹽脅迫后，根長和株高、根數(shù)、干重、鮮重均低于對照組。其中3個品種處理后的株高，都與對照組存在極顯著差異；‘京411’處理后的根長存在極顯著差異；‘京411’與‘小白麥’處理后的鮮重存在極顯著差異，‘小白麥’干重實(shí)驗(yàn)組與對照組存在極顯著差異。3個品種根數(shù)的處理組與對照組差異不顯著。綜上所述可以判斷‘京冬8’的抗鹽性明顯高于‘京411’和‘小白麥’（如圖7）。

圖7 小麥不同品種的抗鹽性鑒定

為了進(jìn)一步了解高鹽脅迫條件下TaHPPR基因的表達(dá)情況，對抗鹽性不同的3個品種的鹽脅迫材料進(jìn)行了實(shí)時熒光定量試驗(yàn)。結(jié)果顯示該基因在‘京411’和‘小白麥’的鹽脅迫處理后的表達(dá)量均低于未處理，而在抗鹽性更強(qiáng)的‘京冬8’中，表達(dá)量高于對照組，且在24 h達(dá)到最高值，說明該基因可能參與抗鹽的調(diào)節(jié)（如圖8）。

圖8 小麥TaHPPR基因在不同品種鹽脅迫處理下的相對表達(dá)量

2.6 TaHPPR的亞細(xì)胞定位

通過瞬時表達(dá)系統(tǒng)，利用PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，使用激光共聚焦顯微鏡觀察葉片原生質(zhì)體細(xì)胞的GFP熒光位置，確定TaHPPR蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的定位。結(jié)果（圖9）表明：明場下觀察所有細(xì)胞具有完整、規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)，mCherry通道下，細(xì)胞內(nèi)葉綠體自發(fā)熒光清楚，葉綠體形態(tài)良好，表明細(xì)胞生長發(fā)育正常。在488 nm激發(fā)光下，TaHPPR-GFP融合蛋白的綠色熒光清晰的聚集在細(xì)胞質(zhì)中有點(diǎn)狀分布，而在只含GFP的對照細(xì)胞35S::GFP中，綠色熒光信號沒有明確的細(xì)胞器定位，綠色熒光在全細(xì)胞范圍彌散。將所有通道圖片整合后的Merged圖片顯示，初步判斷TaHPPR-GFP融合蛋白定位于線粒體中。

圖9 小麥TaHPPR蛋白的亞細(xì)胞定位

3 討論與結(jié)論

HPPR基因在植物中普遍存在，并且已經(jīng)在擬南芥、丹參和紫蘇等植物中被報道[13]。然而作為世界最重要的糧食作物之一的小麥，目前HPPR相關(guān)基因尚未被報道。本研究基于擬南芥基因HPPR4基因序列，在小麥中同源克隆了該基因，序列比對結(jié)果表明，所有HPPR蛋白均包含NAD-binding domain結(jié)構(gòu)域，且位置完全相同，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)TaHPPR屬于HPPR蛋白家族。

TaHPPR基因在根、莖、葉、花、籽粒中均有表達(dá)，在根中高度表達(dá)，在其他組織中相對表達(dá)量較低，此結(jié)果與小麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫結(jié)果基本吻合，同時與擬南芥HPPR3主要在根中表達(dá)、HPPR4主要在毛狀根和葉脈中毛狀體表達(dá)、丹參SmHPPR在莖和根中高度表達(dá)但在葉中弱表達(dá)、夏枯草PvHPPR在根中的相對表達(dá)量最高的結(jié)果一致。該基因在小麥根器官表達(dá)量最高，原因可能是小麥等植物的耐鹽性與根尖細(xì)胞質(zhì)膜上ATPase活性之間存在著非常顯著的正相關(guān)，一定范圍內(nèi)的鹽脅迫，引起植物體內(nèi)Na+的積累，導(dǎo)致根尖細(xì)胞質(zhì)膜上的ATPase活化，因此增加了根細(xì)胞對Na+的清除并減少了Na+積累引起的破壞[26]；另一方面，小麥的根中基本不含有葉綠體，主要充斥著線粒體細(xì)胞器，進(jìn)一步的亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示TaHPPR蛋白定位于線粒體中，這一結(jié)果預(yù)示著其功能與線粒體有關(guān)，該基因可能通過線粒體影響活性氧的變化參與逆境脅迫調(diào)控過程。亞細(xì)胞定位結(jié)果與擬南芥HPPR1定位于過氧化物酶體、HPPR2和HPPR3、HPPR4定位于細(xì)胞質(zhì)中，丹參SmHPPR定位于細(xì)胞質(zhì)中，夏枯草PvHPPR定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的結(jié)果存在差異，小麥作為六倍體植物基因家族成員眾多，可能功能調(diào)控更加細(xì)致多元化，具體原因還需進(jìn)一步研究。

前人研究表明‘京冬8’品種在抗鹽方面表現(xiàn)為高抗、‘京411’表現(xiàn)為較敏感和‘小白麥’表現(xiàn)為中度敏感，本研究的結(jié)果與前人研究結(jié)果相一致，TaHPPR基因在不同耐鹽品種中的差異性表達(dá)變化說明TaHPPR基因的表達(dá)可作為耐鹽性檢測的參考指標(biāo)，對雜交育種具有現(xiàn)實(shí)意義。TaHPPR基因在高鹽、干旱、低溫、ABA誘導(dǎo)下表達(dá)均受到不同程度抑制，其中鹽脅迫下該基因表達(dá)的抑制效果最顯著。在此基礎(chǔ)上，對抗鹽性不同的品種進(jìn)行鹽脅迫處理，結(jié)果顯示：在‘京411’和‘小白麥’的鹽脅迫處理后的表達(dá)量均低于未處理組，而在耐鹽品種‘京冬8’中，鹽脅迫下TaHPPR基因表達(dá)上調(diào)，脅迫處理約24 h后表達(dá)量達(dá)到最高，說明該基因參與鹽脅迫應(yīng)答，但TaHPPR基因通過何種途徑調(diào)控小麥抗鹽性，還需進(jìn)一步研究。本研究推測，TaHPPR基因的精準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控是小麥鹽脅迫應(yīng)答的重要指標(biāo)，上述推論為小麥逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)及小麥抗鹽性研究提供了新的思路和方法。

小結(jié)：本文研究了小麥的羥基苯丙酮酸還原酶基因，其編碼324個氨基酸且含有NAD-binding domain結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)了TaHPPR基因在不同植物物種間的進(jìn)化保守性和變異性。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)TaHPPR基因主要在小麥根中表達(dá)；TaHPPR基因在低溫、干旱、高鹽和ABA脅迫處理下表達(dá)均有所下降；在抗鹽品種中，TaHPPR基因表達(dá)升高，而在敏感品種中，TaHPPR基因表達(dá)受到抑制。TaHPPR蛋白主要在線粒體中表達(dá)，過表達(dá)TaHPPR基因可能增加小麥的抗鹽性，其反應(yīng)機(jī)制還需進(jìn)一步研究。