超臨界流體色譜法同時測定海洋水體及沉積物中的4 種雙酚

干雅平，樓超艷，朱巖，甘露，陳佳萍

（1.杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江大學(xué) 化學(xué)系，浙江 杭州 310000；3.浙江大學(xué)校醫(yī)院，浙江杭州 310027）

海洋環(huán)境中，有機污染物種類繁多，對這些有機污染物進行監(jiān)測和控制對海洋生態(tài)系統(tǒng)的保護具有重要意義。內(nèi)分泌干擾物（endocrine disrupting compounds，EDCs）是一類廣泛存在于海洋環(huán)境的重要外源性污染物質(zhì)，也被稱為環(huán)境激素（environmental hormones），這類化合物會干擾生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能，影響人體的正常新陳代謝［1］。隨著社會的進步和科技的發(fā)展，海洋生態(tài)安全越來越受關(guān)注，雙酚類化合物（bisphenols，BPs）作為一類典型的內(nèi)分泌干擾物，其在海洋環(huán)境中的分布亦廣受關(guān)注［2］。雙酚類化合物由2 個羥基苯酚通過橋接碳或其他化學(xué)結(jié)構(gòu)鍵合而成，成本低廉、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。由于雙酚類化合物具有良好的延展性，被廣泛用作環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯（PC）塑料生產(chǎn)中的原料單體和聚氯乙烯（PVC）塑料的添加劑［3］。因雙酚類化合物的無序排放，造成工業(yè)廢水、城市污水、地表河流、海洋水體及其水體沉積物中含有大量雙酚類污染物。因雙酚類化合物可以模擬雌激素活性，長期接觸或攝入此類化合物會降低人類的生育能力，對人類生殖發(fā)育產(chǎn)生極其不利的影響。研究表明，雙酚類化合物還會導(dǎo)致乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌等惡性腫瘤［4-5］，另外，對腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等亦具有毒性［6-7］。因此，必須嚴格分析和檢測海洋水體及沉積物中的雙酚類化合物，以促進海洋生態(tài)環(huán)境的和諧發(fā)展。

建立快速、高效、綠色的分析方法，對海洋樣品中雙酚類化合物的檢測至關(guān)重要。雙酚類化合物的檢測方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［8］、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）［9-10］、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）［11-13］等，這些方法應(yīng)用廣泛，但均存在一定的不足。HPLC 法雖十分成熟，但對雙酚類化合物的分離檢測通常需要大量有毒有害有機溶劑作為流動相，對操作人員及生態(tài)環(huán)境都存在潛在的不利影響；LC-MS 法因連接了質(zhì)譜檢測器，方法靈敏且選擇性佳，但儀器昂貴，設(shè)備維護費用高，難以全面普及；GC-MS 法通常需經(jīng)衍生化處理才能對雙酚類化合物進行分離檢測，而衍生化過程耗時、費力，且需耗費大量有害溶劑，此外，在進行衍生化處理時，分析物的定量準確性通常不佳（存在潛在的分析物損失）。而超臨界流體色譜（supercritical fluid chromatography，SFC）能有效克服上述方法的不足［14］。SFC 法是一種以超臨界態(tài)二氧化碳流體為流動相的色譜分離技術(shù)，而超臨界態(tài)二氧化碳流體兼具氣體和液體的優(yōu)點，流體黏度小，擴散性好，密度和溶解能力高（比氣體高）、綠色、無毒、化學(xué)性能穩(wěn)定且廉價，但因其為非極性流體，不具備分離洗脫雙酚類化合物的能力，需要在其中加入少量極性改性劑以調(diào)節(jié)流動相的極性，實現(xiàn)對不同極性目標(biāo)分析物的最佳分離。

對海洋水體、海洋沉積物等復(fù)雜海洋樣品，由于樣品基質(zhì)較復(fù)雜，在對樣品中的雙酚類化合物進行檢測時，應(yīng)先做前處理以純化樣品。常用的前處理［15-16］方法有：固相萃取、分散固相萃取、固相微萃取、液液萃取（liquid-liquid phase extraction，LLE）等。本實驗選擇液液萃取，首先，用乙腈等有機溶劑，通過鹽析作用輔助目標(biāo)物在兩相中的分配，萃取并去除樣品中的水分和干擾基質(zhì)。

