苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯復(fù)配對石榴干腐病菌的聯(lián)合毒力測定

李松遠(yuǎn)，姚 昕，涂 勇

（西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川西昌 615013）

石榴是在我國有著長久種植歷史的水果，在南北地區(qū)均有種植，有著極高的食用和藥用價(jià)值[1]。石榴干腐?。–oniella granati）是石榴生長和貯藏期的一種常見病害，其病原菌一般在石榴花期結(jié)束至套袋前潛伏侵染，病果的典型特征是幼果在潮濕情況下變褐腐敗，如果遇到高溫干旱天氣會使果實(shí)失水皺縮，出現(xiàn)裂果或者紅褐色僵果[2]。即使是在果實(shí)成熟后的貯運(yùn)過程中依舊會發(fā)病，引起大量爛果，對石榴產(chǎn)業(yè)危害極大。

石榴干腐病的防治藥劑以多菌靈和甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑為主[3-4]，但此類藥劑引發(fā)的病菌抗藥性問題已經(jīng)引起了人們的高度重視。因此，如何在現(xiàn)有藥劑基礎(chǔ)上，篩選出更為有效并能一定程度上延緩病菌抗藥性的藥劑組合具有十分重要的意義。苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）是一種新型的甾醇脫甲基化廣譜殺菌劑，對許多病菌均有較好的抑制作用，在果樹、蔬菜等作物中被廣泛使用[5-6]。吡唑醚菌酯（Pyraclostrobin）是一種新型廣譜甲氧基丙烯酸酣類殺菌劑，其機(jī)理是對病菌線粒體的呼吸作用產(chǎn)生抑制效果，從而阻止病菌細(xì)胞的生長發(fā)育致其死亡，該藥劑兼具治療、保護(hù)作用。目前，國內(nèi)還未見苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯復(fù)配對石榴干腐病菌的聯(lián)合毒力測定方面的研究報(bào)道。

為充分利用以上兩種藥劑的優(yōu)勢，最大限度地降低病原菌對藥劑的抗藥性，本試驗(yàn)探索了苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯復(fù)配后對石榴干腐病的室內(nèi)聯(lián)合毒力，以期為石榴干腐病的藥劑防治提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試藥劑：20%苯醚甲環(huán)唑水乳劑，青島瀚生生物科技有限公司生產(chǎn)；30%吡唑醚菌酯懸浮劑，河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)。

供試菌株：2020年11月從貯藏期發(fā)病石榴的果皮上運(yùn)用組織分離法獲得，通過培養(yǎng)性狀觀察和分子生物學(xué)手段并結(jié)合柯赫氏法則鑒定的石榴干腐病菌。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同復(fù)配組合對石榴干腐病菌菌絲的室內(nèi)毒力測定

以藥劑有效成分在含藥平板培養(yǎng)基中的濃度作為菌體實(shí)際受藥濃度。試驗(yàn)前在超凈工作臺上將苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯用無菌水稀釋成6 000 mg·L-1的母液，再按不同的質(zhì)量比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1、0∶1）配制出混合藥液。之后再用無菌水將上述藥劑制得質(zhì)量濃度為1 500.0 mg·L-1、600.0 mg·L-1、300.0 mg·L-1、150.0 mg·L-1、30.0 mg·L-1和3.0 mg·L-1的藥液備用。在PDA 培養(yǎng)基滅菌后冷卻到55 ℃左右時(shí)，用移液管分別移取1.0 mL的上述混合藥液加入49 mL PDA 培養(yǎng)基中后迅速搖勻，以制取出30 mg·L-1、12 mg·L-1、6.0 mg·L-1、3.0 mg·L-1、0.6 mg·L-1和0.06 mg·L-1的含藥平板培養(yǎng)基。各組濃度的藥劑分別設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組和一個(gè)空白對照組，空白對照組用等量的無菌水替代藥劑。

使用酒精燈灼燒冷卻后的打孔器在純化后的菌落邊緣處打取菌餅（直徑0.4 cm）后接種在含藥平板培養(yǎng)基的正中央，置于濕度60%、溫度26 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于第6 d 使用游標(biāo)卡尺測量各個(gè)供試平板培養(yǎng)基上的菌落直徑，每處理以3 次重復(fù)測量值平均數(shù)為最終數(shù)據(jù)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Excel 和SPSS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Wadley 法[7]進(jìn)行聯(lián)合毒力評價(jià)。分別以參試藥劑及其不同配比組合的各濃度梯度對數(shù)作為自變量x，把其對應(yīng)的相對抑菌率的查表幾率值作為因變量y，運(yùn)用最小二乘法分別解出毒力回歸方程（y=a+bx），用相關(guān)系數(shù)（r）進(jìn)行方程顯著性檢驗(yàn)，最終計(jì)算出各單劑和混合藥劑的EC50和EC90，主要計(jì)算公式如下：

