Immuno-PET在程序性細(xì)胞死亡受體配體-1活體成像中的研究進(jìn)展

肖慶澳，夏 旋

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理系，湖北 宜昌443002

免疫正電子發(fā)射型斷層掃描儀（Immuno-PET）是一種將單克隆抗體（Mab）靶向特異性與PET技術(shù)高度敏感性融為一體的新型分子成像技術(shù)。這種技術(shù)不僅能識(shí)別與量化腫瘤細(xì)胞的靶點(diǎn)表達(dá)、了解全身免疫細(xì)胞的數(shù)量與分布、分子生物標(biāo)志物的改變以及炎癥反應(yīng)進(jìn)程［1］，還可對(duì)體內(nèi)免疫藥物的分布與代謝進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析［2-3］。作為腫瘤標(biāo)志物，程序性細(xì)胞死亡受體配體（PD-L1）是當(dāng)前腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)，各種單克隆抗體（如納武單抗、派姆單抗、Avelumab）開始應(yīng)用到臨床［4-6］。越來(lái)越多的研究顯示PD-L1的體內(nèi)表達(dá)水平會(huì)影響免疫療法療效，因此了解PD-L1體內(nèi)表達(dá)對(duì)免疫治療方案的制定具有重要意義。傳統(tǒng)“活檢方式+免疫組化”不能對(duì)其表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)評(píng)估，因此需要一種高特異性和靈敏度的方法對(duì)其表達(dá)進(jìn)行定位、定量分析。本文就近年來(lái)Immuno-PET在活體表征腫瘤中PD-L1的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Immuno-PET簡(jiǎn)介

自上世紀(jì)70年代PET進(jìn)入臨床應(yīng)用以來(lái)，經(jīng)過30多年的發(fā)展其在臨床成像與診斷上的應(yīng)用已非常廣泛。20世紀(jì)80年代開始，相應(yīng)臨床研究表明使用放射性標(biāo)記的Mab可以對(duì)腫瘤進(jìn)行分子成像。但隨著18F-脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層顯像（18F-FDG PET）的應(yīng)用，有限的診斷準(zhǔn)確率使得抗體分子成像使用受限。雖然當(dāng)時(shí)仍有少數(shù)研究人員嘗試將其應(yīng)用于特異性顯像并取得了一些成就，但受制于當(dāng)時(shí)探測(cè)器和處理軟件的限制，并沒有得到廣泛的應(yīng)用［8］。近10年來(lái)，得益于免疫靶點(diǎn)研究的深入，多種抗體（如：抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4、抗PD-L1 和抗PD-1）研發(fā)為Immuno-PET的廣泛使用奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)晶體探測(cè)器、掃描系統(tǒng)、抗體工程技術(shù)和核素合成技術(shù)的發(fā)展，也使得利用示蹤劑抗體進(jìn)行放射標(biāo)記成像逐漸成為主流［8-9］。

Immuno-PET 作為一種新技術(shù)，其原理在于：將Mab用正電子核素（如68Ga、89Zr、124I等）標(biāo)記并通過靜脈入血，由血液循環(huán)將Mab帶到腫瘤組織并與表面抗原相結(jié)合，或者提前注入特異性Mab，再注射被核素標(biāo)記的能識(shí)別Mab的小分子使正電子核素在特定器官或組織中蓄積；利用放射性同位素不穩(wěn)定易放出正電子的特性，通過晶體探測(cè)器可檢測(cè)出同位素正電子與組織負(fù)電子堙滅過程中產(chǎn)生的粒子（如γ射線粒子）；由于正電子在組織中穿行距離僅僅只有幾毫米，并受組織密度和初始能量影響，因此PET掃描系統(tǒng)掃描到粒子后，通過計(jì)算飛行時(shí)間就可以精確定位體內(nèi)腫瘤的產(chǎn)生部位；在獲得大量基本數(shù)據(jù)后通過計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行圖像重建可得出患者的PET圖像［7,10］。

