小柴胡湯通過(guò)TGF-β1/Smad通路改善大鼠肝纖維化

劉世政， 凌再芹， 林愛(ài)清

(山東省胸科醫(yī)院，山東省濟(jì)南市250000)

肝纖維化是肝硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理改變，延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化是防治肝硬化的重要靶點(diǎn)之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合后能夠激活細(xì)胞內(nèi)的Smad2、Smad3，進(jìn)而調(diào)節(jié)膠原代謝、促進(jìn)纖維化[1]。有研究報(bào)道，多種具有抗纖維化作用的藥物能夠抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活[2-3]。

小柴胡湯是具有護(hù)肝作用的經(jīng)典中藥湯劑，出自《傷寒雜病論》，主要成分柴胡、黃芩均具有護(hù)肝、抗炎及抗氧化的作用。有相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道，小柴胡湯能夠改善肝纖維化大鼠的肝功能及膠原纖維堆積[4-5]；細(xì)胞實(shí)驗(yàn)報(bào)道，小柴胡湯含藥血清能夠抑制肝星狀細(xì)胞增殖活化、阻礙TGF-β1/Smad信號(hào)通路的激活[6]。但是，小柴胡湯是否直接通過(guò)TGF-β1/Smad信號(hào)通路改善大鼠肝纖維化尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠肝纖維化模型為研究對(duì)象，研究小柴胡湯通過(guò)TGF-β1/Smad通路改善大鼠肝纖維化的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

小柴胡湯由本院中藥房配置，藥液的生藥含量為5 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?；四氯化碳?gòu)自Sigma公司；Smad2/3激活劑SRI-011381購(gòu)自MCE公司；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate amino transferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine amino transferase，ALT)、白蛋白(albumin，ALB)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成研究所，透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)、層粘蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)的酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海西唐公司；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、PCR試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)公司，RIPA裂解液、BCA試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，TGF-β1、Smad2、Smad3一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 動(dòng)物分組

雄性SD大鼠(上海菲諾克生物科技有限公司)，8～10周、160～200 g，生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0005。32只大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、模型組、中藥組、中藥+SRI組，后3組進(jìn)行肝纖維化造模，方法如下：用植物油配置含有40%四氯化碳的溶液，按照0.15 mL/100 g劑量皮下注射、2次/周(第1～4周)，而后改為0.2 mL/100 g劑量皮下注射、2次/周(第5～6周)。中藥組、中藥+SRI組在造模過(guò)程中給與小柴胡湯44.5 g/kg灌胃、1次/天；中藥+SRI組同時(shí)給與30 mg/kg SRI-011381腹腔注射、1次/天；對(duì)照組和模型組給與等劑量生理鹽水灌胃。

1.3 肝臟病理改變的檢測(cè)

末次干預(yù)后第2天，斷頭法處死大鼠，解剖肝臟，4%多聚甲醛固定48 h后石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色，在顯微鏡下觀察肝臟的病理改變。

1.4 血清指標(biāo)的檢測(cè)

斷頭法處死大鼠時(shí)采集外周血4～5 mL，靜置0.5 h后自然凝血，3 000 r/min離心10 min，分離血清后采用試劑盒檢測(cè)ALB、ALT、AST、HA、LN、PCⅢ的含量，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5 PCR檢測(cè)肝臟TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)

取肝臟組織適量，采用RNA提取試劑盒提取組織中的RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR試劑盒配置PCR反應(yīng)體系，對(duì)TGF-β1、Smad2、Smad3、β-actin cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到循環(huán)曲線及對(duì)應(yīng)的循環(huán)閾值(Ct)，以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計(jì)算TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平。

1.6 Western blot檢測(cè)肝臟TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)

取肝臟組織適量，采用RIPA裂解液提取組織中的蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白含量，而后取30 μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸變性后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。先進(jìn)行電泳分離蛋白，而后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜1 h，1∶1 000稀釋的TGF-β1、Smad2、Smad3一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗4℃孵育PVDF膜過(guò)夜；次日，1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育PVDF膜1 h，最后在凝膠成像儀中顯影得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的吸光值、以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟病理改變的比較

從圖1可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠肝臟內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠肝臟內(nèi)小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞廣泛脂肪變性及空泡變性，匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生；中藥組大鼠肝纖維化的病理改變較模型組明顯改善；中藥+SRI組大鼠肝纖維化的病理改變較中藥組明顯加重。

圖1 各組大鼠肝臟病理改變(HE染色，400×)白色箭頭為增生的纖維結(jié)締組織。

2.2 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)的比較

從表1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清ALB含量明顯降低，ALT、AST含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠血清ALB含量明顯增加，ALT、AST含量明顯降低(P<0.05)；與中藥組比較，中藥+SRI組大鼠血清ALB含量明顯降低，ALT、AST含量明顯增加(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清ALB、ALT、AST含量的比較(n=8)

2.3 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)的比較

從表2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量明顯降低(P<0.05)；與中藥組比較，中藥+SRI組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量明顯增加(P<0.05)。

