表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯對(duì)細(xì)胞色素P450酶活性的影響

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，山東 濰坊 261031)

茶多酚是茶葉中多元酚類(lèi)化合物的總稱(chēng)，其中表沒(méi)食子兒茶素-3-沒(méi)食子酸酯(EGCG)約占茶多酚總量的50%～60%[1-2]。EGCG含有大量活性酚羥基，是茶葉中生物活性最高的兒茶素[3-5]。研究顯示EGCG具有抗癌、抗突變等生物活性，被廣泛用于提高人體免疫力、降低血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化等方面，對(duì)心血管、內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)具有保護(hù)作用[6-8]。此外，茶葉是亞洲地區(qū)人群較受歡迎的飲品之一，定期飲茶已成為一部分人的一種基本生活習(xí)慣。在患者接受藥物治療期間，茶葉中的兒茶素類(lèi)物質(zhì)可能會(huì)與其他藥物產(chǎn)生相互作用，從而影響藥物的療效。

CYP450酶在絕大多數(shù)內(nèi)源性和外源性分子生物代謝過(guò)程中，尤其是藥物的代謝過(guò)程中均發(fā)揮有重要作用[9-10]。在與不同藥物聯(lián)用時(shí)，CYP450酶能夠介導(dǎo)不同藥物間的相互作用，進(jìn)而影響藥物活性及治療效果[11]。CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C9酶、CYP2C19酶及CYP2C8酶是CYP450酶的主要亞型，參與了約90%藥物的代謝過(guò)程，如CYP3A4酶參與了鈣離

子拮抗劑(硝苯地平、尼莫地平等)的代謝過(guò)程，CYP2E1酶參與了含氟類(lèi)的吸入麻醉藥的代謝過(guò)程。先前研究已發(fā)現(xiàn)有大量影響CYP450酶各亞型活性的藥物，且導(dǎo)致不良的藥物-藥物相互作用，影響藥物的血藥濃度以及代謝速率[12-14]。因此，探究EGCG對(duì)CYP450酶各亞型活性的影響，對(duì)EGCG的臨床應(yīng)用及與其他形式的藥物聯(lián)用具有重要意義，但目前關(guān)于EGCG對(duì)CYP450酶各亞型活性的影響還鮮有報(bào)道。本研究旨在探討EGCG在人肝微粒體中對(duì)這8種主要的CYP450亞型酶活性的影響，并對(duì)活性受影響酶的抑制模型進(jìn)行擬合分析。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

EGCG、非那西丁、對(duì)乙酰氨基酚、4-羥基苯甲妥英、7-羥基香豆素、4′-羥基雙氯芬酸、磺胺苯咪唑、奎尼丁、環(huán)丙亞胺、氯唑沙宗、6-羥基氯唑沙宗、紫杉醇、6β-羥基睪丸酮、氯甲唑和呋喃茶堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；孟魯司特購(gòu)自北京Aleznova制藥(中國(guó)北京)；香豆素、雙氯芬酸、右美沙芬和酮康唑購(gòu)自美國(guó)ICN Biomedicals公司；人肝微粒體購(gòu)自美國(guó)BD公司；NADPH購(gòu)自瑞士Roche公司。

1.2 人肝微粒體實(shí)驗(yàn)

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為3組，以未處理的肝微粒體作為陰性對(duì)照組，與100 μmol/L EGCG共培養(yǎng)的肝微粒體為EGCG組，陽(yáng)性對(duì)照組為CYP450酶各亞型特異性抑制劑處理組。EGCG反應(yīng)濃度為100 μmol/L，同時(shí)選擇CYP450酶各亞型特異性抑制劑作為陽(yáng)性對(duì)照，其中CYP1A2酶、CYP3A4酶、CYP2A6酶、CYP2E1酶、CYP2D6酶、CYP2C19酶以及CYP2C8酶的特異性抑制劑分別為10 μmol/L呋喃茶堿、1 μmol/L酮康唑、10 μmol/L反式環(huán)丙胺、50 μmol/L氯甲咪唑、10 μmol/L噻吩、50 μmol/L丙基環(huán)丙胺、5 μmol/L孟魯司特。

1.2.2EGCG對(duì)CYP450酶各亞型活性的影響 EGCG對(duì)CYP450酶各亞型活性的影響在人肝微粒體中進(jìn)行，參考之前研究報(bào)道設(shè)定的標(biāo)志反應(yīng)及培養(yǎng)條件[15-16]，如表1所示。孵育體系為200 μL，包括100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.4)，NADPH再生系統(tǒng)(1 mmol/L的NADP+，5 mmol/L的G-6-P，4 kU/L的6-磷酸葡萄糖脫氫酶及5 mmol/L的MgCl2)，一定濃度的人肝微粒體及探針底物(表1)。反應(yīng)開(kāi)始前，上述孵育體系需要在37 ℃下預(yù)培養(yǎng)3 min，之后加入NADPH系統(tǒng)引發(fā)反應(yīng)。以100 μL乙腈結(jié)束反應(yīng)，其中僅CYP2A6酶反應(yīng)體系以體積分?jǐn)?shù)為0.1的三氯乙酸結(jié)束反應(yīng)。將混合物置于冰上并進(jìn)行離心，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)定量分析代謝產(chǎn)物。

