apelin抑制肺動脈平滑肌細胞增殖的分子機制研究

柯蕊 肖雪 和平 張永紅 張偉 劉原

【摘要】 目的：明確apelin對PASMC增殖的影響，并探討相關的分子機制，為肺動脈高壓新藥的研發(fā)提供一定的理論和實驗依據(jù)。方法：體外培養(yǎng)大鼠PASMC，采用TGF-β1刺激原代PASMC增殖，給予apelin干預，應用Western blot檢測細胞中Smad2/3的磷酸化水平以及cyclin D1的蛋白水平，BrdU摻入法檢測各組細胞增殖情況。結果：apelin干預組Smad2/3的磷酸化水平低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。APJ siRNA轉染組Smad2/3的磷酸化水平高于apelin干預組（P<0.05）。apelin干預組cyclin D1蛋白水平低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。SB431542干預組cyclin D1蛋白水平高于apelin干預組（P<0.05）。apelin干預組PASMC增殖率低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。APJ siRNA轉染組、SB431542干預組及cyclin D1 siRNA轉染組PASMC增殖率均高于apelin干預組（P<0.05）。結論：apelin可通過與其受體APJ結合，進而調節(jié)TGF-β1/Smad/cyclin D1軸抑制PASMC的增殖。apelin對PASMC增殖的抑制作用以及潛在機制為研發(fā)新的靶向藥物提供了思路。

【關鍵詞】 肺動脈平滑肌細胞 增殖 apelin TGF-β1

Molecular Mechanism of apelin Inhibiting Proliferation of Pulmonary Arterial Smooth Muscle Cells/KE Rui， XIAO Xue， HE Ping， ZHANG Yonghong， ZHANG Wei， LIU Yuan. //Medical Innovation of China， 2021， 18（16）： 0-029

[Abstract] Objective： To clarify the effect of apelin on the proliferation of PASMC， and to explore the related molecular mechanism， and to provide a theoretical and experimental basis for the research and development of new drugs for pulmonary hypertension. Method： PASMC was cultured in vitro， and the proliferation of primary PASMC was stimulated by TGF-β1， and apelin intervention was given. The phosphorylation level of Smad2/3 and the protein level of cyclin D1 in the cells were detected by Western blot. BrdU incorporation method was used to detect cell proliferation in each group. Result： The phosphorylation level of Smad2/3 in apelin intervention group was lower than that in TGF-β1 stimulation group （P<0.05）. Phosphorylation level of Smad2/3 in APJ siRNA transfection group was higher than that in apelin intervention group （P<0.05）. The level of cyclin D1 protein in apelin intervention group was lower than that in TGF-β1 stimulation group （P<0.05）. cyclin D1 protein level in SB431542 intervention group was higher than that in apelin intervention group （P<0.05）. Proliferation rate of PASMC in apelin intervention group was lower than that in TGF-β1 stimulation group （P<0.05）. The proliferation rate of PASMC in APJ siRNA transfection group， SB431542 intervention group and cyclin D1 siRNA transfection group were higher than that in apelin intervention group （P<0.05）. Conclusion： apelin can regulate the TGF-β1/Smad/cyclin D1 axis to inhibit the proliferation of PASMC by binding to its receptor APJ. The inhibitory effect of apelin on the proliferation of PASMC and its potential mechanism provide an idea for the development of new targeted drugs.

[Key words] Pulmonary arterial smooth muscle cells Proliferation apelin TGF-β1

First-author’s address： The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.16.006

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是由多種因素引起的肺血管功能及結構性異常，導致肺血管阻力增加，引發(fā)肺動脈壓力升高的臨床綜合征[1]。肺動脈高壓的基本發(fā)病機制包括肺血管收縮、肺血管重塑以及原位微血栓形成，其中肺血管重塑為最主要的病理機制。目前研究認為，肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC）增殖在肺血管重塑過程中起著關鍵性作用[2-3]。因此，深入探討PASMC增殖的分子信號機制并尋找有效干預靶點，對防治肺動脈高壓具有重要意義。