本文建立了超臨界流體色譜法用于分析海洋水體和沉積物中雙酚A（BPAF）、雙酚AF（BPA）、雙酚C（BPC）、四溴雙酚A（TBBPA）4 種雙酚類化合物，先通過液液萃取對樣品進行前處理，提取純化樣品，再通過優(yōu)化超臨界流體色譜條件，實現(xiàn)同時對4種雙酚類化合物的分離檢測。

1 實 驗

1.1 試劑與儀器

超臨界流體色譜儀為日本島津公司旗下的Nexera UC 超臨界流體色譜系統(tǒng)，采用紫外檢測方法；SBL-5DTS超聲波恒溫清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LG16B 高速離心機（雷勃爾，北京）；Millipore simplicity 超純水機（美國Millipore公司）。

雙酚類化合物標(biāo)準品：BPAF（純度99.0%）、BPA（純度98.0%）、BPC（純度98.0%）、TBBPA（純度98.0%）購自阿拉丁化學(xué)品公司（中國），化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示，在配制以上標(biāo)準品的標(biāo)準溶液時考慮純度因子。HPLC 所需色譜純級別的甲醇、乙腈等有機溶劑均購自Tedia 公司（美國）。氯化鈉（分析純）、無水硫酸鎂（分析純）均購自阿拉丁化學(xué)品公司（中國）。實驗用水均為經(jīng)Millipore simplicity 超純水機（美國）凈化的二次去離子水。將不同水域的海洋水體及沉積物樣品保存于冰箱待用。

配制含有4 種雙酚類化合物的甲醇儲備液（200 mg·L-1）：準確稱取適量的雙酚類化合物標(biāo)準物質(zhì)，加入適量甲醇至標(biāo)準物質(zhì)完全溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成200 mg·L-1的標(biāo)準溶液，超聲后低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

配制含有4 種雙酚類化合物的混合標(biāo)準溶液：用甲醇逐級稀釋標(biāo)準溶液，得到不同濃度的混合標(biāo)準溶液，低溫保存，臨配臨用。

1.2 樣品前處理

用移液槍準確量取海洋水體樣品5.0 mL 于10 mL 離心管中，加入5 mL 乙腈混合均勻，溶液中加入1.0 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉，超聲輔助萃取5 min，以10 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至自動進樣樣品瓶中，待SFC 進樣分析，外標(biāo)法定量。用天平稱取海洋沉積物樣品5.0 g，操作過程同上。

圖1 4 種雙酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of four bisphenols

1.3 超臨界色譜分析條件

實驗采用Nexera UC SFC 系統(tǒng)進行超臨界流體色譜-紫外檢測器法分析。該系統(tǒng)由超臨界流體輸送 泵（LD-30ADSF）、改 性 劑 輸 送 泵（LC-20ADXR）、脫氣單元（DGU-20A5R）、自動進樣器（SIL-30A）、柱溫箱（CTO-20AC）、系統(tǒng)背壓調(diào)節(jié)器（SFC-30A）和系統(tǒng)控制器（CBM-20A）組成。雙酚類化合物通過WondaCract ODS-2 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）進行分離，采用超臨界態(tài)CO2+10%（v/v）CH3OH 對流動相進行等度洗脫，總流速為2.0 mL·min-1、柱溫為36 ℃、系統(tǒng)背壓為12 MPa。經(jīng)紫外全波長掃描，得到最佳檢測波長為230 nm。為防止柱飽和，樣品進樣量為5 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