2 Immuno-PET活體表征PD-L1的應(yīng)用價(jià)值

PD-L1與細(xì)胞程序性死亡受體（PD-1）結(jié)合會(huì)抑制活化的T細(xì)胞，抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤功能。通過抑制PD-1/PD-L1通路可解除對(duì)抗腫瘤T細(xì)胞的抑制，從而達(dá)到治療腫瘤的目的［11］。研究顯示PD-L1存在于各種類型的腫瘤組織中，包括黑色素瘤、多發(fā)性骨髓瘤、白血病、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌等［11］。此外，PD-L1的高表達(dá)也與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此測(cè)定腫瘤細(xì)胞PD-L1表達(dá)水平可作為免疫治療的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。研究顯示，對(duì)PD-L1陽(yáng)性腫瘤患者使用藥物抑制PD-1/PD-L1通路后，有效率可達(dá)90%以上［12-13］。值得注意的是，約10%免疫組化PD-L1 陰性患者對(duì)于PD-1/PD-L1通路治療反應(yīng)良好［14-15］。這可能是PD-L1的腫瘤異質(zhì)性與抽樣誤差所致。

傳統(tǒng)“活檢方式+免疫組化”受制于PD-L1動(dòng)態(tài)表達(dá)與異質(zhì)性，不能及時(shí)準(zhǔn)確表現(xiàn)體內(nèi)分布狀況；此外，活檢取樣只能得到一個(gè)病變的組織樣本，不一定真實(shí)反映多個(gè)腫瘤或患者的免疫狀態(tài)。PD-L1的表達(dá)也會(huì)隨著疾病發(fā)展、免疫治療、放化療的進(jìn)行而改變。通過多次活檢了解體內(nèi)PD-L1的動(dòng)態(tài)變化也并不現(xiàn)實(shí)［2］。此外，據(jù)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局報(bào)告顯示，使用不同抗體與檢測(cè)方法所得出的免疫組化結(jié)果之間也存在差異［16］。相比于免疫組化，使用核素標(biāo)記PD-L1抗體進(jìn)行PET成像更具優(yōu)勢(shì)［17-19］，既避免多次活檢所造成的損傷，也能精確動(dòng)態(tài)反映體內(nèi)PD-L1的表達(dá)狀況。對(duì)于原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性腫瘤均可通過非侵襲的方式進(jìn)行相應(yīng)評(píng)估。

在免疫藥物靶向治療方面，現(xiàn)有技術(shù)（如質(zhì)譜分析、細(xì)胞熱位移測(cè)定、熒光各向異性成像）有助于表征藥物在細(xì)胞與組織中的活性，但在實(shí)時(shí)量化多病灶與跨病灶的藥物靶點(diǎn)應(yīng)用有限［20］。而Immuno-PET卻可以提供一種精確方法來(lái)量化多病灶中存在的藥物靶點(diǎn)，解決目前面臨的一些挑戰(zhàn)［21］，同時(shí)其還可評(píng)估治療期間不同劑量與預(yù)后時(shí)間對(duì)腫瘤表征PD-L1的影響，通過數(shù)學(xué)建模分析治療抗體的有效劑量［20］。在評(píng)估免疫療法預(yù)后效果方面，現(xiàn)有方法如18F-FDG PET雖也可預(yù)測(cè)與評(píng)估靶向治療方案，但其部分參數(shù)（如最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值SUVmax、平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值SUVmean）與免疫治療的臨床效果之間并不一致［22-23］。對(duì)比18F-FDG PET（通過檢測(cè)脫氧核糖代謝而了解腫瘤分布），Immuno-PET可直接通過監(jiān)測(cè)靶向特定受體來(lái)提供腫瘤的生物標(biāo)志物信息［24］。其對(duì)腫瘤的高度敏感性、高空間分辨率以及精確定量的能力可對(duì)臨床治療與組織攝取程度的關(guān)聯(lián)進(jìn)行精確評(píng)估［25-27］。

