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    健脾清腸補腎方藥物血清對破骨細胞凋亡途徑的影響

    2021-03-21 10:12:56張亞利陳倩戴彥成張紫薇唐志鵬
    中國中醫(yī)藥信息雜志 2021年3期
    關(guān)鍵詞:清腸骨細胞培養(yǎng)液

    張亞利,陳倩,戴彥成,2,張紫薇,唐志鵬

    1.上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院,上海中醫(yī)藥大學脾胃病研究所,上海 200032;2.上海中醫(yī)藥大學附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,上海 200082

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種常見的消化系統(tǒng)疾病,屬炎性腸病范疇。研究顯示,UC可影響患者骨骼及鈣鹽的沉積[1-3]。近年來,UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥研究備受關(guān)注[4-5]。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性骨病,表現(xiàn)為骨脆性增加、易骨折,是UC 患者常見腸道外表現(xiàn)之一[6]。骨重建對維持骨骼完整性具有重要作用,其由成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收共同協(xié)調(diào)完成,破骨細胞異常導致這種內(nèi)穩(wěn)態(tài)被打破。骨質(zhì)疏松細胞學特征為破骨細胞的破骨活性強于成骨細胞的成骨活性,導致骨質(zhì)逐漸被吸收。因此,破骨細胞凋亡直接影響骨吸收,從而影響骨重建過程。研究發(fā)現(xiàn),骨質(zhì)疏松癥中破骨細胞凋亡受到抑制[7-9]。前期臨床研究表明,健脾清腸方治療UC 取得較好療效[10-12]。健脾清腸補腎方是在健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方,本實驗從破骨細胞凋亡機制入手,觀察健脾清腸補腎方藥物血清對成熟破骨細胞凋亡的影響,探討其治療UC并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)揮藥效的可能作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 藥物

    健脾清腸補腎方(黃芪30 g,黨參15 g,益智仁12 g,補骨脂9 g,馬齒莧30 g,甘草6 g,木香6 g,地榆15 g),飲片由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。浸泡飲片,煎煮2 次,過濾藥液,濃縮后濃度為含原藥材1.23 g/mL,置于-20 ℃冰箱保存。

    1.2 細胞

    RAW264.7 細胞株來源于Abelson 鼠科白血病病毒誘導腫瘤,購于中國科學院上海生命科學研究院。

    1.3 動物

    雄性SD 大鼠,SPF 級,6 周齡,體質(zhì)量(200±10)g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司,動物許可證號SCXK(滬)2013-0017。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF 級動物房,溫度(23±3)℃,相對濕度35%~45%,光照12 h,自由攝食飲水。

    1.4 主要試劑與儀器

    核因子-κB 受體活化因子配基(RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF),R&D 公司,批號分別為315-11、315-02;Bcl-2 抗體、Bax 抗體,CST 公司,批號分別為2876、2772;TRAP 染色試劑盒,Sigma公司,批號387A;Annexin V-FITC 和碘化丙啶凋亡檢測試劑盒,BD 公司,批號556420。低溫離心機(Eppendorf 公司,5804R 型),Accuri C6 流式細胞儀(Becton-Dickinson),純水儀(Heal Force 公司),垂直電泳儀(Bio-Rad 公司,PowerPac 型),全自動數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(G:Box Chemi XT4,Syngene 公司)。

    1.5 藥物血清制備

    將實驗大鼠隨機分為2 組,每組5 只。健脾清腸補腎方組大鼠按15 mL/kg 給予健脾清腸補腎方煎劑灌胃,空白對照組給予等體積蒸餾水灌胃,2 次/d,連續(xù)3 d。末次給藥后1 h,乙醚麻醉,腹主動脈取血,無菌離心管收集,4 ℃靜置2 h,4 ℃、3000 r/min 離心15 min,混勻合并同組大鼠藥物血清,56 ℃恒溫水浴滅活30 min,0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌,凍存管分裝,置于-80 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩E渲瞥山K濃度分別為2.5%、5%、10%的健脾清腸補腎方藥物血清培養(yǎng)液[終濃度(%)=加入血清體積÷總體積×100%],即低、中、高劑量健脾清腸補腎方。

    1.6 RAW264.7 細胞形態(tài)學觀察

    將RAW264.7 細胞置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,使用DMEM 完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100 U/L 青-鏈霉素和2.5 mg/mL 兩性霉素B)培養(yǎng),每1~2 d 更換1 次培養(yǎng)液。待細胞融合至70%,用細胞刮將貼壁的RAW264.7 細胞刮下,離心后取新鮮培養(yǎng)液重懸,輕柔吹打均勻,細胞按1∶4 傳代。