在實驗中，海洋樣品的純化主要通過液液萃取完成，在液液萃取過程中，萃取溶劑種類的選擇和超聲萃取時間的優(yōu)化對最終的萃取效果有重要影響。實驗分別比較了甲醇、乙醇、乙腈和丙酮4 種萃取溶劑的萃取效果，4 種萃取溶劑對BPA、BPC、BPAF、TBBPA 等4 種雙酚類化合物的萃取率如圖2（a）所示。萃取過程中加入1.0 g 無水硫酸鎂和1.0 g 氯化鈉產(chǎn)生鹽析作用，以促進雙酚類化合物在兩相中的分配，當(dāng)乙腈作為萃取溶劑時，對實際樣品中的雙酚類化合物的萃取率最高，因此，選擇乙腈作為最佳萃取溶劑。此外，在超聲輔助下進行液液萃取，周期性的超聲波頻率可加快分子的傳質(zhì)過程，縮短萃取時間，提高萃取率。實驗比較了不同萃取時間下（2～20 min），乙腈對目標(biāo)物的萃取率如圖2（b）所示，當(dāng)萃取時間為5 min 時，對4 種雙酚類化合物均有較高的萃取率，因此超聲輔助萃取時間選擇5 min。

圖2 液液萃取過程中萃取溶劑的選擇（a）和超聲輔助萃取時間的優(yōu)化（b）Fig.2 Selection of extraction solvent（a）and optimization of ultrasonic-assisted extraction time（b）for LLE

2.2 超臨界流體色譜條件探討

采用SFC 法對雙酚類化合物進行分離，并對其分離條件進行優(yōu)化。 雙酚類化合物通過WondaCract ODS-2 色譜固定相（5 μm，4.6 mm×250 mm，Shimadzu，日本）在超臨界流體色譜上進行分離，當(dāng)以單一的非極性超臨界態(tài)二氧化碳作為流動相時，對雙酚類化合物的洗脫能力較弱，通過加入一定比例的極性改性劑，增強了流動相的洗脫效果，同時為使雙酚類化合物在超臨界流體色譜上得到最佳的分離效果，對柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等超臨界流體色譜參數(shù)進行了優(yōu)化。通過探究極性改性劑的比例以及柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等參數(shù)對雙酚類化合物分離效果的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)柱溫為36 ℃、流速為2.0 mL·min-1、系統(tǒng)背壓為12 MPa，以超臨界態(tài)二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）為流動相時，4 種雙酚類化合物均獲得了最優(yōu)的色譜峰及響應(yīng)值。

2.2.1 極性改性劑的優(yōu)化

本實驗以甲醇作為極性改性劑，探究了不同流動相配比對分離效果的影響。當(dāng)二氧化碳與甲醇體積比為8%～10%時，4 種雙酚類化合物的保留時間如圖3（a）所示，由此可知，隨著二氧化碳與甲醇體積比的增加，流動相對4 種雙酚類化合物的洗脫能力逐漸增強，綜合考慮分離度和色譜峰形，最終選擇二氧化碳/甲醇=90/10（v/v）作為流動相。

2.2.2 柱溫、流速以及系統(tǒng)背壓的優(yōu)化

除對固定相和流動相進行優(yōu)化外，對柱溫、流速、系統(tǒng)背壓等超臨界流體色譜參數(shù)也進行了優(yōu)化?？傮w來說，柱溫、流速及系統(tǒng)背壓的變化會改變流動相的密度，進而影響流動相對目標(biāo)組分的溶劑化能力和洗脫能力，其對分離雙酚類化合物的影響分別如圖3（b）、（c）和（d）所示。在分離4 種雙酚類化合物時，柱溫升高會延長分離時間，且影響是非線性的，當(dāng)柱溫大于36 ℃時，流動相對目標(biāo)化合物洗脫能力的影響逐漸減弱，見圖3（b）。隨著流速的增大，流動相的密度和洗脫能力增大，目標(biāo)物在固定相上的保留時間隨之縮短，見圖3（c）。隨著系統(tǒng)背壓的升高，4 種雙酚類化合物的洗脫時間逐漸縮短。綜合考慮雙酚類化合物的分離度和分離時間，最終選擇柱溫36 ℃、流速2.0 mL·min-1、系統(tǒng)背壓12 MPa，實現(xiàn)了5 min 內(nèi)對雙酚類化合物的快速、完全分離。

圖3 極性改性劑比例（a）、柱溫（b）、流速（c）和系統(tǒng)背壓（d）對分離的影響Fig.3 The effect of modifier percentage（a），temperature（b），flow rate（c），back pressure（d）on separation