apelin是一種血管活性多肽，其受體為孤兒G蛋白耦聯(lián)受體-血管緊張素受體AT-1相關的受體蛋白（APJ）。研究發(fā)現(xiàn)，apelin及其受體APJ在哺乳動物體內具有廣泛的生物學效應，具有抗炎、抑制血管平滑肌細胞增殖、舒張血管、降低血壓等作用，在防治血管增殖性疾病中具有重要的研究價值[4-5]。最近研究表明，在肺動脈高壓患者的apelin水平較正常人減低[6];給予外源性apelin可抑制PASMC增殖，逆轉肺動脈高壓動物模型中肺血管重塑，延緩肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展[7-8]。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是具有多向調節(jié)功能的生長因子，廣泛參與調控細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等[9]，且在肺動脈高壓的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[10-11]。在非PASMC的研究中發(fā)現(xiàn)，apelin可通過抑制TGF-β1信號通路抑制細胞的增殖[12-13]。然而，apelin是否通過抑制TGF-β1信號通路發(fā)揮抑制PASMC增殖的作用，目前尚未見報道。本研究將通過TGF-β1刺激原代PASMC增殖，探討apelin是否抑制TGF-β1誘導的PASMC增殖，并探討其中的分子機制，以期為防治肺血管重塑及肺動脈高壓的策略提供新的靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供;DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司;TGF-β1購自美國Peprotech公司;apelin多肽購自北京博奧森公司;BrdU細胞增殖檢測試劑盒購自中國上海麥約爾生物技術有限公司;Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司;大鼠APJ siRNA、cyclin D1 siRNA購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司;兔抗大鼠α-SM-actin單克隆抗購自英國Abcam公司;FITC標記的山羊抗兔IgG購自中國中杉金橋生物技術公司;兔抗大鼠p-Smad2/3、t-Smad2/3、cyclin D1單克隆抗體購自美國CST公司;兔抗大鼠GAPDH單克隆抗體、HRP標記抗兔二抗購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 原代大鼠PASMC的分離及培養(yǎng) 每次選取2只健康SD大鼠，體質量70～80 g，分離并采用組織貼塊法培養(yǎng)PASMC，應用抗α-SM-actin免疫熒光染色鑒定其純度，確保PASMC純度≥90%。取第3～6代PASMC接種于含10% FBS-DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。PASMC分為以下七組：對照組不處理;TGF-β1刺激組加10 ng/mL TGF-β1刺激24 h;apelin干預組預先給予1 nmol/L apelin處理細胞30 min，再加入

10 ng/mL TGF-β1刺激24 h;control siRNA轉染組在加入apelin前預先轉染control siRNA 24 h，再給予apelin干預30 min及TGF-β1刺激24 h;APJ siRNA 轉染組在加入apelin前預先轉染APJ siRNA 24 h，再給予apelin干預30 min及TGF-β1刺激24 h;SB431542干預組在加入apelin前預先給予10 μmol/L SB431542作用1 h，再給予apelin干預30 min及TGF-β1刺激24 h;cyclin D1 siRNA轉染組在加入apelin前預先轉染cyclin D1 siRNA 24 h，再給予apelin干預30 min及TGF-β1刺激24 h。

1.2.2 細胞轉染 采用Lipofectamin 2000試劑盒，待細胞至60%融合，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋siRNA和Lipofectamin試劑，混合后室溫培養(yǎng)20 min后加入細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細胞總蛋白，以免疫印跡方法檢測基因沉默效果。

1.2.3 Western blot 細胞收集并使用裂解緩沖液提取細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白定量后95 ℃煮沸10 min變性制樣，取等量蛋白上樣。運用SDS-PAGE聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠電泳進行蛋白分離，濃縮膠中電壓80 V，分離膠中電壓120 V，直至溴酚藍接近分離膠的底端停止電泳。含20%的甲醇轉印液轉印置（100 V，2 h）至PVDF膜上。緩沖液TBST涮洗，5%脫脂牛奶或5% BSA室溫下封閉2 h，緩沖液TBST洗膜5 min×3，加入一抗4 ℃孵育過夜。緩沖液TBST洗膜5 min×3，辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠、山羊抗兔二抗室溫下孵育2 h，緩沖液TBST洗膜5 min×3，ECL顯色，結果圖像采集，灰度值測定。

1.2.4 BrdU摻入法檢測細胞的增殖 應用BrdU試劑盒檢測、評價肺動脈平滑肌細胞增殖。細胞培養(yǎng)于96孔細胞培養(yǎng)板，1%小牛血清培養(yǎng)饑餓細胞使其處于靜止期，加入TGF-β1刺激細胞增殖。終止細胞培養(yǎng)前8 h加入BrdU繼續(xù)培養(yǎng)，隨后固定細胞、變性DNA、清洗細胞，加入BrdU抗體培養(yǎng)細胞，再次清洗細胞后加入辣根過氧化物酶標記的二抗培養(yǎng)，清洗細胞后加入TMB底物顯色，加入反應終止液后用分光光度計測量細胞的吸光度，吸光度的強弱與插入細胞DNA中的BrdU量成正比，從而反映出DNA合成（細胞增殖程度）。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組見比較采用ANOVA。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Western blot檢測細胞中Smad2/3的磷酸化水平 TGF-β1刺激組Smad2/3的磷酸化水平為對照組的（2.07±0.21）倍，apelin干預組Smad2/3的磷酸化水平為對照組（1.15±0.24）倍，低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。control siRNA組轉染Smad2/3的磷酸化水平為對照組的（1.04±0.18）倍，與apelin干預組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而APJ siRNA轉染組Smad2/3的磷酸化水平為對照組的（1.71±0.06）倍，高于apelin干預組（P<0.05），見圖1。

