miR-365-3p抑制CDK-10表達(dá)對口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期的影響

劉倩峰， 龐 超， 李慶星， 楊佩璇

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院1.口腔科，2.病理科，河北省石家莊市 050031)

口腔鱗狀細(xì)胞癌簡稱口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率逐年上升，其轉(zhuǎn)移和放化療耐受是導(dǎo)致病人死亡的最主要原因[1-2]?？谇击[癌具有復(fù)雜的發(fā)生發(fā)展作用機(jī)制，這是一個(gè)通過眾多分子參與及調(diào)控的錯(cuò)綜復(fù)雜的發(fā)病過程，在針對腫瘤遏制方面，對單一基因設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)藥物不具備理想的治療效果[3]。已有研究提出，周期素依賴性激酶-10(cyclin-dependent kinase-10，CDK-10)是調(diào)控口腔鱗癌進(jìn)展的重要分子，是具有極大應(yīng)用潛力的臨床診斷和預(yù)后評價(jià)指標(biāo)[4]。CDK-10在細(xì)胞內(nèi)具有重要的信號傳遞作用，其針對生物刺激表達(dá)的效應(yīng)作用可通過誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)[5]，在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)狀況，表現(xiàn)為抑癌的作用。微小核糖核酸(miRNA)是指小型非編碼RNA家族，其長度約21～25 nt，具有識別特定目標(biāo)mRNA的能力，調(diào)控作用的發(fā)揮可通過促進(jìn)靶mRNA的降解和/或抑制翻譯過程實(shí)現(xiàn)[6]。miR-365-3p在多種惡性腫瘤中表達(dá)，如乳腺癌[7]、膠質(zhì)瘤[8]、肺癌[9]等，其能通過抑制EHF、KRT16、c-Met等抑癌基因翻譯過程的方式，調(diào)控參與多種惡性腫瘤的發(fā)生[10]。有研究表明，靶向miR-365-3p/EHF/KRT16/β5-整合素/c-Met信號通路可提高OSCC的治療效果[11]。但miR-365-3p對口腔鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控機(jī)制的體外研究尚無報(bào)道，且其是否能夠通過調(diào)控CDK-10影響口腔鱗癌細(xì)胞生長也不清楚。本文具體探討了miR-365-3p通過CDK-10影響口腔鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡與周期的機(jī)制，以明確miR-365-3p對CDK-10的調(diào)控作用產(chǎn)生的系列效應(yīng)，有助于改善口腔鱗癌預(yù)后判斷的準(zhǔn)確性，指導(dǎo)臨床醫(yī)生對患者制定更加完善的個(gè)體化治療方案，從而提高口腔鱗癌的整體臨床治療水平。

1 資料和方法

1.1 研究材料

組織樣本來自2018年4月—2019年4月在本院就診的40例口腔鱗癌患者，提取患者腫瘤組織樣本及癌旁正常組織，檢測miR-365-3p和CDK-10表達(dá)。本研究細(xì)胞系為CAL-27，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心，培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，其含10%熱滅活胎牛血清(fulfillment by store,FBS)、谷氨酰胺4 mmol/L、青霉素5×104U/L和鏈霉素5×104U/L，5% CO2濕潤培養(yǎng)。miR-365-3p NC與miR-365-3p mimic購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染

將CAL-27隨機(jī)分為對照組、空白組、miR-365-3p組，取對數(shù)生長期細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合后，對照組與miR-365-3p組分別運(yùn)用EZ Trans細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染miR-365-3p NC與miR-365-3p mimic，轉(zhuǎn)染終濃度為10 nmol/L，轉(zhuǎn)染后12 h更換培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染后24 h，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果?？瞻捉M不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 qRT-PCR檢測miR-365-3p、CDK-10表達(dá)

轉(zhuǎn)染48 h和72 h后收獲細(xì)胞，使用刮棒刮取細(xì)胞，4 ℃條件下離心10 min，1 000 r/min，去掉上清液，收集細(xì)胞。通過Trizol法提取細(xì)胞中的總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)，采用SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)進(jìn)行熒光定量PCR檢測miR-365-3p和CDK-10的表達(dá)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydro genase，GAPDH)作為反應(yīng)體系內(nèi)參照。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

構(gòu)建CDK-10-3′非編碼區(qū)(3′UTR)-野生型(wt)、CDK-10-3′UTR-突變型(Mut)的質(zhì)粒載體pGL3-basic(瑞基生物，上海)，用miR-365-3p mimic或NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到CAL-27細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測試劑盒(碧云天，上海，RG027)檢測樣品的熒光素酶活性。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

將轉(zhuǎn)染后的舌鱗癌細(xì)胞分別接種于96孔板，約5×103個(gè)/孔，轉(zhuǎn)染后48 h與72 h去除培養(yǎng)液，再每孔加入180 μL DMEM新鮮培養(yǎng)液和20 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，去除孔內(nèi)培養(yǎng)液后，每孔加入100 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMS0)，震蕩培養(yǎng)10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光值，48 h、72 h時(shí)分別進(jìn)行細(xì)胞增殖指數(shù)測量。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

