藻類揮發(fā)性物質(zhì)及其提取方法研究進(jìn)展

劉璐璐 王寶貝

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2. 泉州師范學(xué)院海洋與食品學(xué)院，福建 泉州 362000；3. 福建省海洋藻類活性物質(zhì)制備與功能開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000；4. 近海資源生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 泉州 362000)

藻類與人類的生活密切相關(guān)，因富含不飽和脂肪酸、多糖、多肽、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在食品和醫(yī)藥中的應(yīng)用歷史久遠(yuǎn)[1]。盡管藻類的營(yíng)養(yǎng)豐富，但不同的藻類具有各自獨(dú)特的風(fēng)味，有些藻類帶有宜人的青草香味和花香，如Staurastrtmlsp和Rapbidocelisinclinata，有些則帶有刺鼻的腥臭味，如Uroglenaamericana及Synedraacus等[2]。風(fēng)味是影響藻類在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域中應(yīng)用的主要因素之一，如何提升藻類中宜人的氣味，消除讓人難以接受的腥臭味，是開發(fā)藻類食品需要考慮的重要因素，而風(fēng)味的好壞主要由藻中揮發(fā)性物質(zhì)成分和含量決定。揮發(fā)性物質(zhì)(VOCs)是具有低至中等親水性，可以穿過(guò)細(xì)胞膜自由釋放到大氣中的一類小分子化合物[3]。它是決定藻類產(chǎn)品風(fēng)味優(yōu)劣的主要因素，對(duì)藻類在食品行業(yè)中的應(yīng)用推廣都有重要的意義[4]。此外，藻類的揮發(fā)性物質(zhì)還能實(shí)時(shí)反映微藻生長(zhǎng)狀態(tài)[5]，在防御捕食[6]和藻類的有性繁殖[5]等方面有著重要作用。

文章擬闡述藻類中揮發(fā)性物質(zhì)的種類、風(fēng)味及形成途徑，并對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)的不同提取方法進(jìn)行分析比較，以期對(duì)今后藻類中揮發(fā)性物質(zhì)的研究提供參考。

1 藻中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及其風(fēng)味特征

藻類所含的揮發(fā)性化合物種類繁多，主要包括醛、烴、醇、酮、硫化物、羧酸、鹵化物、酚、酯、萜烯及呋喃等。不同藻類中含有的揮發(fā)性化合物存在一定的差異，如褐藻Punctariatenuissima的揮發(fā)性物質(zhì)主要為游離脂肪酸，其次為烴類[7]；綠藻主要為醛類、羧酸類和酯類[8]；紅藻Pterocladiellacapillacea，醛類釋放量最多(71.9%)，其次為烴類(10.6%)，而Osmundariaobtusiloba釋放量最多的揮發(fā)性物質(zhì)為烴類(65.4%)，其次為醛類(30.0%)[3]。

1.1 醛

醛類為分子中含有醛基(—CHO)的化合物的統(tǒng)稱，根據(jù)醛基的數(shù)量可以分為一元醛與多元醛。藻類中的揮發(fā)性醛主要有戊醛、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、β-環(huán)檸檬醛和藏花醛等(表1)。醛類閾值普遍較低，因此對(duì)藻類風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[4]。與海水藻相比，淡水藻的揮發(fā)性醛類含量較低，種類也比較少(表1)。Van Durme等[4]在對(duì)藻類揮發(fā)性物質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)，醛類在海水藻Botryococcusbraunii、Rhodomonas和Tetraselmisspecies中含量最高，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的95.67%，87.00%，91.47%，而醛類在淡水小球藻中僅占總揮發(fā)性物質(zhì)的16.22%。Abdel-Baky等[9]發(fā)現(xiàn)醛類在小球藻中僅占3.24%。海藻中的醛種類一般在20種左右[10]，而淡水藻中一般只有10種左右[4]。Lopez-Perez等[10]發(fā)現(xiàn)海水藻H.elongata和P.palmata中分別有22～28種醛，而淡水的P.palmata[11]和U.pinnatifida[12]則僅有7～13種醛。

