左旋芳樟醇的小鼠體內(nèi)抗氧化及抗皮膚衰老活性研究

陳 耕

(湖南省食品和工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)許可審查中心，湖南 長沙 410000)

衰老伴隨著各種生理機能的減退，表現(xiàn)為行動能力減弱，抵抗力下降，記憶能力和學(xué)習(xí)能力減弱，感官能力減弱，外觀上最容易發(fā)生變化的就是皮膚。皮膚衰老表現(xiàn)為皮膚由光潔變?yōu)轺龅?，出現(xiàn)老年斑，彈性降低，松弛，粗糙等[1-2]。

自由基致膠原蛋白異常氧化、交聯(lián)/斷裂、變性，使皮膚變得干燥、皺紋增多，是皮膚衰老理論中最為廣泛接受的理論之一[1]。根據(jù)這一理論，自由基清除劑、抗氧化劑可有效抗皮膚衰老。許多植物精油具有清除自由基、抗膠原蛋白氧化的活性[3]；而且，天然植物精油主要是脂溶性小分子，與細(xì)胞膜相容性好，能夠快速滲透皮膚深層[4]。此外，植物精油還具有天然環(huán)保、使用方便的優(yōu)點。因此植物精油已被廣泛應(yīng)用于抗皮膚衰老的藥物及護(hù)膚品中。例如：白茶精油、乳香精油是一些美肌精華的主要成分之一；芳樟油、薰衣草油、香檸檬油、玫瑰木油、天竺葵油等植物精油及紅花、川芎、香附以及干姜復(fù)方中藥精油延緩皮膚衰老的功效已被報道[5-7]。

芳樟醇是香精香料工業(yè)中最常用和用量最大的單體香料，普遍存在于芳樟油、薰衣草油、香檸檬油、玫瑰木油等芳香植物精油中。它是一種單萜，香氣佳，是配制香精香料時最受歡迎的原材料之一[8]。芳樟醇毒性低、對皮膚刺激性小，促透效果強，可促進(jìn)其他成分進(jìn)入皮膚[4]。Umezu等[9]研究證明，芳樟醇是薰衣草精油抗焦慮作用的主要藥理活性成分。Mitic-Culafic等[10]研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇能有效清除肝細(xì)胞HepG2和淋巴B細(xì)胞中的自由基。芳樟醇是紅花、川芎、香附、干姜等抗小鼠皮膚衰老復(fù)方中藥精油的重要功效成分[7]。李亞文[11]研究發(fā)現(xiàn)，茉莉、桂花、梔子花、芳樟醇均具有抗衰老活性，其中芳樟醇效果最佳。有學(xué)者[12]發(fā)現(xiàn)，芳樟醇的不同光學(xué)異構(gòu)體的藥理效應(yīng)存在差異，左旋芳樟醇催眠鎮(zhèn)靜作用優(yōu)于消旋體和右旋體芳樟醇。左旋芳樟醇可用于防治頭痛[13]、腹痛、痛經(jīng)[14]、肌肉酸痛以及舒緩疲勞等[15]。以左旋芳樟醇為主要成分薰衣草精油有較強的抗氧化[16]、催眠鎮(zhèn)靜[17]功效；但有關(guān)其在體內(nèi)抗皮膚衰老作用的研究尚未見報道。

研究擬以D-半乳糖致衰老小鼠為模型，涂抹或注射左旋芳樟醇乳液，監(jiān)測小鼠自主活動情況，觀察小鼠背部皮膚皺紋分布，測定小鼠血清和皮膚勻漿的超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及皮膚勻漿羥脯氨酸(Hyp)含量等表征機體氧化、老化情況的指標(biāo)，探討左旋芳樟醇的體內(nèi)抗氧化、抗皮膚衰老活性，以期為左旋芳樟醇的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

左旋芳樟醇：>98%(色譜純)，廈門牡丹香華實業(yè)有限公司；

聚乙二醇-200：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

維生素E(VE)：國藥準(zhǔn)字H35020242，國藥控股星鯊制藥(廈門)有限公司；

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、羥脯氨酸(Hyp)檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；

雌性小鼠：健康瑞士種(ICR品系)，體重30～45 g，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限責(zé)任公司；

自發(fā)活動視頻分析系統(tǒng)：ZH-ZFT型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-1800型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 精油制備 左旋芳樟醇以聚乙二醇-200為溶劑稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.5%，5.0%，7.5%，分別作為低、中、高劑量精油；以聚乙二醇-200為溶劑，將VE稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%。

