大米蛋白酶解物—大豆苷元復合納米粒子的構(gòu)建

陳秀文 焦 葉 崔 波 鄭湘明 鄒飛雪 程云輝

(1. 長沙理工大學化學與食品工程學院，湖南 長沙 410114；2. 齊魯工業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 濟南 250353；3. 湖南工業(yè)大學城市與環(huán)境學院，湖南 株洲 412007)

大豆苷元又名4’，7-二羥基異黃酮，是一種黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，主要存在于豆科植物中，具有抗炎、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、調(diào)節(jié)腸道菌群和預防骨質(zhì)疏松癥等多種生理活性[1]。但大豆苷元的水溶性和脂溶性較差、生物利用度低，限制了其在人體內(nèi)發(fā)揮作用[2]。構(gòu)建納米輸送體系是改善大豆苷元溶解性和生物利用度的重要手段。制備納米復合物輸送載體的基質(zhì)主要包括碳水化合物基、蛋白基、脂基和復合基4大類，蛋白質(zhì)因兼具營養(yǎng)價值、安全無毒、生物相容和多樣化輸送模式而更具優(yōu)勢[3-4]。Lü等[5]和任曉鳴等[6]分別將乳清分離蛋白和玉米醇溶蛋白用于構(gòu)建蛋白基納米載體，探索其作為大豆苷元和大豆異黃酮輸送體系的可能性，研究結(jié)果表明，蛋白基納米載體具有構(gòu)建大豆苷元等黃酮類化合物輸送體系的潛力，能夠有效改善其溶解性和生物利用度。

圖1 大豆苷元結(jié)構(gòu)式

大米蛋白氨基酸比例均衡，接近WHO/FAO所推薦的營養(yǎng)配比模式，且具有低致敏性，是優(yōu)質(zhì)蛋白來源[7-8]。但大米蛋白中含有約80%的谷蛋白，其分子量較高且由被二硫鍵鍵合的亞基組成，導致大米蛋白的溶解性差，限制了大米蛋白在食品領域的廣泛應用[9]。酶解技術因條件溫和、水解易控、可定位酶切等優(yōu)勢，成為改善大米蛋白溶解性的重要方法[10]。因此，有望通過有限酶解使大米蛋白具備良好的兩親性與自組裝特性，進而通過溶劑極性改變誘導納米復合物形成。

研究擬利用反溶劑法[11]構(gòu)建荷載大豆苷元的大米蛋白酶解物復合納米粒子，考察大米蛋白水解度、大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度與大豆苷元質(zhì)量濃度對復合納米粒子性質(zhì)的影響，以期獲得適用于大豆苷元的蛋白基納米復合物輸送體系，豐富蛋白基納米復合物輸送載體的蛋白種類，為大米蛋白資源高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米蛋白粉：87.6%(濕基)，實驗室采用堿提酸沉法自制；

胰蛋白酶：226 U/mg，丹麥諾維信公司；

大豆苷元：純度大于99%，南京春秋生物工程有限公司；

其他化學試劑：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

pH計：Five Easy Plus TM型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

磁力攪拌器：85-1型，常州國宇儀器制造有限公司；

離心機：TDL-36C型，上海安亭科學儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，江蘇省金壇市金城國勝實驗儀器廠；

紫外可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：YRE2000B型，鞏義市給予華儀器有限公司；

激光粒度儀：Zetasizer nano型，英國Malvern公司。

1.2 方法

1.2.1 大米蛋白酶解物的制備 根據(jù)Xu等[10]的方法制備大米蛋白酶解物，并略作修改。大米蛋白粉分散于去離子水中(1 g/15 mL)，室溫攪拌水化3 h，調(diào)節(jié)pH至8并在50 ℃水浴中保持15 min后，加入胰蛋白酶，酶底比(m酶∶m底物)為1∶100，酶解過程中保持pH 8穩(wěn)定。酶解結(jié)束后，95 ℃水浴15 min使酶鈍化，迅速冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值至中性，3 500 r/min離心10 min取上清液凍干后備用。水解度的測定采用pH-stat法[10]，制備水解度(Degree of hydrolysis，DH)分別為6%，9%，12%的3種大米蛋白酶解物(Rice protein hydrolysates，RPH)，分別標記為RPH-DH6，RPH-DH9，RPH-DH12。