菌落的凈生長量=菌落直徑-菌餅直徑；

相對抑菌率=[(對照組菌落的凈生長量-處理組菌落的凈生長量)/對照組菌落的凈生長量]×100%；

公式中，復(fù)配藥劑之一的苯醚甲環(huán)唑用A 代表，其配比用a 表示；另一藥劑吡唑醚菌酯則用B 代表，其配比則用b 表示；各混劑的實(shí)際觀察值用ob 表示，由各配比計(jì)算得到的理論值則用th 表示。最終評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：SR＞1.5，增效作用；0.5≤SR≤1.5，相加作用；SC＜0.5，拮抗作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 單劑及復(fù)配組合對石榴干腐病菌菌絲抑菌率比較

苯醚甲環(huán)唑、吡唑醚菌酯單劑及其復(fù)配組合對石榴干腐病菌菌絲抑菌率比較結(jié)果見表1、表2、表3。

由表1 可以看出，苯醚甲環(huán)唑和吡唑嘧菌酯在0.06～30.0 mg·L-1濃度處理下，二者對石榴干腐病菌的抑菌率差異顯著（P＜0.05），且其抑菌效果隨著供試藥劑濃度的增加而提升；相同濃度下，苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果均略高于吡唑醚菌酯。

表1 苯醚甲環(huán)唑、吡唑嘧菌酯單劑對石榴干腐病菌的抑菌率

由表2 表明在供試藥劑作用濃度范圍內(nèi)，無論何種混配比例，不同濃度對石榴干腐病菌的抑菌率在P＜0.05水平上均差異顯著，且隨著濃度增大，抑菌率呈上升的趨勢。在同一濃度處理下，不同配比組合間抑菌率也存在一定差異，以2∶1的組合平均抑菌率最大。

表2 苯醚甲環(huán)唑與吡唑嘧菌酯不同混配組合對石榴干腐病菌的抑菌率

由表3 數(shù)據(jù)可以得知，同一濃度水平下，在3.0～30.0 mg·L-1范圍內(nèi)，兩種藥劑的單劑與混劑的最大抑菌率和最小抑菌率之間均存在顯著差異（P＜0.05），混劑無論是最大抑菌率還是最小抑菌率均大于單劑；在0.06 mg·L-1和0.60 mg·L-1濃度水平下，單劑的抑菌率均介于混劑的最大抑菌率和最小抑菌率之間，差異達(dá)到了顯著水平（P＜0.05）。

表3 苯醚甲環(huán)唑、吡唑嘧菌酯單劑及其混劑間同一濃度下的抑菌率比較

2.2 混劑對石榴干腐病菌的聯(lián)合毒力作用

苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯不同配比的混合物對石榴干腐病菌菌絲生長均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用（見表4）。7個(gè)混合配方的增效作用明顯，其SR 值分別為3.68、8.38、6.16、5.31、9.33、4.64、4.32，均遠(yuǎn)高于參考標(biāo)準(zhǔn)值1.5。表明這兩種藥劑復(fù)配對石榴干腐病菌的控制作用更強(qiáng)，其中苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯的質(zhì)量配比為2∶1 時(shí)的增效作用最顯著，其增效系數(shù)高達(dá)9.33，該配比下的EC50觀察值和EC90值均為最低，僅為1.25 mg·L-1和4.03 mg·L-1。此外，兩種供試單劑之間比較，苯醚甲環(huán)唑?qū)υ摼囊种菩Ч^強(qiáng)，其EC50觀察值、EC90值均處于較低水平，分別為10.21 mg·L-1、70.15 mg·L-1。

表4 苯醚甲環(huán)唑與吡唑醚菌酯復(fù)配對石榴干腐病菌菌絲的聯(lián)合毒力

3 小結(jié)與討論

苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯是兩種重要的優(yōu)秀殺菌劑，兩種藥劑的合理復(fù)配既能發(fā)揮較強(qiáng)的增效作用[8-9]，更可延緩病菌對其產(chǎn)生抗藥性，增加其在生產(chǎn)中的使用范圍和時(shí)間。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑和吡唑醚菌酯單劑對石榴干腐病菌菌絲生長均有顯著抑制效果，其EC50分別為10.21 mg·L-1和16.48 mg·L-1；同一濃度下，苯醚甲環(huán)唑的抑菌率相對較強(qiáng)。按質(zhì)量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1 和4∶1 的7 個(gè)混配組合均表現(xiàn)出了明顯的增效作用，其中以2∶1的組合增效作用最強(qiáng)，增效系數(shù)（SR）為9.33，與王麗等[2]的研究基本一致。此外，魯海菊等篩選出甲霜靈·錳鋅、百菌清和撲海因3 種藥劑，均對石榴干腐病菌有較好的抑制效果[10]。除組合比例外，復(fù)配藥劑的實(shí)際應(yīng)用效果還受到制劑的理化穩(wěn)定性、成本、用藥習(xí)慣及應(yīng)用對象品種、生長貯運(yùn)環(huán)境等因素影響，因此還需進(jìn)一步在生產(chǎn)中予以驗(yàn)證。