1.2.2 動物分組、給藥 參照文獻(xiàn)[11]并修改：健康小鼠75只，隨機分為5組，分別為對照組、左旋芳樟醇精油組(低、中、高劑量組)、VE組，每組15只。試驗前用剃毛器剃去小鼠兩肩胛之間皮膚上的毛3 cm×3 cm。每天注射1.5 mg/g的D-半乳糖，連續(xù)注射30 d；對照組每天涂抹聚乙二醇-200，左旋芳樟醇組、VE組每天分別涂抹相應(yīng)的藥物，涂抹量均為1 mL/d，連續(xù)涂抹30 d。

1.2.3 小鼠的自主活動情況 第30天，末次處理1 h后，采用自發(fā)活動視頻分析系統(tǒng)測定各組小鼠的自主活動情況。測定前8 h禁食禁水，將小鼠移入分析裝置中，適應(yīng)3 min，然后記錄小鼠5 min內(nèi)的自主活動情況，通過休息次數(shù)、休息時間以及總路程來表征小鼠的自主活動情況。

1.2.4 血清及皮膚勻漿的制備 第30天，末次處理2 h后，摘眼球取血，脫臼處死，迅速取背部脫毛處皮膚，生理鹽水沖洗后用濾紙吸去水分，-20 ℃保存，用于制作皮膚組織勻漿。

(1) 血清制備：眼球血700 r/min離心10 min，取上層血清備用。

(2) 皮膚勻漿制備：取皮膚組織0.5～1.0 g，冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液、皮下脂肪和結(jié)締組織，濾紙拭干，稱取0.5 g，加入9倍生理鹽水，用眼科小剪刀盡快剪碎，用內(nèi)切式組織勻漿機勻漿(冰浴)，并反復(fù)凍融3次(-20 ℃2 h，常溫1 h)，使細(xì)胞破碎，700 r/min離心15 min，取上清液備用[13]。

1.2.5 SOD活力、MDA含量及Hyp含量測定 參照試劑盒說明書。

1.2.6 皮膚水分測定 切取1 cm2頸部涂抹精油區(qū)域皮膚，精密稱其濕重，80 ℃烘干12 h，稱其干重。

1.2.7 小鼠皮膚拍照 小鼠摘除眼球之前，采用數(shù)碼相機ISO800微距拍攝小鼠背部已脫毛皮膚照片，對比分析皮膚紋理、皺紋深度、黃褐斑分布等。

1.2.8 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間差異分析采用t檢驗法。

2 結(jié)果與分析

2.1 對小鼠自主活動的影響

由表1可知，與對照組相比，精油涂抹組小鼠的休息次數(shù)、休息時間減少，總路程增加。其中精油中、高劑量組、VE組的休息次數(shù)與對照組相比差異顯著(P<0.05)，精油中劑量組總路程與對照組相比差異顯著(P<0.05)。表明左旋芳樟醇和VE均能提高衰老小鼠的活動能力，具有抗衰老活性。

表1 左旋芳樟醇精油對衰老模型小鼠自主活動的影響?

2.2 小鼠血清、皮膚SOD活力、MDA含量

由表2可知，與對照組相比，左旋芳樟醇組、VE組血清、皮膚SOD活力上升、MDA含量下降，且差異顯著(P<0.05)，表明小鼠皮膚涂抹左旋芳樟醇、VE能提高血清、皮膚SOD活力，降低MDA含量，與黃玲玲等[7]的研究結(jié)果一致。VE具有清除皮膚中自由基，降低MDA含量，延緩皮膚衰老的活性，與韓光[18]的研究一致。

MDA是脂質(zhì)氧化的標(biāo)志性產(chǎn)物，廣泛用于表征體內(nèi)氧化狀態(tài)；芳樟醇處理可顯著降低衰老小鼠血清、皮膚中MDA含量，表明芳樟醇在體內(nèi)具有抗氧化活性。精油可通過直接清除H2O2、羥自由基、超氧化物、超氧陰離子等一系列自由基，也可通過提高抗氧化酶的表達(dá)[19-20]，如SOD等發(fā)揮抗氧化活性。試驗表明，芳樟醇可顯著提高衰老小鼠血清、皮膚組織中SOD酶活性。

表2 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠血清、皮膚SOD活力、MDA含量的影響?