表1 CYP450酶各亞型標(biāo)志反應(yīng)及培養(yǎng)條件

1.2.3抑制模型及相關(guān)參數(shù)的計(jì)算 通過(guò)下列方程進(jìn)行抑制模型相關(guān)參數(shù)的擬合計(jì)算。競(jìng)爭(zhēng)性抑制：v=(VmaxS)/[Km(1+I/Ki)+S]，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制：v=(VmaxS)/[Km+S(1+I/Ki)]，其中v是反應(yīng)速率，I是EGCG的濃度，Ki是抑制常數(shù)，S是底物濃度，Km是達(dá)到最大反應(yīng)速率(Vmax)一半時(shí)的底物濃度。

1.2.4濃度依賴(lài)性實(shí)驗(yàn) 分析不同濃度(0、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)EGCG對(duì)CYP1A2酶以及CYP3A4酶活性的影響，計(jì)算兩種酶對(duì)應(yīng)的IC50值。以0～50 μmol/L EGCG孵育不同濃度的兩種探針底物(20、40、60、100 μmol/L睪丸激素及25、50、100、200 μmol/L非那西丁)，分析兩種酶抑制類(lèi)型及相應(yīng)Ki值。

1.3 時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)

在含NADPH的系統(tǒng)中將EGCG(20 μmol/L)與肝微粒體(1 g/L)置于37 ℃的條件下先預(yù)孵育30 min。孵育后，將等分試樣(20 μL)轉(zhuǎn)移至另一個(gè)孵育管(最終體積為200 μL)中，該孵育管中含有NADPH生成系統(tǒng)和探針底物，使得探針底物最終濃度約為Km。將轉(zhuǎn)移后的孵育管進(jìn)一步培養(yǎng)0、5、10、15、30 min后，通過(guò)加入100 μL乙腈內(nèi)標(biāo)混合物終止反應(yīng)，然后將培養(yǎng)后的混合物置于冰上，并通過(guò)HPLC測(cè)定相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。分別于不同的預(yù)孵育時(shí)間(0、5、10、15、30 min)后，加入較高的探針底物濃度(約4倍Km值)和不同濃度(0、2、5、10、20、30 μmol/L)的EGCG進(jìn)行培養(yǎng)，重復(fù)上述兩步孵化過(guò)程。通過(guò)不同濃度EGCG對(duì)CYP3A4酶剩余活性的自然對(duì)數(shù)進(jìn)行回歸分析計(jì)算獲得初始速率常數(shù)(Kobs)，對(duì)Kobs與EGCG濃度進(jìn)行非線性擬合確定CYP3A4酶失活的KI和Kinact值。其中KI為反應(yīng)速率達(dá)最大失活速率一半時(shí)的EGCG濃度，Kinact為酶失活的最大反應(yīng)速率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 EGCG對(duì)CYP450酶各亞型活性的影響

與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組CYP450酶各亞型的活性均有顯著降低(F=4.15，P<0.05)，而EGCG組僅CYP1A2酶和CYP3A4酶的活性顯著降低(F=3.92、4.03，P<0.05)，見(jiàn)表2。不同濃度的EGCG抑制實(shí)驗(yàn)顯示，EGCG對(duì)CYP1A2酶和CYP3A4酶的抑制作用隨EGCG濃度的升高而增強(qiáng)，EGCG抑制CYP1A2酶的IC50為8.69 μmol/L，抑制CYP3A4酶的IC50為14.07 μmol/L(圖1)。

表2 各組CYP450酶亞型活性比較(χ/%)

2.2 EGCG對(duì)CYP1A2酶以及CYP3A4酶的抑制類(lèi)型

Lineweaver-Burk圖顯示，EGCG對(duì)CYP1A2酶的抑制作用為競(jìng)爭(zhēng)性抑制，反應(yīng)速率Vmax隨著EGCG濃度增大保持不變，Ki值為4.16 μmol/L(圖2)；而對(duì)CYP3A4酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，反應(yīng)速率Vmax隨EGCG濃度的增大而減小，Km保持不變，Ki值為7.21 μmol/L(圖3)。

另外，時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)顯示，EGCG對(duì)CYP3A4酶的抑制作用隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，0、2、5、10、20、50 μmol/L濃度EGCG對(duì)應(yīng)的Kobs值分別為0、0.011 1、0.020 4、0.031 5、0.041 9、0.042 3(圖4A)，而對(duì)CYP1A2酶的抑制作用不受培養(yǎng)時(shí)間影響，CYP3A4酶的KI值為6.38 min-1，Kinact值為0.047(μmol/L)-1(圖4B)。