3 常用表征PD-L1正電子核素

目前PD-L1顯像劑所用放射性核素主要有64Cu、68Ga、89Zr、124I。124I雖然也是選項(xiàng)之一，但其能量過大，在PET成像時(shí)會(huì)導(dǎo)致空間分辨率下降。其半衰期與新型放射性核素相比也過長(zhǎng)（T?=4.2 d），同時(shí)其在體內(nèi)的脫鹵作用也使得其應(yīng)用受限［28］。89Zr（T?=78.4 h）因其易制備、成本低與純度高的特點(diǎn)自被應(yīng)用之日起就受到廣泛關(guān)注，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然Zr+在體內(nèi)對(duì)骨組織具有高親和力，可能會(huì)對(duì)各種骨骼疾病診斷帶來(lái)干擾，但其復(fù)合物在骨組織的蓄積呈現(xiàn)低而穩(wěn)定的狀態(tài)，為其衍生復(fù)合物應(yīng)用于成像提供了可能［29］。89Zr也易被生物細(xì)胞攝取，與傳統(tǒng)抗體（如西妥昔單抗）結(jié)合后在某些癌癥活體成像上表現(xiàn)較好［27］。此外，64Cu的化學(xué)配位研究已經(jīng)基本成熟，許多高效螯合劑（如3p-CNE3TA、3p-C-NOTA與3p-C-DE4TA）被已被研發(fā)［30］。利用雙螯合劑（如3p-C-NOTA）與64Cu形成的新化合物具有適宜半衰期與組織低排斥性的特點(diǎn)。這顯示出64Cu在Immuno-PET應(yīng)用中巨大的應(yīng)用前景。近年來(lái)，隨著單域抗體這類短半衰期的抗體與新型合成技術(shù)出現(xiàn)，18F的高正電子產(chǎn)率與短半衰期也使其逐漸應(yīng)用于Immuno-PET相關(guān)研究中［17］。除此之外，68Ga、111In等正電子核素也逐漸在PD-L1 的追蹤檢測(cè)中發(fā)揮著重要作用［31］。

4 新型PD-L1示蹤劑

在目前的實(shí)驗(yàn)中，示蹤劑大多需要2～4 d獲得高組織對(duì)比度的PET圖像。這將會(huì)極大影響免疫治療方案的制定。因此，如何獲得更加高效的PD-L1探頭也是Mab優(yōu)化研究的熱點(diǎn)之一（表1）。基于Immuno-PET顯像原理，新型示蹤劑必須在溫和條件下高效、快速、特異性結(jié)合相應(yīng)靶點(diǎn)，同時(shí)必須高特異性腫瘤攝取與低背景噪聲。示蹤劑需要盡可能快的達(dá)到特異性飽和，而未結(jié)合示蹤劑需迅速?gòu)难貉h(huán)中清除［1］。目前常見Immuno-PET示蹤劑類型包括IgG全長(zhǎng)依賴型、Fab片段型、單域抗體、單鏈抗體與其它類型［1］。

4.1 全長(zhǎng)IgG依賴型示蹤劑

目前IgG制劑的相關(guān)研究最為廣泛，其在腫瘤靶向治療上具有重要意義。有學(xué)者開發(fā)出一種新型抗PDL1的IgG稱為C4并利用去鐵氧胺B（DFO）螯合劑將89Zr與C4連接成89Zr-C4［29］。在注入抗PD-1反應(yīng)陽(yáng)性的人源腫瘤組織來(lái)源移植瘤模型48 h后，89Zr-C4在腫瘤中的蓄積達(dá)到高峰且遠(yuǎn)高于血液與肌肉。這表明PD-1反應(yīng)陽(yáng)性患者可使用放射示蹤劑對(duì)體內(nèi)PD-L1成像。但I(xiàn)gG分子量（150 000）大于腎濾過最大分子量（60 000），無(wú)法通過腎臟排出因而易產(chǎn)生蓄積。此外，其Fc段與新生兒Fc受體相互作用也使其在血清中難以快速清除，這也導(dǎo)致最佳背景噪聲比出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)較長(zhǎng)［1,7］。因此在使用前需要對(duì)其背景噪聲進(jìn)行相應(yīng)研究。有學(xué)者利用89Zr制備不同IgG抗體示蹤劑（如89Zr-antiCD20、89Zr-anti-EGFR）并結(jié)合Immuno-PET對(duì)抗體在人體非靶點(diǎn)表達(dá)組織內(nèi)的非特異性蓄積與解離進(jìn)行了量化并提供了基準(zhǔn)曲線，為后續(xù)的相關(guān)研究提供了可能［32］；另有研究利用DIBO-DFO將抗PD-L1抗體與89Zr螯合生成89Zr-DFO-6E11，在對(duì)HCC827細(xì)胞與淋巴組織的顯像中取得較好效果［33］。

表1 幾種新型表征PD-L1的immuno-PET示蹤劑性質(zhì)Tab.1 Properties of several novel PD-L1tracers of immuno-PET(Mean±SD)