    1.7 破骨細胞誘導及鑒定

    細胞經(jīng)計數(shù),將RAW264.7 細胞按1×104個/cm2的濃度接種于培養(yǎng)板,加入100 ng/mL RANKL 和10 ng/mL M-CSF 共同誘導其分化。培養(yǎng)6 d 后,破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鑒定。加入臨時配制的TRAP 染色液,將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫箱,避光孵育1 h;再用蘇木精復(fù)染3 min,PBS 沖洗3 次,倒置相差顯微鏡下觀察及拍片。光鏡觀察TRAP 陽性多核(≥3 個)破骨細胞。

    1.8 Annexin V/PI 雙染色法檢測破骨細胞凋亡

    將破骨細胞接種于6 孔板,健脾清腸補腎方藥物血清(2.5%、5%、10%)對誘導分化成熟的破骨細胞進行干預(yù),正常血清培養(yǎng)為空白對照。按不同培養(yǎng)條件分別加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d;將6 孔板中每孔細胞培養(yǎng)液吸出至15 mL 離心管,每孔再加入400 μL 胰蛋白酶消化3 min,1 mL 完全培養(yǎng)液終止消化,500 μL培養(yǎng)液洗孔1 次;將消化的細胞加入同一離心管,2000 r/min 離心5 min,棄上清液,用1 mL 預(yù)冷無菌PBS 洗細胞沉淀1 次,用PBS 輕輕重懸細胞并計數(shù),調(diào)整細胞濃度為1×106個/mL;取100 μL 細胞懸液,加入5 μL Annexin V-FITC,輕輕混勻;室溫避光孵育15 min。加入5 μL 碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻,冰浴避光放置5 min;加300 μL 結(jié)合液;用流式細胞儀進行檢測,Annexin V-FITC 為綠色熒光,PI 為紅色熒光。

    1.9 Western blot 檢測破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達

    按不同培養(yǎng)條件(空白對照組和健脾清腸補腎方低、中、高劑量組)培養(yǎng)細胞2 d;取干預(yù)后2×106個破骨細胞,棄培養(yǎng)液,PBS 清洗2 次;培養(yǎng)皿中加入100 μL 預(yù)冷的蛋白裂解液,置冰上10~20 min;細胞刮刮下細胞收集至EP 管,4 ℃、12 000 r/min 離心5 min,吸取上清液至另一新離心管;取少量上清液,用Bradford 檢測試劑盒進行蛋白質(zhì)定量;每個樣品上樣20 μg,經(jīng)SDS-PAGE 分離后,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入TBST 稀釋的Bcl-2 和Bax 一抗(1∶1000),4 ℃孵育過夜;TBST 洗膜后加入1∶2000 稀釋的二抗,室溫搖床上孵育2 h;TBST 洗膜;將PVDF 膜放入凝膠成像儀中調(diào)整位置和焦距,于PVDF 膜正面的目的條帶上滴加ECL 發(fā)光劑(試劑A 液與試劑B 液等體積混勻),動態(tài)集成5~15 min 并拍照,用Gel-Pro 分析軟件對條帶進行定位和分析。

    1.10 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS26.0 和GraphPad Prism8.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示,對所有數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗,對符合正態(tài)分布且方差齊的數(shù)據(jù)用方差分析,進行多組間比較,組間比較用LSD-t檢驗,不符合正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)用非參數(shù)檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 破骨細胞觀察及鑒定結(jié)果

    RAW264.7 細胞剛貼壁時呈類圓形;第2 日可見伸出的偽足、單核,極少數(shù)有2 個核;第3 日可見細胞開始發(fā)生融合,逐漸形成空泡樣多核巨噬細胞;第5 日細胞可融合形成破骨樣細胞。RAW264.7 細胞經(jīng)RNAKL+M-CSF 聯(lián)合誘導培養(yǎng)4 d,可見少量TRAP染色陽性細胞,類圓形,體積比單核細胞大數(shù)倍;培養(yǎng)6 d,TRAP 染色陽性的細胞形狀不規(guī)則,多核(≥3 個),體積大,直徑可達50~100 μm,有偽足,可見囊泡,鏡下細胞核呈紫藍色,胞漿中TRAP 活性部位呈深紅色顆粒。見圖1。

    2.2 健脾清腸補腎方對破骨細胞凋亡的影響

    通過Annexin V/PI 雙染色法染色,流式細胞儀檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示,空白對照組破骨細胞早期凋亡率和總凋亡率分別為5.17%、6.68%,與空白對照組比較,健脾清腸補腎方各劑量組破骨細胞凋亡率均明顯升高(P<0.05),其中健脾清腸補腎方高劑量組最顯著,分別為15.21%、17.82%。見圖2、圖3。

    圖2 破骨細胞Annexin V/PI 雙標記法流式細胞圖

    圖3 各組破骨細胞凋亡率比較(,n=3)