不同的醛所呈現(xiàn)出的風(fēng)味也有一定的差異，如2,4-七烯醛等C17不飽和醛，閾值較低，呈青草香，而有些不飽和醛則散發(fā)出蔬菜和魚腥味，直鏈與支鏈醛類不僅會(huì)呈青草香，還會(huì)有草木甚至辛辣的味道[1]。己醛則呈類似綠色植物的風(fēng)味，己醛、庚醛、辛醛和壬醛由脂質(zhì)氫過(guò)氧化物和過(guò)氧自由基的降解產(chǎn)生[13-14]。Yamamoto等[15]發(fā)現(xiàn)苯甲醛是日本Shizuoka地區(qū)Monostromanitidum中的重要揮發(fā)性物質(zhì)，為水果和花卉提供甜杏仁味。

1.2 酮

揮發(fā)性酮的閾值較低，是影響藻類風(fēng)味的重要物質(zhì)[4]。常見揮發(fā)性酮的種類及風(fēng)味見表2。揮發(fā)性酮主要表現(xiàn)為果味和奶油味。比如：β-紫羅蘭酮具有水果味且氣味較濃[18]，2,3-丁二酮具有奶油味和奶酪味，3-辛酮呈草藥味和堅(jiān)果味，6-甲基-5-庚烯-2-酮呈甜味和水果味[13]，2-庚酮為甜味、水果味和肉桂味，3-辛烯-2-酮具有果香和檸檬香，2,3-辛二酮具有奶油香和油脂香[19]。

1.3 醇

藻類中的揮發(fā)性醇主要有1-戊醇、1-己醇、3-甲基丁醇、1-戊烯-3-醇等(表3)，其含量豐富。Ferraces-Casais等[20]發(fā)現(xiàn)海帶和裙帶菜中的揮發(fā)性醇分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的29%和25%。大多數(shù)直鏈醇(C4～C9醇)呈類似水果香味，比如：2,3-丁二醇為水果味和洋蔥味，(E)-2-戊烯-1-醇表現(xiàn)為蘑菇味、甜味以及類似紅酒的味道[21]，Phormidiumautumnale中的3-甲基-1-丁醇則具有威士忌、麥芽和燒焦的味道[22]。1-辛烯-3-醇在藻中有蘑菇或金屬味[23]，而當(dāng)其與甲氧基同時(shí)存在時(shí)則表現(xiàn)為土豆味[24]。

1.4 烴

烷烴和烯烴等是藻類揮發(fā)性物質(zhì)的主要成分，其含量可達(dá)總揮發(fā)性物質(zhì)的50%以上。在裙帶菜Undariapinnatida和紅藻O.obtusiloba中，烴在總揮發(fā)性成分中的占比分別達(dá)到49.71%[10]和65.40%[9]。烴類在綠藻揮發(fā)性物質(zhì)中的比例更高，如在日本不同地區(qū)養(yǎng)殖的綠藻，其烴類的占比均在80%以上[15]。藻中揮發(fā)性烴主要為C8～C18，且多以飽和烷烴含量較高[25-26]，C20以上的長(zhǎng)鏈烷烴只在少數(shù)藻類中發(fā)現(xiàn)[16]。Milovanovic等[27]發(fā)現(xiàn)螺旋藻中揮發(fā)性物質(zhì)含量最多的是十五烷烴、十六烷烴和十七烷烴。其中，十七烷烴在兩種螺旋藻中占揮發(fā)性物質(zhì)的比例分別為82.21%和73.12%。

表1 藻類中的常見醛類揮發(fā)性物質(zhì)

表2 藻中常見酮類揮發(fā)性物質(zhì)

表3 藻中常見醇類揮發(fā)性物質(zhì)