2.3 線性關(guān)系及檢出限

由于實際樣品基質(zhì)復(fù)雜多樣，樣品經(jīng)前處理后可能存在基質(zhì)干擾，因此對本方法的基質(zhì)效應(yīng)進行了評價。本實驗中，前處理方法對實際樣品中4 種雙酚類化合物的基質(zhì)效應(yīng)范圍均為?2.5%～4.1%，說明該方法可以有效消除基質(zhì)干擾?？紤]基質(zhì)效應(yīng)對實驗結(jié)果影響極小，本實驗采用外標(biāo)法直接對目標(biāo)物進行定量分析。將4 種雙酚類化合物的甲醇溶液 配 制 成 質(zhì) 量 濃 度 分 別 為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，20.0 mg·L-1的一系列混合標(biāo)準溶液，利用外標(biāo)法定量，繪制峰面積（Y）-濃度（X）標(biāo)準曲線。線性范圍、線性方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（LODs）及定量限（LOQs）等結(jié)果見表1。由表1 可知，4 種雙酚類化合物在線性范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)均高于0.998 9，檢出限為0.03～0.06 mg·L-1。

表1 4 種雙酚類化合物的線性相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限（n=5）Table 1 Linearity，correlation coefficient，LODs and LOQs of four target bisphenols（n=5）

2.4 樣品分析

實驗共選取3 處海域的海洋水體以及海洋沉積物作為實驗樣品，通過液液萃取對樣品進行前處理，用超臨界流體色譜法測定樣品，得到：（1）在海域1的海洋水體樣品和沉積物樣品中均檢出了BPAF，質(zhì) 量 分 數(shù) 分 別 為0.086 和0.095 μg·mL-1，未 檢 出BPA、BPC 和TBBPA；（2）在海域2 的海洋水體樣品和沉積物樣品中，4 種雙酚類化合物均未檢出；（3）在海域3 的海洋水體樣品中檢出了BPAF，質(zhì)量分數(shù)為0.102 μg·mL-1，沉積物樣品中4 種雙酚類化合物均未檢出。其中，海域1 沉積物樣品4 的色譜圖如圖4 所示，超臨界流體色譜法在5 min 內(nèi)即可有效分離出4 種雙酚類化合物。

圖4 實際海洋樣品和雙酚類化合物標(biāo)準溶液的超臨界流體色譜譜圖Fig.4 Chromatograms of marine samples and bisphenols standard solution separated by SFC

2.5 回收率及精密度

實驗探究了4 種雙酚類化合物在樣品中的回收率，操作過程如下：

對實際樣品進行0.10，0.20，0.50 mg·L-13 個濃度水平的加標(biāo)回收率實驗，每個濃度平行測定3 次，通過液液萃取對加標(biāo)樣品進行處理，采用SFC 法對加標(biāo)樣品進行測定，計算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2。由表2 知，加標(biāo)回收率為85.7%～112.0%；精密度≤10.3%，方法重現(xiàn)性佳。

4 結(jié) 論

內(nèi)分泌干擾物是存在于海洋生態(tài)環(huán)境中具有持久性危害的外源性污染物質(zhì)，雙酚類化合物作為一類典型的內(nèi)分泌干擾物對海洋生態(tài)環(huán)境具有重要影響，對海洋樣品中雙酚類化合物的濃度進行檢測、追蹤，對其分布進行監(jiān)測，對海洋生態(tài)研究具有重要意義。建立了由液液萃取和超臨界流體色譜法同時測定海洋水體及沉積物中的BPA、BPAF、BPC 和TBBPA 4 種雙酚類化合物的方法，在線性濃度范圍內(nèi)4 種雙酚類化合物均具有良好的線性，且線性相關(guān)系數(shù)均高于0.998 9，方法的檢出限為0.03～0.06 mg·L-1，回收率為85.7%～112.0%，具有良好的重現(xiàn)性。實現(xiàn)了同時對海洋水體及沉積物中常見的雙酚類化合物的快速檢測，方法的選擇性好、精密度和回收率高，且快速高效，可廣泛應(yīng)用于海洋環(huán)境中雙酚類化合物的監(jiān)測、追蹤、風(fēng)險研究及評估等工作。

表2 4 種雙酚類化合物在空白海水樣品中的回收率（n=3）Table 2 Recoveries of four bisphenols in blank marine samples（n=3）