云南省石榴干腐病病菌生物學(xué)特性研究及其防治藥劑篩選

魯海菊+李河+史淑義

摘要：以石榴干腐病病菌SGF1為供試菌株，采用菌絲生長速率法測定不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度、酸堿度、光照和濕度對其菌絲生長的影響，用血球計數(shù)板計測產(chǎn)孢量，并在室內(nèi)篩選有效抑菌藥劑。結(jié)果表明，該病原菌菌絲生長最佳培養(yǎng)條件為PDA培養(yǎng)基、以可溶性淀粉為碳源、蛋白胨為氮源、28 ℃、pH值為7、全光照、相對濕度60%。BA培養(yǎng)基、28 ℃、pH值8最適合產(chǎn)孢。58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑3種藥劑抑菌效果最好，抑制率達(dá)100%。研究結(jié)果為云南石榴干腐病的防治提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：石榴；干腐?。簧飳W(xué)特性；藥劑篩選

中圖分類號： S436.65 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0099-04

石榴（Punia granatum）是滇南主要水果之一。云南省蒙自市由于北回歸線穿境而過，獨特的氣候條件適宜石榴種植，曾獲“中國石榴之鄉(xiāng)”的美譽(yù)。目前蒙自市石榴栽種面積躍居全國首位，然而隨著栽種面積不斷擴(kuò)大，石榴受到各種真菌病害的危害，嚴(yán)重影響其品質(zhì)和產(chǎn)量。蒙自市石榴干腐病在1979年，戴芳瀾先生的《中國真菌總匯》中早有記載[1]。1999年，周又生等研究蒙自市石榴干腐病發(fā)生規(guī)律及其防治，使蒙自市石榴干腐病得到有效控制[2]。2011年，蒙自市石榴干腐病再次暴發(fā)流行。據(jù)文獻(xiàn)記載蒙自市石榴干腐病由石榴鮮殼孢（Zythia versoniana）引起[1，3]，而陜西省報道的石榴干腐病由石榴墊殼孢菌（Coniella granati）引起[4]。由此可見，不同地區(qū)石榴干腐病病菌種屬分類地位不同，其生物學(xué)特性也會存在差異。周又生等研究蒙自市石榴干腐病病菌生物學(xué)特性，僅限于溫度、濕度和pH值3個方面[2]，未對其碳源、氮源、光照等方面進(jìn)行系統(tǒng)研究，防治化學(xué)藥劑也僅限于百菌清、甲基硫菌靈、代森鋅和波爾多液。鑒于此，筆者對蒙自市石榴干腐病病菌生物學(xué)特性及其抑菌劑做系統(tǒng)研究，以期為有效防控該病提供系統(tǒng)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從云南省蒙自市石榴種植基地采集癥狀典型的石榴干腐病病果，采用常規(guī)組織分離和單孢分離法進(jìn)行分離純化，獲得的菌株（SGF1）于斜面培養(yǎng)基上低溫（4 ℃）保存。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；PSA（馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、蔗糖16 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 L；MA（玉米瓊指培養(yǎng)基）：玉米30 g、瓊脂粉17 g、蒸餾水1 L；WA（燕麥瓊脂培養(yǎng)基）：小麥30 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；CA（胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基）：胡蘿卜200 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；CM（查氏培養(yǎng)基）：硝酸鈉2.00 g、磷酸二氫鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉 20 g、蒸餾水1 L；BA（大豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：大豆200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L；WJA（萬壽菊葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：萬壽菊植株200 g、葡萄糖16 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 L。上述培養(yǎng)基配制好后均121 ℃高壓滅菌25 min。

1.3 試劑

碳源（可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）、氮源（硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素）。0.1% HCl、0.1% NaOH溶液，試劑均為分析純。

1.4 供試殺菌劑

甲霜靈·錳鋅、多菌靈、甲基硫菌靈、百菌清、撲海因、春雷霉素。上述材料均購自農(nóng)貿(mào)市場及試劑公司。

1.5 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

將石榴干腐病病菌在PDA平板培養(yǎng)基中，28 ℃擴(kuò)大培養(yǎng)7 d，在培養(yǎng)基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌塊，同時接種于PDA、PSA、CM、MA、WA、CA、BA和WJA 8種培養(yǎng)基平板中央，設(shè)3次重復(fù)，在25 ℃下恒溫培養(yǎng)7 d，十字交叉法測定菌落直徑，用血球計數(shù)板計數(shù)產(chǎn)孢量[5]。