收集細(xì)胞通過胰蛋白酶消化，在轉(zhuǎn)染后72 h，離心，棄上清液，加重懸細(xì)胞，加入2～3 mL預(yù)冷的70%冰乙醇，吹打均勻，置4 ℃冰箱中固定48 h以上。經(jīng)5 min，1 000 r/min離心棄去乙醇，重懸后加入碘化丙啶染液(PI染液，100 mg/L)，在室溫條件下避光混合30 min，細(xì)胞周期的檢測采用流式細(xì)胞儀。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，將細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行調(diào)整約1×106個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液1 mL，4 ℃ 1 000 r/min離心10 min，將細(xì)胞進(jìn)行重懸，重復(fù)上述操作1次，取200 μL結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重懸于其中。將5 μL PI與10 μL Annexin V-FITC加入并混勻，將其在避光條件下室溫反應(yīng)15 min，采用流式細(xì)胞儀對對照組、空白組與miR-365-3p組檢測細(xì)胞凋亡指數(shù)。上述實(shí)驗(yàn)皆重復(fù)三次后取其平均值。

1.8 Western blot檢測CDK-10表達(dá)

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，進(jìn)行兩次PBS洗滌細(xì)胞，取細(xì)胞，加入100 μL預(yù)冷后蛋白裂解液，完成裂解蛋白后分裝，將其保存在-70 ℃冰箱中。把GAPDH(Abcam)作為內(nèi)參照，用CDK-10(Abcam)抗體進(jìn)行Western blot檢測。具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[10,12]。

1.9 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié) 果

2.1 口腔鱗癌組織中miR-365-3p與CDK-10表達(dá)

口腔鱗癌組織中miR-365-3p表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)，CDK-10表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05；表1)。miR-365-3p與CDK-10的Perason相關(guān)性分析顯示二者呈負(fù)相關(guān),Pearson系數(shù)為-0.736，P<0.05。

表1 miR-365-3p與CDK-10相對表達(dá)水平對比

2.2 miR-365-3p在CAL-27細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染結(jié)果及細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率

對照組和miR-365-3p轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率分別為90%、76%，兩組比較，差異有顯著性(P<0.05；圖1)。說明miR-365-3p mimic或NC質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染到CAL-27細(xì)胞中。

圖1 miR-365-3p在CAL-27細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染結(jié)果A為熒光顯微鏡下轉(zhuǎn)染結(jié)果(100×)；B為兩組轉(zhuǎn)染效率柱狀圖分析。a為P<0.05，與對照組比較。

2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果

雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測結(jié)果顯示，miR-365-3p mimic顯著降低CDK-10 3′UTR熒光素酶活性(P<0.05；圖2)。

圖2 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果1為miR-365-3p NC+CDK-wt；2為miR-365-3p mimics+CDK-wt；3為miR-365-3p NC+CDK-mut；4為miR-365-3p mimics+CDK-mut。a為P<0.05，與1比較。

2.4 miR-365-3p和CDK-10 mRNA表達(dá)水平對比

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，miR-365-3p在miR-365-3p組的表達(dá)水平均顯著高于空白組與對照組(均P<0.05)，即miR-365-3p mimics轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，CDK-10在miR-365-3p組的表達(dá)水平均顯著低于空白組與對照組，暗示miR-365-3p的高表達(dá)抑制CDK-10的表達(dá)(圖3)。

2.5 三組CDK-10蛋白表達(dá)水平對比

轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，與空白組及對照組比較，miR-365-3p組CDK-10蛋白相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05；圖4)。

圖3 各組不同時(shí)間CDK-10和miR-365-3p的mRNA表達(dá)水平a為P<0.05，與對照組和空白組比較。

圖4 三組不同時(shí)間點(diǎn)的CDK-10蛋白表達(dá)對比

2.6 細(xì)胞增殖指數(shù)對比

轉(zhuǎn)染48 h與72 h后，相較于對照組與空白組，miR-365-3p組細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低(P<0.05；表2)。

表2 三組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖指數(shù)對比 單位：%

2.7 細(xì)胞凋亡水平對比

轉(zhuǎn)染48 h與72 h后，與對照組及空白組比較，miR-365-3p組細(xì)胞凋亡水平顯著升高(P<0.05；表3，圖5)。

表3 三組不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 單位：%

圖5 不同時(shí)間點(diǎn)三組細(xì)胞凋亡指數(shù)的對比

2.8 細(xì)胞周期對比

轉(zhuǎn)染72 h后，相較于空白組與對照組，miR-365-3p組的G1期比例顯著降低(P<0.05)，S期+G2期比例則顯著增加(P<0.05；圖6，表4)。