2.3 小鼠皮膚水分含量及Hyp含量

羥脯氨酸(Hyp)是膠原蛋白中的一種主要且含量穩(wěn)定的氨基酸，約占13%，可用Hyp含量或其7.46倍代表皮膚膠原含量。膠原含量隨皮膚衰老而下降，因此可通過測定Hyp含量來表征皮膚衰老情況[21]。由表3可知，與對照組相比，精油組、VE組小鼠皮膚中Hyp含量均顯著增加(P<0.05)。黃玲玲等[7]研究發(fā)現(xiàn)，精油可使衰老小鼠皮膚Hyp含量極顯著升高(P<0.01)。皮膚老化過程中，Hyp合成減少與真皮乳頭層的微血管發(fā)生萎縮，血流量減少有關(guān)[22]；芳樟醇精油改善皮膚的微循環(huán)[23]，可促進(jìn)皮膚組織合成Hyp[24]，且Hyp合成減少還與真皮中羥化酶失活有關(guān)[25-26]，自由基及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的攻擊是羥化酶失活的重要原因。試驗表明，左旋芳樟醇在體內(nèi)抗氧化活性較強，可清除MDA，有利于保護(hù)羥化酶合成Hyp。

由表3可知，左旋芳樟醇可顯著提高衰老小鼠皮膚的水分含量(P<0.05)。皮膚中親水性蛋白質(zhì)含量及蛋白質(zhì)氧化狀態(tài)是決定皮膚水分含量及保水性的重要因素。皮膚中Hyp親水性很強，其合成量減少，皮膚水合能力下降；蛋白質(zhì)在自由基及脂質(zhì)氧化產(chǎn)物(如MDA)作用下，親水基團(如半胱氨酸的巰基，賴氨酸、精氨酸的氨基等)轉(zhuǎn)化成疏水性羰基或發(fā)生交聯(lián)，皮膚水合能力下降[27]。芳樟醇精油在體內(nèi)具有顯著抗氧化活性及顯著提高皮膚Hyp含量，因此其皮膚水分含量也顯著提高。

2.4 左旋芳樟醇精油對小鼠皮膚表觀的影響

由圖1可知，對照組、精油低劑量組皮膚粗糙有鱗屑，皺紋粗亂；精油中、高劑量組及VE組小鼠皮膚更加光滑、飽滿，未見明顯皺紋，老化情況明顯改善。真皮膠原的流失，角質(zhì)層變薄，皮膚組織水分減少，細(xì)胞皺縮、組織萎縮等是皮膚皺紋產(chǎn)生的主要原因[28]；芳樟醇精油可顯著提高皮膚水分和Hyp含量，因此能明顯抑制皺紋的產(chǎn)生。

表3 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠皮膚水分及Hyp含量的影響?

圖1 左旋芳樟醇對衰老模型小鼠皮膚皺紋的影響

在大鼠模型紫外線UV-B(280～320 nm)急性損傷試驗中，芳樟醇可顯著緩解皮膚增生、水腫形成、脂質(zhì)過氧化，顯著抑制環(huán)氧酶-2(COX-2)、鳥氨酸脫羧酶活性；在UV-B長期損傷試驗中，芳樟醇可顯著抑制NF-κB、TNF-α、IL-6、VEGF、TGF-β1、Bcl-2等增生細(xì)胞因子表達(dá)，降低腫瘤發(fā)生率[24]。在小鼠模型中，芳樟醇可有效抑制酒精致急性胃潰瘍[13]；在t-BOOH致微生物突變試驗中，芳樟醇可通過清除自由基，有效保護(hù)DNA[10]；在肺細(xì)胞中，芳樟醇顯著降低MDA含量，激活Nrf2 信號通路，顯著增加抗氧化酶的表達(dá)，并下調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達(dá)[20,29-30]；在神經(jīng)細(xì)胞中具有抗氧化、抗炎活性，從而對神經(jīng)細(xì)胞具有顯著保護(hù)作用，緩解大鼠模型帕金森氏癥[31]。

3 結(jié)論

試驗表明，芳樟醇精油可顯著提高衰老小鼠自主活動能力，顯著提高小鼠皮膚中超氧化物歧化酶活力(P<0.05)，顯著降低小鼠皮膚中丙二醛含量(P<0.05)，以及顯著提高小鼠皮膚中的水分、羥脯氨酸含量(P<0.05)，使皮膚更加光滑、飽滿。因此左旋芳樟醇在體內(nèi)具有較強抗氧化及抗皮膚衰老活性，抑制脂質(zhì)氧化，促進(jìn)羥脯氨酸合成可能是左旋芳樟醇抗皮膚衰老的機制之一，但其抗皮膚老化詳細(xì)機制尚需進(jìn)一步研究。