曹曉麗, 蘇世文, 賈 英
(1.重慶市壁山區(qū)中醫(yī)院, 重慶市402760;2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,重慶市 400042)
宮頸癌是臨床最常見的婦科惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率位居中國女性惡性腫瘤第2位,僅次于乳腺癌,30~35歲為原位癌的高發(fā)年齡,45~55歲為浸潤癌的高發(fā)年齡[1]。隨著人們生活和飲食習慣的改變,宮頸癌年輕化趨勢日漸明顯[2]。據(jù)調查顯示,全球每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約52.9萬,死亡病例數(shù)約20.0萬,而中國每年宮頸癌新發(fā)病例數(shù)約13.2萬,死亡病例數(shù)約3.0萬[3]。目前臨床采用手術結合放化療的綜合治療方案,能夠縮小腫瘤病灶,改善臨床癥狀,延長患者生存時間,但仍有部分患者因遠處轉移或者局部復發(fā)導致治療失敗,預后結局差[4-5]。因此研究宮頸癌的發(fā)病機制對于尋找新的診治靶點有著重要意義。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)已被證實是宮頸癌的首要致病因素,與宮頸癌發(fā)生及進展關系十分密切[6]。低密度脂蛋白受體相關蛋白11(low density lipoprotein receptor-related protein 11,LRP11)是一種跨膜蛋白,可通過內(nèi)吞脂蛋白顆粒調控脂質穩(wěn)態(tài),還可參與血管通透性調節(jié)、細胞增殖、細胞侵襲等生命活動[7]。以往研究顯示,LRP11在乳腺癌、尿路上皮癌、結腸癌、甲狀腺癌等腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8],但它是否參與宮頸癌的發(fā)生及進展尚不清楚。因此,本研究分析了LRP11在宮頸癌中的表達及其與HPV感染和腫瘤進展的關系,以期為宮頸癌的防治提供新的思路。
EMS5000系列振動組織切片機(湖南遠湘生物科技有限公司);CKX31倒置顯微鏡(北京??松萍加邢薰?;CytoFLEX S流式細胞儀(北京普瑞麥迪實驗室技術有限公司);BIOTEK全自動酶標儀(上海必優(yōu)生物科技有限公司);MiniChemiⅡ凝膠成像儀(北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司);兔抗人LRP11單克隆抗體(北京諾博萊德科技有限公司);羊抗鼠IgG(廣州碩恒生物科技有限公司);DAB顯色試劑盒(上海覓拓生物科技有限公司);BCA試劑盒(北京綠百草科技發(fā)展有限公司);一抗LRP11(上海武昊生物科技有限公司);一抗β-actin(上海妍琦生物科技有限公司);HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司);超敏型ECL化學發(fā)光液(上海晶抗生物工程有限公司);pEGFP-N1質粒、pEGFP-N1-LRP11質粒(湖南豐暉生物科技有限公司);CCK-8增強型溶液(深圳市紐邦生物技術有限公司);Annexin V-FITC(上海三抒生物科技有限公司);PI染液(上海三抒生物科技有限公司)。
收集2017年1月—2020年1月本院123例宮頸癌手術患者的癌組織及癌旁正常組織,其中HPV陰性25例,HPV陽性98例。入組標準:未經(jīng)過放療或化療等抗癌治療;未合并其他惡性腫瘤或影響生存期的全身性疾??;具有完整的病例資料和隨訪資料。其中癌組織中HPV陰性或HPV陽性通過PCR-DNA反向雜交實驗證實,操作如下:取石蠟包埋癌組織標本依據(jù)試劑盒說明書進行HPV-DNA提取、PCR擴增、雜交、洗膜、顯色。結果判讀陽性質控品雜交膜條出現(xiàn)在HPV基因型位點或IC位點呈現(xiàn)藍色,其余位點都不顯色;陰性結果:IC位點和其余位點均不顯色。HPV檢測分型為高危型。