圖6 三組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞周期比例對比

表4 三組轉(zhuǎn)染后72 h的細(xì)胞周期比例比較 單位：%

3 討 論

近年來口腔鱗癌的發(fā)病率呈上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的全球公共衛(wèi)生問題[12]。因此，明確口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)新的臨床診斷的分子標(biāo)志物，為臨床治療的藥物靶點(diǎn)及制定有效的臨床治療方案提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)尤為重要。有研究表明在肝細(xì)胞癌中抑制miR-365-3p可部分挽救8號染色體介導(dǎo)的惡性表型[13]。有學(xué)者采用qRT-PCR檢測miR-365-3p的表達(dá)水平，其研究結(jié)果顯示miR-365-3p在正常組織中具有很低的表達(dá)水平，而其在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)水平增加10倍以上[14]。本研究顯示，口腔鱗癌組織中miR-365-3p表達(dá)顯著低于癌旁正常組織，與以往結(jié)果具有相似性，但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

本研究轉(zhuǎn)染細(xì)胞后用熒光顯微鏡檢測轉(zhuǎn)染效率發(fā)現(xiàn)，對照組和miR-365-3p轉(zhuǎn)染組的轉(zhuǎn)染效率分別為90%，76%,轉(zhuǎn)染后48 h與72 h，相較于對照組與空白組miR-365-3p表達(dá)水平在miR-365-3p組顯著升高，細(xì)胞增殖指數(shù)顯著降低，miR-365-3p轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于空白組與對照組；轉(zhuǎn)染后72 h，相較于空白組與對照組G1期比例在miR-365-3p組出現(xiàn)顯著降低現(xiàn)象，S期+G2期則出現(xiàn)比例顯著增加現(xiàn)象，可見miR-365-3p的高表達(dá)具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的作用。既往研究顯示，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及其他功能的調(diào)控中miR-365-3p具有廣泛而重要的作用,參與很多病理過程，推測miR-365-3p可為此而發(fā)揮潛在的促腫瘤作用[15-16]。這與本研究結(jié)果具有一致性。

CDK-10在細(xì)胞周期進(jìn)程中受到諸多信號通路的精細(xì)調(diào)控，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育、肝臟纖維化等多種生理與病理過程[17-18]。在惡性腫瘤的形成與發(fā)展過程中，很多CDK作為癌基因(oncogene)高表達(dá)激活細(xì)胞惡性表型，而CDK-10卻呈現(xiàn)潛在的抑癌基因(tumor suppressor gene)特性[19]。已有研究證實(shí)，基因啟動(dòng)子高頻甲基化是造成惡性腫瘤中CDK-10表達(dá)下調(diào)的重要原因[20]。在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)CDK-10可顯著抑制其增殖、侵襲遷移等惡性生物學(xué)行為。CDK-10表達(dá)缺失與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期和不良總生存期密切相關(guān)，CDK-10表達(dá)可作為乳腺癌預(yù)后評判的獨(dú)立指標(biāo)。本研究結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染48 h與72 h后，相較于空白組與對照組CDK-10蛋白在miR-365-3p組的相對表達(dá)量顯著降低，而對照組與空白組的組間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其和OSCC密切相關(guān)。有研究表明miR-365-3p在皮膚癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤組織中被誘導(dǎo)高表達(dá)[21]。體外研究miR-365a-3p對肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲結(jié)果表明miR-365a-3p通過下調(diào)miR-365a/USP33/SLIT2/ROBO1軸來促進(jìn)肺癌的發(fā)生，結(jié)果證明miR-365a-3p在肺腺癌和肺癌細(xì)胞株中表達(dá)上調(diào)，miR-365a-3p可促進(jìn)體內(nèi)腫瘤的形成[22]。有學(xué)者用Targetscan預(yù)測FOXK1的上游表達(dá)，提示miR-365-3p可以調(diào)節(jié)乳腺癌中FOXK1的表達(dá)[23]。本研究中CDK-10蛋白的表達(dá)可被miR-365-3p的高表達(dá)抑制，熒光素酶報(bào)告基因檢測發(fā)現(xiàn)，miR-365-3p mimic和CDK10-3′UTR-Wt的共轉(zhuǎn)染導(dǎo)致熒光素酶活性降低，提示miR-365-3p能夠和CDK-10特異性結(jié)合，并抑制CDK-10表達(dá)。有研究顯示通過抑制CDK-10蛋白的表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)STAT3磷酸化的誘導(dǎo)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)后，其下游基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)可得到促進(jìn)，進(jìn)而上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與過度增殖被促進(jìn)[24]。CDK-10的異常表達(dá)可使得SMAD信號受體蛋白被招募到miR-365-3p之中形成復(fù)合體，調(diào)控了miR-365-3p的活化。而抑制CDK-10的表達(dá)可在轉(zhuǎn)錄水平抑制miR-365-3p的表達(dá)從而上調(diào)Fasl的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]，這與本研究結(jié)果具有相似性。

總之，miR-365-3p在口腔鱗癌細(xì)胞中的高表達(dá)能夠抑制CDK-10表達(dá)，從而抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。