A：CYP3A4酶，B：CYP1A2酶

A：Lineweaver-Burk圖，B：Ki值的計(jì)算圖(縱坐標(biāo)為圖A各濃度曲線的斜率，橫坐標(biāo)為EGCG濃度)

3 討 論

CYP450酶是一類(lèi)亞鐵血紅素-硫醇鹽蛋白的超家族，作為肝臟中重要的藥物代謝酶，參與多種藥物的體內(nèi)代謝過(guò)程[17-20]。CYP450酶活性直接影響經(jīng)其代謝的藥物在體內(nèi)的有效濃度和作用時(shí)間，進(jìn)而影響藥物的藥效及用藥安全性[21-22]。EGCG因其具有抗癌、抗突變等生物活性，廣泛應(yīng)用于心腦血

A：Lineweaver-Burk圖，B：Ki值的計(jì)算圖(縱坐標(biāo)為圖A各濃度曲線的斜率，橫坐標(biāo)為EGCG濃度)

A：不同濃度EGCG與CYP3A4酶剩余活性自然對(duì)數(shù)的回歸分析Kobs值，B：Kobs值與EGCG濃度非線性擬合獲得KI與Kinact

管疾病的臨床治療中[23-27]。在我國(guó)居民飲茶文化源遠(yuǎn)流長(zhǎng)，EGCG是茶葉的主要成分，對(duì)CYP450酶各亞型活性影響的相關(guān)研究結(jié)果，將對(duì)藥物聯(lián)合使用及用藥期間的飲食具有重要參考意義。

本文研究了EGCG對(duì)人肝微粒體中CYP450酶常見(jiàn)的8種亞型活性的影響。結(jié)果顯示，EGCG可顯著抑制CYP1A2酶與CYP3A4酶的活性，且對(duì)兩種酶活性的影響與EGCG的濃度呈相關(guān)性。通過(guò)Lineweaver-Burk分析發(fā)現(xiàn)，EGCG能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制CYP1A2酶，而對(duì)CYP3A4酶的抑制作用為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。此外，時(shí)間依賴(lài)性實(shí)驗(yàn)表明，EGCG對(duì)CYP3A4酶的抑制作用受培養(yǎng)時(shí)間影響，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。這些結(jié)果都揭示了在藥物治療期間EGCG可能會(huì)使得經(jīng)CYP1A2酶和CYP3A4酶代謝的藥物代謝速率減慢，出現(xiàn)藥物蓄積現(xiàn)象，造成不良反應(yīng)甚至毒性積累的現(xiàn)象。

CYP3A4酶占肝內(nèi)CYP酶總量的近30%，含量最高，且約有50%的藥物代謝需要CYP3A4酶的參與。因此，CYP3A4酶活性的變化對(duì)一大部分藥物的代謝具有重要的影響，如大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、咪唑類(lèi)抗真菌藥物等。但CYP3A4酶活性易受到底物、抑制劑、誘導(dǎo)劑及基因多態(tài)性的影響。此外，葡萄柚汁、木質(zhì)素類(lèi)及黃酮類(lèi)化合物也是CYP3A4酶活性的重要影響因素。EGCG能夠抑制CYP3A4酶活性，經(jīng)CYP3A4代謝的藥物會(huì)與EGCG發(fā)生相互作用，進(jìn)而對(duì)藥物療效產(chǎn)生影響。此外，EGCG對(duì)CYP3A4酶的抑制作用受培養(yǎng)時(shí)間影響較大，提示在臨床用藥中應(yīng)將用藥時(shí)間作為一個(gè)重要影響因素。CYP1A2酶雖僅參與約4%藥物的代謝，但其在藥物和前致癌物代謝及藥物與前致癌物質(zhì)活化過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果表明，EGCG對(duì)于CYP1A2酶具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，因此，對(duì)于經(jīng)CYP1A2酶代謝的藥物，在臨床應(yīng)用中要注意茶類(lèi)的飲用，預(yù)防與EGCG發(fā)生不良相互作用。

之前的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG的血漿濃度隨攝入濃度的升高而升高，525 mg EGCG在健康人體內(nèi)的最大血漿濃度為4.4 μmol/L[28-30]，1 200 mg EGCG的最大血漿濃度約為7.4 μmol/L，接近于EGCG對(duì)CYP1A2酶抑制作用的IC50值及CYP3A4的Ki值[31-34]。因此，大量攝入綠茶會(huì)增加EGCG的血漿濃度，進(jìn)而影響其他藥物的藥效和代謝的風(fēng)險(xiǎn)。

EGCG是茶飲中含量較高的兒茶素類(lèi)物質(zhì)，也是臨床用于心腦血管及免疫系統(tǒng)疾病防治的常用藥。本研究通過(guò)EGCG對(duì)人肝微粒體中CYP450酶各亞型活性的影響，為EGCG臨床合理使用及臨床藥物治療中茶葉對(duì)藥效以及代謝的影響提供了一定的依據(jù)。