1.6 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用相等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的碳源（可溶性淀粉、α-乳糖、麥芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）和氮源（硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素）替換蔗糖和硝酸鈉，設(shè)不加碳源、氮源為對照。接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

1.7 不同溫度對菌絲生長的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養(yǎng)[5]，接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

1.8 不同pH值對菌絲生長的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，分別用0.1% HCl及0.1%NaOH溶液將pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10[5]，接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

1.9 光照對菌絲生長的影響

以PDA為供試培養(yǎng)基，接種后分別在光—暗周期為 12 h—12 h、全黑暗和全光照3種光處理下培養(yǎng)[5]，接種及測量方法同“1.5”節(jié)。

1.10 不同濕度對菌絲生長的影響

將病菌接種于PDA培養(yǎng)基平板中央，分別在相對濕度為50%、60%、70%、80%、90%、100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d[5]，測量方法同“1.5”節(jié)。

1.11 藥敏性測定

將58%甲霜靈·錳鋅、50%多菌靈、70%甲基硫菌靈、75%百菌清、50%撲海因、6%春雷霉素6種可濕性粉劑殺菌劑按照使用說明上的濃度配成PDA含藥營養(yǎng)液后倒平板，將石榴干腐病病菌菌塊接種于平板中央，設(shè)不加藥液的PDA平板為對照，培養(yǎng)7 d后，測量菌落直徑，并計算6種藥劑對菌落生長的抑制率[5]，接種及測量方法同上。

抑制率=[（dCK-dB）/dCK]×100%。

式中：dCK表示對照病原菌菌落直徑，dB表示處理病原菌菌落直徑。

1.12 數(shù)據(jù)分析

所有試驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件Duncans多重比較法進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長及其產(chǎn)孢的影響

由表1可知，供試菌株SGF1均能在8種不同培養(yǎng)基上生長，具有較強(qiáng)的營養(yǎng)適應(yīng)性，說明供試菌株對營養(yǎng)條件的要求并不是很嚴(yán)格，但對8種培養(yǎng)基的利用效果有所差異。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，供試菌株在8種不同培養(yǎng)基上的菌落直徑差異極顯著，其中，在PDA培養(yǎng)基上生長最快，在CM培養(yǎng)基上生長最慢。在其余6種培養(yǎng)基上的生長強(qiáng)弱順序為PSA>WJA>WA>CA>BA>MA。另外，在8種培養(yǎng)基中，病菌SGF1產(chǎn)孢量差異極顯著，其中，在BA培養(yǎng)基中產(chǎn)孢最多，在CM上不產(chǎn)孢。因此，最適合該病菌菌絲生長的培養(yǎng)基為PDA，最適合產(chǎn)孢的培養(yǎng)基為BA。

2.2 不同碳源對菌絲生長的影響

由表2可知，除在D-甘露醇和無碳源對照中不能生長之外，供試菌株SGF1在其余6種不同碳源培養(yǎng)基上均能生長，經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，麥芽糖和葡萄糖中菌落直徑差異不顯著，但與其余碳源差異極顯著。α-乳糖、鼠李糖和木糖醇3個處理間的菌落直徑差異極顯著，菌落直徑大小順序為α-乳糖>鼠李糖>木糖醇?？扇苄缘矸壑芯渲睆脚c其余所有供試碳源差異極顯著，且菌落直徑最大。說明可溶性淀粉最有利于其菌絲生長。

2.3 不同氮源對菌絲生長的影響

由表3可知，供試菌株SGF1在8種氮源培養(yǎng)基上均能生長。但其對氮源的利用效果不同。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，蛋白胨中菌落直徑與其余氮源差異極顯著，且菌落直徑最大。其中，硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素中菌落直徑小于對照，表明這4種氮源對其有抑制作用。其余4種氮源對供試菌株生長有促進(jìn)作用，蛋白胨最有利于其菌絲生長。

2.4 不同溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

由表4可知，供試菌株SGF1在10～35 ℃范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，各溫度處理間的菌落直徑差異極顯著。在10～28 ℃范圍內(nèi)，溫度越高菌落直徑越大，28 ℃ 時菌落直徑達(dá)到最大值，30 ℃和35 ℃時菌落直徑小于28 ℃時，40 ℃時菌落直徑為0.00 mm。另外，28 ℃時產(chǎn)孢量與其余溫度差異極顯著，且產(chǎn)孢量最大。25 ℃和30 ℃時差異極顯著，產(chǎn)孢量均小于28 ℃時。其余溫度下產(chǎn)孢量均為0，說明28 ℃是供試菌株菌絲生長及產(chǎn)孢的最佳溫度。