許多IgG抗體免疫治療藥物也開發(fā)出相應(yīng)的顯像劑［6］。Jagoda 等［34］使用89Zr 標(biāo)記Avelumab（89Zr-DFOPD-L1 Mab）對(duì)PD-L1陽(yáng)性人乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-231）移植小鼠模型進(jìn)行PET成像［34］。值得注意的是，該研究顯示注射純89Zr-DFO-PD-L1 Mab（2 μg）時(shí)，小鼠骨組織對(duì)89Zr-DFO-PD-L1 Mab攝取高于腫瘤組織，若混合40 μg 的PD-L1 Mab 則可顯著增加腫瘤組織攝入89Zr-DFO-PD-L1 Mab；此外，Lesniak等［35］使用NSG小鼠（敲除Rag2 和IL-2Rγ，存在免疫缺陷）構(gòu)建高表達(dá)PD-L1中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO-hPD-L1）腫瘤模型，隨后注射[64Cu]Atezolizumab進(jìn)行成像。注射后24 h與48 h 腫瘤每克組織注射劑量百分比（%ID/g）分別為39.8±2.8與40.6±6.9，而同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組（CHO）的%ID/g為11.1±1.9與10.1±3.3。此外，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組小鼠其他器官和組織中的[64Cu]Atezolizumab無(wú)差異。這顯示出[64Cu]Atezolizumab在表征活體PD-L1的特異性。此外，有研究通過89Zr-Atezolizumab對(duì)患有轉(zhuǎn)移性膀胱癌、非小細(xì)胞肺癌以及三陰性乳房癌患者體內(nèi)的PD-L1水平進(jìn)行評(píng)估［36］。給予患者0.1～0.3 mg/kg劑量的89Zr-Atezolizumab便可用于PET成像，而這一劑量為推薦治療劑量的1/100［36-37］。在進(jìn)行免疫治療后，相比于免疫組化與RNA測(cè)序預(yù)測(cè)標(biāo)志物，患者免疫治療的效果與Immuno-PET表征PD-L1結(jié)果相關(guān)性更好。遺憾的是，因?yàn)?9Zr-Atezolizumab的清除率較低，最佳PET圖像需要在數(shù)日后獲得。

4.2 Fab片段示蹤劑

與完整的抗體相比，抗體片段雖然潛在接合位點(diǎn)少［24］。但去除Fc部分可以降低顯影劑的免疫原性，從而在生物體內(nèi)的半衰期更短且在腫瘤實(shí)質(zhì)中分布更加均勻。Fab在聯(lián)合64Cu后也可以降低注射早期信背比［19,38］?；贔ab片段的PET顯像劑非特異性累積少、清除更快，可提供更高的對(duì)比度成像［39］。有學(xué)者開發(fā)出一種新型Fab片段（αPD-L1），其利用1，4，7-三氮雜環(huán)壬烷N，N'，N''-三乙酸（NOTA）將αPD-L1與64Cu結(jié)合進(jìn)而形成64Cu-NOTA-αPD-L1［40］。64Cu-NOTA-αPD-L1注入裸鼠靜脈45 min后可獲得最佳圖像并發(fā)現(xiàn)棕色脂肪組織和脾臟呈現(xiàn)富集狀態(tài)。而在注入64Cu-NOTA-αPDL1前，使用αPD-L1的Fab（200 μg）進(jìn)行抑制處理后棕色脂肪組織與脾中NOTA螯合劑的富集情況消失，顯示出64Cu-NOTA-αPD-L1在PET成像劑中的特異性與可靠性。

4.3 單域抗體示蹤劑

單域抗體又稱納米抗體，是來(lái)源于駱駝與鯊魚血清中的最小抗體綁定衍生物（15 000）［41］。其只包含抗體重鏈，體積只有正?？贵w的1/10，具有非常適宜的物理化學(xué)性質(zhì)，一直以來(lái)都被當(dāng)做一種潛在的優(yōu)質(zhì)顯像劑。有學(xué)者利用單域抗體與68Ga結(jié)合形成的68Ga-NOTANb109復(fù)合物進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，在A375-hPD-L1細(xì)胞組織中表現(xiàn)出高親和力，而且這種親和力不會(huì)隨競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑（如KN035）的增加而減弱，提示該單域抗體的結(jié)合位點(diǎn)與PD-1不同［42］。68Ga-NOTA-Nb109的體內(nèi)半衰期為47.79 min，在注射2 h后，90%以上的復(fù)合物都經(jīng)過尿液以原型排除，腎臟對(duì)抗體的蓄積保持在較低狀態(tài)，血管與肌肉中復(fù)合物含量也都顯著下降。相較于IgG，單域抗體表現(xiàn)出強(qiáng)大的易排除特點(diǎn)。此外，KN035是我國(guó)自主研發(fā)的一種抗PD-L1單域抗體Fc融合蛋白，其采用IgG的Fc段融合單域抗體，從而獲得對(duì)人PD-L1的高敏感性與特異性，對(duì)鼠PD-L1無(wú)交叉反應(yīng)。Li等［16］基于KN035在肝臟具有較高的本底同位素?cái)z取的特點(diǎn)，使用89Zr來(lái)降低本底信號(hào)。在對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物試驗(yàn)中利用流式細(xì)胞儀驗(yàn)證了其與89Zr結(jié)合生成的89Zr-Df-KN035對(duì)于A375細(xì)胞的高度敏感性，以高效液相色譜法對(duì)89Zr-Df-KN035的標(biāo)記效率進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記效率超過70%。