    2.3 健脾清腸補腎方對破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響

    與空白對照組比較,健脾清腸補腎方各劑量組Bcl-2 蛋白表達均明顯下調(diào),Bax 蛋白表達均明顯上調(diào),Bcl-2/Bax 比值明顯下降,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中健脾清腸補腎方高劑量組變化最顯著。見圖4、圖5。

    圖4 各組破骨細胞Bcl-2、Bax、Bcl-2/Bax 水平比較(,n=3)

    圖5 各組破骨細胞Bcl-2 和Bax 蛋白免疫印跡圖

    3 討論

    UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥可歸屬中醫(yī)學“骨痹”范疇,感受外邪、飲食不節(jié)、情志失調(diào)及稟賦不足時,易致脾腎損傷,脾虛運化無力,痰濕內(nèi)生,日久化熱,致濕熱、痰濁、瘀毒內(nèi)生,與氣血搏結(jié),壅滯于腸道;腎虛則精虧,骨無所養(yǎng)。脾腎虧虛是UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),濕熱蘊結(jié)腸道是其重要病機。健脾清腸補腎方是本課題組針對UC 并發(fā)骨質(zhì)疏松癥創(chuàng)立的臨床協(xié)定方劑,是在前期研究健脾清腸方基礎(chǔ)上的拓展方,為健脾清腸方去白及、黃連,加益智仁、補骨脂,由黃芪、黨參、益智仁、補骨脂、地榆、馬齒莧、木香、甘草8 味藥組成。方中黃芪、黨參、益智仁、補骨脂健脾補腎,地榆、馬齒莧清熱涼血止痢,木香行氣止痛,甘草調(diào)和諸藥。全方標本兼治,共奏健脾清腸補腎之功。

    正常成年人體內(nèi)骨轉(zhuǎn)換需通過成骨細胞和破骨細胞的分化、激活及凋亡保持平衡。骨質(zhì)疏松癥通常表現(xiàn)為骨質(zhì)量和骨密度的降低,以及骨組織微結(jié)構(gòu)的改變。

    細胞凋亡又稱程序性細胞死亡,是由英國阿伯丁大學病理學家Kerr 等[13]1972 年首次提出,其廣泛存在于多細胞生物的各種器官和組織中。線粒體凋亡通路是經(jīng)典的細胞凋亡途徑之一。線粒體是細胞產(chǎn)生能量的重要細胞器,是細胞氧化磷酸化和呼吸鏈的中心,也是細胞凋亡的調(diào)控中心。死亡受體介導的信號、生長因子抑制劑等許多因素均能使線粒體功能損傷,從而誘導細胞發(fā)生凋亡。健脾清腸補腎方藥物血清加入破骨細胞后,各劑量組破骨細胞凋亡率較空白對照組均顯著升高,且與藥物濃度呈正相關(guān)。提示健脾清腸補腎方可促進破骨細胞凋亡,高濃度健脾清腸補腎方藥物血清作用最顯著。

    Bcl-2 家族是細胞凋亡的重要調(diào)控因子,由促凋亡和抗凋亡成員協(xié)同發(fā)揮作用。Bcl-2 可能通過干擾細胞色素C 的釋放從而阻斷Caspase 的激活,抑制細胞凋亡的發(fā)生;Bax 即Bcl-2 相關(guān)的X 蛋白,是Bcl-2家族中促凋亡的重要蛋白之一。Bcl-2 可與Bax 形成異二聚體。正常情況下,Bcl-2 和Bax 在細胞內(nèi)保持相對平衡。當Bcl-2 相對含量高于Bax 時,促進Bcl-2/Bax 異二聚體的形成,抑制細胞凋亡;當Bax相對含量高于Bcl-2 時,則抑制Bcl-2/Bax 異二聚體的形成,從而促進細胞凋亡[14-16]。因此,這2 種蛋白在異二聚體中所占比例可影響對細胞凋亡的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn),健脾清腸補腎方藥物血清可提高破骨細胞凋亡率,其機制可能是通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達、上調(diào)Bax 蛋白的表達而導致Bcl-2/Bax 比值下降,從而促進細胞色素C 等促細胞凋亡因子向細胞質(zhì)釋放而發(fā)揮作用。健脾清腸補腎方低、中、高劑量組均可促進破骨細胞凋亡,其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。

    綜上,健脾清腸補腎方藥物血清可促進破骨細胞凋亡,其機制可能是通過線粒體凋亡途徑而發(fā)揮作用,通過下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達,上調(diào)Bax 蛋白的表達,從而促進破骨細胞凋亡。健脾清腸補腎方各劑量組均可促進成熟破骨細胞凋亡,其中以健脾清腸補腎方高劑量組最明顯。

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