1.2.2 大米蛋白酶解物—大豆苷元復合納米粒子的制備

將RPH-DH6，RPH-DH9，RPH-DH12分別溶于去離子水中，制備成質(zhì)量濃度分別為2.5，5.0，7.5，10.0 mg/mL 的大米蛋白酶解物溶液。取20 mL 大米蛋白酶解物溶液，以1 mL/min的速度加入2 mL 0.75 mg/mL 的大豆苷元乙醇溶液，室溫下攪拌1 h，再在55 ℃下旋蒸10 min除去乙醇并定容，制得復合納米粒子分散液，考察大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度對復合納米粒子性質(zhì)的影響。將5.0 mg/mL的RPH-DH6，RPH-DH9，RPH-DH12溶液分別與0.25，0.50，0.75，1.00 mg/mL的大豆苷元乙醇溶液，按上述方法制備成復合納米粒子，考察大豆苷元質(zhì)量濃度對復合納米粒子性質(zhì)的影響。

1.2.3 包封率和荷載量的測定 參照Tian等[12]的方法進行測定，取復合納米粒子分散液1 mL，加入4 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，3 500 r/min離心10 min，取上層溶液移入10 mL容量瓶，重復提取兩次，合并上層溶液并定容。將樣品于260 nm下測定吸光度，大豆苷元的質(zhì)量濃度按照標準曲線計算，包封率(Encapsulation efficiency，EE)和荷載量(Loading amount，LA)分別按式(1)和式(2) 計算。

(1)

式中：

EE——包封率，%；

m1——加入的大豆苷元含量，mg；

m2——游離的大豆苷元總量，mg。

(2)

式中：

AL——荷載量，mg/g；

m1——加入的大豆苷元含量，mg；

m2——游離的大豆苷元總量，mg；

m3——蛋白質(zhì)總量，g。

1.2.4 粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位的測定 將樣品稀釋適當倍數(shù)后，使用激光粒度儀測定平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位，測定溫度為25 ℃，平衡時間5 min。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 所有試驗均重復3次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差，采用Statistix 9軟件進行單因素方差分析，用Tukey法進行多重比較，使用Origin Pro 2016軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大米蛋白酶解過程中水解度的變化

如圖2所示，酶解0～30 min，隨著酶解反應的進行，蛋白質(zhì)的水解度迅速增加；酶解30 min以后，酶解速率逐漸降低，水解度增速逐漸變慢；酶解120 min以后，水解度變化趨于平緩。試驗獲得的水解度曲線與崔沙沙等[13]用堿性蛋白酶和彭斕蘭等[14]用胰蛋白酶處理大米蛋白得到的水解度曲線變化趨勢相一致。

2.2 大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度對復合納米粒子性質(zhì)的影響

大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度對復合納米粒子平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位的影響如表1所示。同一水解度下，隨著大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度的升高，復合納米粒子的平均粒徑總體上呈先減小后增加的趨勢，與Chen等[15]報道的荷載槲皮素的米糠蛋白基納米粒子的平均粒徑變化相似。多分散系數(shù)接近0.05時表明體系是單分散體系，多分散系數(shù)>0.7時為多分散體系[16]。試驗中復合納米粒子的多分散系數(shù)總體呈遞增趨勢，但均小于0.37，說明體系是均勻分散的。復合納米粒子的Zeta-電位沒有顯著變化，絕對值在18.38～23.69 mV。

大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度對復合納米粒子的包封率和荷載量的影響如圖3所示。隨著大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度的增加，由水解度為6%的RPH-DH6制備的納米粒子的包封率呈先升高后降低的趨勢，由RPH-DH9和RPH-DH12制備的納米粒子的包封率均升高；所有復合納米粒子的荷載量則均逐漸降低。疏水物質(zhì)與蛋白酶解物間以疏水相互作用結(jié)合[17]。酶解使大米蛋白的疏水區(qū)域暴露，可與疏水的大豆苷元結(jié)合。在大豆苷元質(zhì)量濃度固定的條件下，較低的大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度不能提供足夠疏水區(qū)域與之結(jié)合，致使一部分大豆苷元游離在大米蛋白酶解物載體表面，從而導致較低包封率。隨著大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度的提高，更多的大豆苷元與酶解物結(jié)合，因此包封率提高。但是大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度的增加遠大于大米蛋白酶解物包封的大豆苷元的量，因此荷載量并沒有增加。當RPH-DH6質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，復合納米粒子的包封率出現(xiàn)下降，可能是由于高濃度的RPH-DH6之間因疏水相互作用而發(fā)生聚集，不利于大豆苷元的結(jié)合[18]。

表1 大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度對平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位的影響?