HPV陽性人宮頸癌細胞系Hela,購于上海北諾生物科技有限公司;HPV陰性人宮頸癌細胞系C33A,購于上海澳音生物科技有限公司;人正常宮頸上皮細胞系HUCECs,購于上海雅吉生物科技有限公司。3種細胞用含0.1 mmol/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2飽和濕度溫箱中培養(yǎng)傳代,取對數(shù)生長期的細胞用于各實驗。
將Hela細胞分為對照組、空質粒組、LRP11質粒組,參照LipofectamineTM2000轉染說明書,空質粒組轉染8 μg pEGFP-N1質粒,LRP11質粒組轉染8 μg pEGFP-N1-LRP11質粒,對照組不進行任何轉染處理,完成上述操作后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。
采用免疫組織化學染色法檢測癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中LRP11蛋白表達水平。將各組織用EMS5000系列振動組織切片機4 μm連續(xù)切片,二甲苯脫蠟,檸檬酸鈉緩沖液抗原修復,PBS緩沖液漂洗,內(nèi)源性過氧化物酶滅活,加山羊血清封閉,滴加稀釋比例為1∶200的兔抗人LRP11單克隆抗體,4 ℃孵育過夜,PBS漂洗,滴加稀釋比例為1∶400的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育20 min,PBS漂洗,使用DAB顯色試劑盒進行顯色5 min,PBS終止反應,蘇木精復染,梯度乙醇脫水,中性樹脂固封劑封固,由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生在雙盲情況下應用顯微鏡觀察陽性細胞率和著色程度。參照董頔等[9]免疫組化評分標準,取兩項得分之積,最終得分0~3分判定為陰性,最終得分>3分判定為陽性。
采用Western blot法檢測HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量。取培養(yǎng)的HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞,用細胞裂解液裂解,抽提蛋白,采用BCA試劑盒檢測蛋白水平,蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE分離后,轉移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉溶液在搖床上室溫封閉2 h,加入一抗LRP11(1∶500)、一抗β-actin(1∶400),4 ℃孵育過夜,用PBST洗滌3次,再加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶4 000),室溫孵育2 h,用PBST洗滌3次,用超敏型ECL化學發(fā)光液檢測蛋白條帶,用MiniChemiⅡ凝膠成像儀采集圖像,用Image J軟件掃描灰度值,分析結果。
采用Western blot法檢測各組Hela細胞中LRP11蛋白表達量,取轉染后的各組Hela細胞,操作方法同上。
采用CCK8法檢測各組Hela細胞增殖率。取轉染后的各組Hela細胞,接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL培養(yǎng)基),5×103個/孔細胞培養(yǎng)48 h,加入CCK8增強型溶液(每孔10 μL),避光孵育2 h,在BIOTEK全自動酶標儀450 nm處測定吸光度值,計算Hela細胞增殖率,Hela細胞增殖率(%)=(吸光度值處理組/吸光度值對照組)×100%。
采用Transwell小室侵襲實驗檢測各組Hela細胞的侵襲能力。取轉染后的各組Hela細胞,制成細胞懸液,在Transwell小室的上室鋪入基質膠(每孔60 μL,37 ℃成膠),加入細胞懸液(1×103個/孔),在Transwell小室的下室中加入600 μL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,棄掉上室液體,90%乙醇常溫固定30 min,風干之后用0.1%結晶紫常溫染色10 min,用PBS漂洗3次,在CKX31倒置顯微鏡下隨機選取4個視野進行拍照,并計算穿過小室膜的Hela細胞數(shù)。