2.2 Western blot檢測各組細胞中cyclin D1蛋白水平 TGF-β1刺激組cyclin D1蛋白水平為對照組的（1.94±0.09）倍，apelin干預組cyclin D1蛋白水平為對照組的（1.16±0.25）倍，低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。SB431542干預組cyclin D1蛋白水平為對照組的（1.81±0.14）倍，高于apelin干預組（P<0.05），見圖2。

2.3 各組PASMC增殖情況 TGF-β1刺激組PASMC增殖率為對照組的（1.70±0.14）倍，apelin干預組PASMC增殖率為對照組的（1.26±0.07）倍，低于TGF-β1刺激組（P<0.05）。control siRNA轉染組PASMC增殖率為對照組的（1.28±0.07）倍，與apelin干預組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;APJ siRNA轉染組PASMC增殖率為對照組的（1.52±0.13）倍，高于apelin干預組（P<0.05）。SB431542干預組PASMC增殖率為對照組的（1.63±0.14）倍，高于apelin干預組（P<0.05）。cyclin D1 siRNA轉染組PASMC增殖率為對照組的（1.57±0.18）倍，高于apelin干預組（P<0.05）。見圖3。

3 討論

apelin是從牛胃組織中分離出來的一種血管活性多肽，其受體APJ具有7個跨膜單位，與G蛋白耦聯(lián)。apelin及APJ廣泛分布于哺乳動物的多種組織（腦、肺、心臟、血管等）中[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，apelin在肺動脈高壓患者肺組織及血漿中表達減低，且有望成為肺動脈高壓的一個生物標志物[6]。給予肺動脈高壓動物外源性apelin可改善肺血管重塑，增強心肌收縮力，延緩肺動脈高壓的發(fā)生發(fā)展[7-8]。

TGF-β1是具有多向調節(jié)功能的生長因子，屬于TGF-β超家族，廣泛參與調控細胞的增殖、分化、凋亡以及遷移等。TGF-β1與其受體結合后可誘導Smad2/3蛋白磷酸化，磷酸化的Smad2/3與Smad4結合形成轉錄復合物進入細胞核，通過激活細胞核內其他轉錄因子或抑制DNA轉錄，調控細胞增殖[16-18]。相關研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧、野百合堿誘導的肺動脈高壓動物模型TGF-β1/Smad信號通路活性明顯增強。激活TGF-β1/Smad信號通路可以促進PASMC增殖;而抑制TGF-β1/Smad信號通路，可逆轉肺血管重塑及肺動脈高壓的形成[19-20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，apelin可抑制TGF-β1下游Smad2/3活化，下調細胞周期蛋白cyclin D1的蛋白表達，并抑制PASMC的增殖。預先抑制其APJ受體可逆轉apelin對Smad2/3活性、cyclin D1蛋白表達以及對PASMC增殖的影響，apelin及apelin介導的信號通路有望成為治療肺動脈高壓的新靶點。本研究發(fā)現(xiàn)，預先抑制Smad2/3亦可逆轉apelin對cyclin D1蛋白表達以及PASMC增殖的影響;最后抑制cyclin D1可逆轉apelin對PASMC增殖的影響。以上結果提示，apelin可通過與其受體APJ結合，進而調節(jié)TGF-β1/Smad/cyclin D1軸抑制PASMC的增殖。

肺動脈高壓是一種常見的臨床綜合征，目前的治療藥物雖在一定程度上降低了患者的肺動脈阻力和壓力，但這些藥物常伴有較明顯的不良反應，且治療費用極為昂貴。近年來的研究表明，apelin可以降低多種腫瘤的發(fā)病率以及逆轉血管增殖性疾病的血管重塑，在腫瘤及血管增殖性疾病中具有重要的研究價值[14-15]。

本研究證實了apelin對PASMC增殖的抑制作用以及潛在機制，為研發(fā)新的靶向藥物提供了思路。apelin可能成為治療肺動脈高壓的潛在藥物，然而外源性apelin治療肺動脈高壓的有效性、安全性及最佳治療劑量等問題仍需進一步的試驗來驗證。

參考文獻

[1]中華醫(yī)學會呼吸病學分會肺栓塞與肺血管病學組，中國醫(yī)師協(xié)會呼吸醫(yī)師分會肺栓塞與肺血管病工作委員會，全國肺栓塞與肺血管病防治協(xié)作組，等.中國肺動脈高壓診斷與治療指南（2021版）[J].中華醫(yī)學雜志，2021，101（1）：11-51.