大寫字母不同表示不同質(zhì)量濃度下的包封率存在顯著差異(P<0.05)；小寫字母不同表示不同質(zhì)量濃度下的荷載量存在顯著差異(P<0.05)

2.3 大豆苷元質(zhì)量濃度對復合納米粒子性質(zhì)的影響

大豆苷元質(zhì)量濃度對復合納米粒子平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位的影響如表2所示。隨著大豆苷元質(zhì)量濃度由0.25 mg/mL增至1.00 mg/mL，復合納米粒子的平均粒徑逐漸增大，多分散系數(shù)均小于0.35，Zeta-電位絕對值在19.93～26.54 mV。平均粒徑的增大可能是由于大米蛋白酶解物荷載大豆苷元后形成的疏松的結(jié)構(gòu)和較大的疏水核[19]。

大豆苷元質(zhì)量濃度對復合納米粒子的包封率和荷載量的影響如圖4所示。隨著大豆苷元質(zhì)量濃度的增加，荷載量逐漸升高，包封率則先呈升高趨勢后趨于平緩。大豆苷元質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL時的包封率略低于質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL時的，但二者差異不顯著。這是因為大米蛋白酶解物質(zhì)量濃度一定時，逐步提高大豆苷元質(zhì)量濃度，會使其逐漸占據(jù)更多的疏水空間，因此復合納米粒子的包封率和荷載量增加。

表2 大豆苷元質(zhì)量濃度對平均粒徑、多分散系數(shù)和Zeta-電位的影響?

大寫字母不同表示不同質(zhì)量濃度下的包封率存在顯著差異(P<0.05)；小寫字母不同表示不同質(zhì)量濃度下的荷載量存在顯著差異(P<0.05)

當大豆苷元質(zhì)量濃度達到一定程度時，游離的大豆苷元不再能嵌入大米蛋白酶解物基質(zhì)中形成納米顆粒，因此包封率不再增加。Tian等[20]的研究顯示，隨著大豆異黃酮濃度的增加，聚合山羊乳清蛋白—大豆異黃酮復合納米粒子的包封率呈先升高后降低的趨勢。

2.4 大米蛋白水解度對復合納米粒子性質(zhì)的影響

根據(jù)包封率和荷載量的試驗結(jié)果，在大米蛋白酶解物和大豆苷元質(zhì)量濃度分別為7.5 mg/mL和0.75 mg/mL的條件下，比較不同大米蛋白水解度對大米蛋白酶解物—大豆苷元復合納米粒子性質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。由水解度12%的大米蛋白酶解物制備的復合納米粒子的包封率和荷載量分別為60.07%和6.01 mg/g，均顯著高于水解度6%和9%條件下的包封率和荷載量(P<0.05)。當大米蛋白水解度為9%時，復合納米粒子的平均粒徑最小(385.48 nm)，但是多分散系數(shù)高于其他2種。3種復合納米粒子的Zeta-電位無顯著性差異。

表3 大米蛋白水解度對復合納米粒子性質(zhì)的影響?

蛋白質(zhì)的水解度對酶解物的結(jié)構(gòu)、疏水性、動態(tài)界面張力等方面具有重要影響，從而影響復合納米粒子的形態(tài)和特性等[21]。較低的水解度使大米蛋白疏水部位不能充分暴露，從而導致較低的包封率和荷載量，而過高的水解度會使大米蛋白分解成較小分子，也不利于形成復合納米粒子。試驗中，12%水解度的大米蛋白酶解物表現(xiàn)出較好的載體性能，但仍需要繼續(xù)優(yōu)化以提高其性能，并通過進一步的研究來探究其影響機理。

3 結(jié)論

大米蛋白酶解物與大豆苷元通過自組裝相互作用可形成復合納米粒子，證實了以大米蛋白酶解物構(gòu)建納米載體輸送黃酮類化合物的可行性。但將大米蛋白酶解物作為納米輸送載體的研究尚處于探索階段，復合納米粒子的穩(wěn)定性、包封率和荷載量還有待提高。同時，大米蛋白酶解物的結(jié)構(gòu)特性對復合納米粒子的尺寸形貌、結(jié)構(gòu)與生物活性的影響規(guī)律，以及大米蛋白酶解物與黃酮類化合物的相互作用關系也有待進一步探索。