2.4 各組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)的比較

從表3可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與中藥組比較，中藥+SRI組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。

表2 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ含量的比較(n=8)

表3 各組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表達(dá)的比較(n=8)

2.5 各組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)的比較

從圖2和表4可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與中藥組比較，中藥+SRI組大鼠肝臟中TGF-β1的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)。

圖2 各組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表達(dá)的比較(n=8)

3 討 論

肝纖維化是肝硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要的病理改變，延緩或逆轉(zhuǎn)肝纖維化的進(jìn)程是肝硬化有效的防治策略。近些年，多種中藥湯劑被證實(shí)具有改善肝纖維化的作用[7-8]，其中小柴胡湯是具有抗纖維化、改善肝功能作用的經(jīng)典中藥方劑，該方劑由柴胡、黃芩、人參、甘草、生姜、大棗、半夏等7味中藥組成，功效為和解少陽(yáng)、扶正祛邪。肝星狀細(xì)胞在炎癥及氧化應(yīng)激等因素的刺激下發(fā)生活化是促進(jìn)肝纖維化的重要環(huán)節(jié)，多項(xiàng)現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，柴胡和黃芩中的活性成分能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化、抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)[9-10]；胡睿等[6]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，小柴胡湯的含藥血清能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而起到抑制肝纖維化的作用?；诖耍狙芯刻岢黾僭O(shè)：小柴胡湯可能具有改善肝纖維化的作用。

為了驗(yàn)證假設(shè)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)經(jīng)典的四氯化碳皮下注射方式進(jìn)行肝纖維化造模，用以模擬肝硬化發(fā)病過(guò)程中肝纖維化的病理改變。造模后觀察肝臟HE染色的變化可知：肝臟出現(xiàn)了小葉結(jié)構(gòu)破壞、肝細(xì)胞廣泛脂肪變性及空泡變性、匯管區(qū)纖維結(jié)締組織增生等肝硬化及肝纖維化特征性的病理改變，表明造模成功。在四氯化碳皮下注射造模的過(guò)程中，給與小柴胡湯灌胃干預(yù)后觀察到肝臟纖維化的病理改變較模型組明顯改善，表明小柴胡湯能夠改善大鼠的肝纖維化，與小柴胡湯含藥血清在體外抑制肝星狀細(xì)胞活化的作用[6]吻合。

在肝纖維化的進(jìn)程中，肝細(xì)胞發(fā)生損傷和破壞，細(xì)胞外基質(zhì)中膠原代謝異常、纖維結(jié)締組織增生并形成了組織纖維化。多項(xiàng)肝纖維化相關(guān)的臨床和基礎(chǔ)研究表明，肝細(xì)胞的損傷和破壞會(huì)減少ALB的合成，增加ALT、AST的釋放；在膠原代謝異常、纖維結(jié)締組織增生的過(guò)程中，HA、LN、PCⅢ的合成和釋放明顯增多[11-13]。本實(shí)驗(yàn)觀察到：模型組大鼠血清ALB含量降低，ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量均增多。加用小柴胡湯灌胃干預(yù)后，大鼠血清ALB含量增加，ALT、AST、HA、LN、PCⅢ含量均降低，表明小柴胡湯干預(yù)能夠減輕肝損害、改善肝纖維化，與HE染色觀察到的病理改變吻合。

TGF-β1是促進(jìn)肝纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞因子，能夠通過(guò)下游Smad2、Smad3進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并刺激肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)而引起下游蛋白酶及其抑制物表達(dá)變化并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生[14-17]。已有細(xì)胞研究表明，小柴胡湯顯著抑制肝星狀細(xì)胞中TGF-β1/Smad通路的激活[6]。本實(shí)驗(yàn)觀察到：模型組大鼠肝臟中TGF-β1、Smad2、Smad3的表達(dá)增加，而小柴胡湯干預(yù)后TGF-β1、Smad2、Smad3的表達(dá)減少，表明肝硬化大鼠存在肝臟TGF-β1/Smad通路的激活，小柴胡湯則能抑制肝臟TGF-β1/Smad通路的激活。在此基礎(chǔ)上，小柴胡湯灌胃的同時(shí)聯(lián)合使用Smad2/3激活劑SRI-011381后觀察到：大鼠肝纖維化的病理改變加重，小柴胡湯調(diào)節(jié)血清指標(biāo)的作用也明顯減弱，表明Smad2/3激活劑逆轉(zhuǎn)了小柴胡湯抑制大鼠肝纖維化的作用，進(jìn)而提示小柴胡湯通過(guò)TGF-β1/Smad通路發(fā)揮抗肝纖維化的作用。

綜上所述，小柴胡湯能夠改善大鼠的肝纖維化，抑制TGF-β1/Smad通路是介導(dǎo)這一改善作用可能的分子機(jī)制，未來(lái)小柴胡湯有望成為防治肝硬化、延緩肝纖維化的備選藥物。