采用流式細胞術檢測各組Hela細胞的凋亡率。取轉染后的各組Hela細胞,用4℃預冷PBS溶液洗滌細胞3次,用1×Tris Buffer緩沖液(250 μL)重新懸浮細胞至1×109個/L,然后加入Annexin V-FITC(3 μL)、PI染液(10 μL),充分混勻,避光反應15 min,用CytoFLEX S流式細胞儀檢測Hela細胞的凋亡率。
LRP11蛋白主要表達于細胞質。LRP11在癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中陽性表達率分別為10.57%(13/123)、52.00%(13/25)、75.51%(74/98),3組之間LRP11陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=96.830,P<0.001),其中HPV陰性宮頸癌組織中LRP11陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=24.628,P<0.001),HPV陽性宮頸癌組織LRP11陽性表達率高于癌旁正常組織(χ2=96.369,P<0.001),HPV陽性宮頸癌組織LRP11陽性表達率高于HPV陰性宮頸癌組織(χ2=5.318,P=0.02;圖1)。
圖1 癌旁正常組織、HPV陰性宮頸癌組織、HPV陽性宮頸癌組織中LRP11蛋白表達水平的比較(免疫組化染色,400×)
HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量比較,差異有統(tǒng)計學意義(F=22.810,P=0.002),其中C33A細胞LRP11蛋白表達量高于HUCECs細胞(Q=4.033,P<0.01),Hela細胞LRP11蛋白表達量高于HUCECs細胞(Q=9.514,P<0.01),Hela細胞LRP11蛋白表達量高于C33A細胞(Q=5.481,P<0.01;圖2)。
圖2 HUCECs細胞、C33A細胞、Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較a為P<0.01,與HUCECs細胞比較;b為P<0.01,與C33A細胞比較。
LRP11質粒組Hela細胞中的LRP11蛋白表達量較對照組和空質粒組高,差異具有統(tǒng)計學意義(Q=6.992、6.912,P均<0.01);空質粒組Hela細胞中的LRP11蛋白表達量較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.080,P>0.05;圖3)。
圖3 各組Hela細胞中LRP11蛋白表達量的比較a為P<0.05,與對照組和空質粒組比較。
LRP11質粒組Hela細胞增殖率較對照組和空質粒組高,差異具有統(tǒng)計學意義(Q=43.075、42.568,P均<0.01)。LRP11質粒組Hela細胞凋亡率較對照組和空質粒組低,差異具有統(tǒng)計學意義(Q=9.868、10.541,P均<0.05),空質粒組Hela細胞增殖率和凋亡率較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.507、0.672,P均>0.05;表1、圖4)。
表1 各組Hela細胞增殖率和凋亡率的比較 單位:%
圖4 各組Hela細胞凋亡情況的比較橫坐標為Annexin V/FITC染色;縱坐標為PI染色。Q1象限為機械性死亡細胞;Q2象限為凋亡晚期的細胞;Q3象限為正?;罴毎籕4象限為凋亡早期的細胞。
LRP11質粒組穿過小室膜的Hela細胞數(shù)較對照組和空質粒組高,差異具有統(tǒng)計學意義(Q=18.075、17.724,P均<0.01);空質粒組穿過小室膜的Hela細胞數(shù)較對照組差異無統(tǒng)計學意義(Q=0.351,P>0.05;表2、圖5)。
表2 各組Hela細胞侵襲能力的比較
圖5 各組Hela細胞侵襲能力的比較(結晶紫染色,100×)
早期宮頸癌通常無明顯癥狀和體征,隨著病情進展,根據(jù)癌灶累及范圍可出現(xiàn)陰道流血、下肢腫痛、腎盂積水、貧血、輸尿管梗阻等繼發(fā)性癥狀。據(jù)報道,晚期宮頸癌術后5年總生存率僅10%~20%[10],故早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是提升宮頸癌患者預后的關鍵。