4.4 高特異性肽段示蹤劑

WL12是一種由14個(gè)氨基酸組成的環(huán)狀肽，與PDL1 具有較高的親和力［43］。Chatterjee 等［44］將64Cu 與WL12螯合，形成[64Cu]WL12并注入到動(dòng)物模型中，其PET圖像顯示hPD-L1腫瘤的腫瘤血液比（T/B）與腫瘤肌肉比（T/M）分別為25.6±1.9 與4.7±1.2，這與[64Cu]WL12 提供高信噪比的PD-L1 特異性圖像的能力一致。將[64Cu]WL12與過量WL12（50 μg）注入小鼠模型中顯示，注射2 h后對(duì)比小鼠PD-L1陽(yáng)性腫瘤中放射性含量。相比于對(duì)照組，注射過量WL12的小鼠表達(dá)PDL1腫瘤組織放射性含量下降了75%。結(jié)合上述研究，有學(xué)者基于68Ga半衰期與WL12的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相符，將68Ga 與WL12 結(jié)合形成新PD-L1 示蹤劑[68Ga]WL12，[68Ga]WL12在注射入小鼠后15 min即被攝取，在60 min 與120 min 時(shí)，T/B 值分別為7.56±16.47 與16.02±3.40［43］，這表明該種示蹤劑在血液中的留存時(shí)間較少，其最佳T/M比值也遠(yuǎn)高于其他示蹤劑（表1），競(jìng)爭(zhēng)性抑制試驗(yàn)顯示高PD-L1腫瘤中示蹤劑含量明顯降低，表明[68Ga]WL12對(duì)于PD-L1具有高親和力。

5 總結(jié)與展望

Immuno-PET在腫瘤PD-L1表達(dá)的檢測(cè)與定量中發(fā)揮著重要作用。盡管目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了進(jìn)展，但用于人體診斷與治療評(píng)估的Immuno-PET還存在很多問題。不僅需要改進(jìn)現(xiàn)有的示蹤標(biāo)記物，而且還需要建立Immuno-PET 的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。限制Immuno-PET臨床應(yīng)用的因素有很多（如探頭合成、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)算法更新），但主要限制因素在于缺乏臨床試驗(yàn)。

基于目前Immuno-PET表征PD-L1的發(fā)展趨勢(shì)，期望在未來(lái)Immuno-PET在表征活體PD-L1上能有以下幾個(gè)方面創(chuàng)新：（1）從與PD-1結(jié)合位點(diǎn)不同的新靶點(diǎn)出發(fā)研制新型示蹤劑，以減少對(duì)免疫藥物治療的干擾；（2）嘗試開發(fā)PD-L1的單鏈抗體與Fab片段示蹤劑；（3）增加PET的敏感性與分辨率，以減少放射性顯像劑對(duì)患者造成的損傷；（4）依據(jù)核素的化學(xué)配位更有針對(duì)性的進(jìn)行螯合劑研究從而獲取性質(zhì)更加優(yōu)良的PD-L1探頭；（5）嘗試Immuno-PET臨床實(shí)驗(yàn)，從而為Immuno-PET的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)；（6）嘗試建立患者Immuno-PET診斷的分級(jí)制度與臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。隨著新型示蹤劑的開發(fā)與臨床數(shù)據(jù)的不斷積累，預(yù)計(jì)在不久的將來(lái)Immuno-PET活體表征PD-L1將會(huì)在腫瘤分子成像與免疫治療方案的臨床應(yīng)用中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。