[2] Kim D，George M P.Pulmonary Hypertension[J].Med Clin North Am，2019，103（3）：413-423.

[3] Mandras S A，Mehta H S，Vaidya A.Pulmonary Hypertension：A Brief Guide for Clinicians[J].Mayo Clin Proc，2020，95（9）：1978-1988.

[4] Antushevich H，Wójcik M.Apelin in disease[J].Clin Chim Acta，2018，483：241-248.

[5] Liu W，Yan J，Pan W，et al.Apelin/Elabela-APJ：a novel therapeutic target in the cardiovascular system[J].Ann Transl Med，2020，8（5）：243.

[6] Samareh Fekri M，Etminan A，Rashidnedjad A，et al.Serum Apelin Peptide Level in Hemodialysis Patients With Pulmonary Arterial Hypertension[J].Iran J Kidney Dis，2018，12（4）：209-214.

[7] Yang P，Read C，Kuc R E，et al.A novel cyclic biased agonist of the apelin receptor，MM07，is disease modifying in the rat monocrotaline model of pulmonary arterial hypertension[J].Br J Pharmacol，2019，176（9）：1206-1221.

[8]茍永英，劉東，李剛，等.外源性Apelin調節(jié)自噬對防治大鼠肺動脈高壓形成的作用[J].四川大學學報（醫(yī)學版），2020，51（2）：193-199.

[9] Kajdaniuk D，Marek B，Borgiel-Marek H，et al.Transforming growth factorβ1（TGFβ1）in physiology and pathology[J].Endokrynol Pol，2013，64（5）：384-396.

[10] Wang J，F(xiàn)eng W，Li F，et al.SphK1/S1P mediates TGF-β1-induced proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells and its potential mechanisms[J].Pulm Circ，2019，9（1）：2045894018816977.

[11] Guignabert C，Humbert M.Targeting transforming growth factor-βreceptors in pulmonary hypertension[J].Eur Respir J，2021，57（2）：2002341.

[12]吳媛媛，孫秀珍，劉昀，等.Apelin抑制小鼠氣道平滑肌細胞增殖的作用及機制[J].實用醫(yī)學雜志，2019，35（2）：177-180.

[13] Wang L Y，Diao Z L，Zheng J F，et al.Apelin attenuates TGF-β1-induced epithelial to mesenchymal transition via activation of PKC-εin human renal tubular epithelial cells[J].Peptides，2017，96：44-52.

[14] Yang Y，Lv S Y，Ye W，et al.Apelin/APJ system and cancer[J].Clin Chim Acta，2016，457：112-116.

[15] Luo X，Liu J，Zhou H，et al.Apelin/APJ system：A critical regulator of vascular smooth muscle cell[J].J Cell Physiol，2018，233（7）：5180-5188.

[16] Xia W，Lo C M，Poon R Y C，et al.Smad inhibitor induces CSC differentiation for effective chemosensitization in cyclin D1-and TGF-β/Smad-regulated liver cancer stem cell-like cells[J].Oncotarget，2017，8（24）：38811-38824.

[17] Zhao Y，Wang L，Wang Y，et al.Astragaloside IV inhibits cell proliferation in vulvar squamous cell carcinoma through the TGF-β/Smad signaling pathway[J].Dermatol Ther，2019，32（4）：e12802.

[18] Hu H H，Chen D Q，Wang Y N，et al.New insights into TGF-β/Smad signaling in tissue fibrosis[J].Chem Biol Interact，2018，292：76-83.

[19] Yue Y，Li Y Q，F(xiàn)u S，et al.Osthole inhibits cell proliferation by regulating the TGF-β1/Smad/p38 signaling pathways in pulmonary arterial smooth muscle cells[J].Biomed Pharmacother，2020，121：109640.

[20] Bellaye P S，Yanagihara T，Granton E，et al.Macitentan reduces progression of TGF-β1-induced pulmonary fibrosis and pulmonary hypertension[J].Eur Respir J，2018，52（2）：1701857.

（收稿日期：2021-01-11） （本文編輯：田婧）