HPV是一種球形DNA病毒,屬乳多空病毒科,感染途徑包括性傳播、醫(yī)源性感染、母嬰傳播等,可引起人體皮膚或黏膜的鱗狀上皮增殖,引發(fā)上皮良、惡性腫瘤,如尖銳濕疣、肛門癌、宮頸癌等,其中以宮頸癌為常見。報道顯示,HPV在14~59歲人群中的總感染率為26.8%[11],HPV感染是導致宮頸癌的主要生物學因素,HPV的癌基因整合宮頸上皮細胞后,可產(chǎn)生大量E7癌蛋白,E7與抑癌基因Rb結合后可引起細胞增殖調控障礙,誘發(fā)宮頸癌細胞異常增殖。在本研究中,免疫組織化學染色實驗和Western blot實驗均提示LRP11在宮頸癌中呈高表達,且LRP11表達與HPV感染有一定相關性,表明LRP11和HPV可能共同參與了宮頸癌的發(fā)病。LRP11為LRP家族中的重要一員,是一種細胞表面蛋白,可通過與溶酶體結合而促進溶酶體降解,調控多個分子表達水平,還可參與多個細胞生理事件,如細胞增殖、細胞遷移、血管生成調節(jié)、凋亡細胞信號調節(jié)、血脂動態(tài)平衡調節(jié)等。此外,LRP11可通過內(nèi)化某些基質蛋白和生長因子而調節(jié)腫瘤微環(huán)境,進而參與調節(jié)與腫瘤細胞增殖、轉移有關的信號轉導。LRP11也是上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的重要因素之一,可通過調節(jié)細胞骨架組織、控制局灶性黏附成分、調節(jié)整合素內(nèi)吞循環(huán),強化惡性細胞侵襲性表型,促進惡性腫瘤進展[12]。本研究Western blot實驗顯示,LRP11質粒組LRP11蛋白表達量較對照組和空質粒組高,而對照組和空質粒組之間的LRP11蛋白表達量無明顯差異,提示LRP11過表達載體構建成功。接下來通過CCK8實驗、Transwell小室侵襲實驗、流式細胞術實驗發(fā)現(xiàn),LRP11質粒組Hela細胞增殖率、穿過小室膜的Hela細胞數(shù)、LRP11蛋白表達量較對照組和空質粒組高,LRP11質粒組Hela細胞凋亡率較對照組和空質粒組低,提示LRP11過表達可促進宮頸癌細胞增殖和侵襲,抑制其凋亡,以加速癌細胞進展,這與以下研究報道有相似之處。研究發(fā)現(xiàn),LRP11可通過激活Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)/信號轉導因子和轉錄活化因子3(Signal transduction factor and activator of transcription 3,STAT3)通路而強化纖溶酶原激活物抑制因子1(Plasminogen activator inhibitor 1,PAI-1)的促細胞遷移活性[13]。研究提示,LRP11可通過調節(jié)基質金屬蛋白酶(matrix metallo protease,MMP)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達水平而促進癌細胞侵襲和遷移[14]。報道指出,LRP11可通過激活無翅型MMTV整合位點家族成員蛋白(Wnt)/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路,加速細胞周期進程,促進腫瘤發(fā)展[15]。學者發(fā)現(xiàn),LRP11在乳腺癌中呈高水平且與癌細胞浸潤和轉移密切相關[16]。研究顯示,LRP11與甲狀腺癌患者癌組織中的細胞增殖抗原Ki-67具有很強的正相關性,LRP11和Ki-67表達水平聯(lián)合檢測對甲狀腺癌的臨床診療有重要意義[17]。臨床資料顯示,LRP11在宮頸癌患者中的表達水平明顯上調,其表達水平與宮頸癌患者總生存時間呈負相關[18]。由此表明LRP11在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤發(fā)病過程中具有重要作用,臨床應加以關注,以探索出新的宮頸癌預防及治療靶點。
綜上所述,LRP11在宮頸癌中呈高表達,宮頸癌中LRP11表達與HPV感染有一定相關性;LRP11過表達可促進宮頸癌細胞增殖和侵襲,抑制其凋亡,以加速腫瘤進展。但其機制尚不清楚,有待進一步研究。