2.5 不同pH值對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響

由表5可知，供試菌株SGF1在pH值3～10范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，pH值為7時與其余處理間菌落直徑差異極顯著，且菌落直徑最大，說明pH值7為菌絲生長最佳酸堿度值。pH值6、pH值8、pH值9，3個處理間菌落直徑差異均不顯著，pH值3和pH值4這2個處理間菌落直徑差異不顯著，其余處理間菌落直徑差異極顯著。pH值8產(chǎn)孢量與其余處理差異極顯著，且產(chǎn)孢量最大。因此，中性偏堿環(huán)境有利于供試菌株菌絲生長及產(chǎn)孢。

2.6 不同光照對菌絲生長的影響

由表6可知，供試菌株SGF1在3種不同光照條件下均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，3種處理間菌落直徑差異極顯著，且全光照菌落直徑最大，光暗交替菌落直徑最小，全黑暗居中。說明全光照最有利于其生長。

2.7 不同濕度對菌絲生長的影響

由表7可知，供試菌株SGF1在相對濕度50%～100%范圍內(nèi)均能生長。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，相對濕度60%與其余處理間菌落直徑差異極顯著，且菌落直徑最大。說明供試菌株最適合的濕度為60%。超出此范圍，病菌的生長受到抑制。

2.8 石榴干腐病菌藥敏性試驗

由表8、圖1可知，6種藥劑對供試菌株SGF1的抑制作用不同。經(jīng)Duncans多重比較發(fā)現(xiàn)，在58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑的培養(yǎng)基中菌落直徑差異不顯著，但與其余處理間差異極顯著，病菌均不能生長，抑制率達(dá)到100%。50%多菌靈可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑和6%春雷霉素3種藥劑之間菌落直徑差異極顯著，抑制率在25%～55%之間。說明抑菌效果最好的藥劑為58%甲霜靈·錳鋅可濕性粉劑、75%百菌清可濕性粉劑和50%撲海因可濕性粉劑。

3 結(jié)論與討論

對石榴干腐病病菌SGF1菌株生物學(xué)特性的研究表明，最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基、最佳碳源為可溶性淀粉、氮源為蛋白胨、最適溫度為28 ℃、最佳酸堿度為pH值7、全光照、最適相對濕度為60%。其對溫度和pH值的要求與周又生等[2]、寧豫婷等[6]、孫德茂[7]的研究結(jié)果一致。濕度的研究結(jié)果與孫德茂的結(jié)論[7]不一致，原因是蒙自市和陜西省2地石榴干腐病病菌種屬分類地位不同。石榴干腐病屬于世界性病害，中國山西[8]、山東[9]、陜西[4]、河南[10]、安徽[11]、貴州[12]、云南[2]等省份均有報道。其中，河南[6，10，13]、貴州[11]、云南[2]的石榴干腐病病菌為石榴鮮殼孢，陜西省報道的石榴干腐病病菌為石榴墊殼孢菌[4]。希臘[14]和韓國[15]的石榴干腐病病菌與中國陜西省的一致。中國其他省份的石榴干腐病病菌尚未見系統(tǒng)鑒定，對其生物學(xué)特性也未見系統(tǒng)研究報道。筆者研究發(fā)現(xiàn)，光照對病菌生長有影響，可溶性淀粉為最佳碳源，蛋白胨為最佳氮源，硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素4種氮源對其病菌有抑制作用，磷酸二氫銨對其病菌生長有促進(jìn)作用。因此，在石榴上施用氮肥可選擇硫酸銨、硝酸銨、甘氨酸和尿素，避免施用磷酸二氫銨。

另外，在室內(nèi)藥劑篩選方面，甲霜靈·錳鋅、百菌清和撲海因3種藥劑對SGF1菌株抑制效果最好，抑制率均達(dá)100%，其他3種藥劑抑菌效果不理想，抑制率均小于60%。這與孫德茂[7]、湯玉等[10]、周又生等[2]、孫國山[16]的研究結(jié)果不盡相同。百菌清防治效果好，這一結(jié)論與周又生等的研究結(jié)論[2]一致，多菌靈防效與左振琴等的研究結(jié)果[13]不一致。說明不同地區(qū)使用的有效藥劑不盡相同。有必要對當(dāng)?shù)匕l(fā)生的石榴干腐病進(jìn)行藥劑篩選。蒙自地區(qū)石榴干腐病可選用甲霜靈·錳鋅、百菌清和撲海因防治。

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