雖然揮發(fā)性烴在藻類中的含量較高，但由于其閾值較高，所以其對(duì)藻類的氣味影響較小[19]。其中，龍須菜中的甲苯呈類似苯的味道，1,2,4-三甲基苯具有塑料味，1,2,3-三甲基苯具有金屬味[21]。

1.5 酸

藻類中酸的種類豐富且含量也相對(duì)較高，如在Punctariatenuissima、Laminariaochotensis和Laminariaangustata中，酸占總揮發(fā)性物質(zhì)的96.80%[7]，43.86%，57.95%[28]。藻類中的揮發(fā)性酸主要有乙酸、油酸、肉豆蔻酸和棕櫚酸等(表4)。酸可以提高食物的特征風(fēng)味，但隨著酸鏈長(zhǎng)度的增加，氣味強(qiáng)度降低。碳原子數(shù)<6的簡(jiǎn)單酸具有較高的氣味閾值，而碳原子數(shù)≥12的長(zhǎng)鏈酸則無(wú)氣味，且不飽和酸通常比飽和酸有更強(qiáng)烈的氣味[29]。比如丁酸具有酸臭味和甜味[22]、肉豆蔻酸具有強(qiáng)烈的奶香味、棕櫚酸具有酸奶香味，油酸和硬脂酸具有油脂味[19]，戊酸則具有酸味、奶酪味和牛肉味[23]。

表4 藻中常見酸類揮發(fā)性物質(zhì)

1.6 酯

藻類中的酯類主要有棕櫚酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻酸異丙酯等(表5)。揮發(fā)性酯具有較強(qiáng)的氣味，一般不飽和酯的閾值比飽和酯的閾值低[29]。揮發(fā)性酯多呈水果味、甜味和花香[22]。在Ulvaprolifera、Ulvalinza以及M.nitidumde中，肉豆蔻酸甲酯(十四酸甲酯)具有蜂蜜味和花香[15]；小球藻等微藻中的辛酸甲酯為新鮮水果味[23]；Ulvapertusa中的亞麻酸甲酯為甜瓜味[15]。棕櫚酸甲酯是石莼中的主要酯類，為海藻提供甜味和水果味[8]。

表5 藻中常見酯類揮發(fā)性物質(zhì)

1.7 其他揮發(fā)性物質(zhì)

除了以上介紹的揮發(fā)性物質(zhì)外，藻類中的揮發(fā)性物質(zhì)還含有鹵代烴、硫化物和萜烯等。這些揮發(fā)性物質(zhì)在藻類中含量較少，種類簡(jiǎn)單，但對(duì)藻類風(fēng)味也有一定的貢獻(xiàn)。藻類中常見的鹵代烴包括二氯甲烷、三氯甲烷、六氯乙烷、碘乙烷、三溴甲烷、氯苯等，其形成與藻類的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)[30]。硫化物在藻類中種類較少，但其閾值較低，因此對(duì)風(fēng)味具有一定影響[21]。藻類中的揮發(fā)性硫化物主要有二甲基硫醚、二甲基三硫化物、4-甲基苯磺酰胺和甲苯磺丁酰胺等。二甲基硫醚具有硫磺、卷心菜和西紅柿的味道[31]。二甲基三硫化物在濃度較高時(shí)呈肉味和熟洋蔥味[4]，也有學(xué)者[21, 31]認(rèn)為二甲基三硫化物還有蒜味、腐爛的味道、金屬味、綠色蔬菜的味道。

萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)是許多陸生植物中重要的揮發(fā)性化合物，在藻類中濃度較低[7]。藻類中萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)主要有植物醇、六氫法呢基丙酮和姥鮫烷。小球藻中的植物醇源于葉綠素的降解，Lafarge等[32]研究發(fā)現(xiàn)小球藻中植物醇質(zhì)量濃度高達(dá)4 073 μg/L，但味道很淡基本無(wú)法嗅到。

2 藻中主要揮發(fā)性物質(zhì)的形成

2.1 揮發(fā)性醛的形成

藻類中的短鏈和中鏈醛主要源自于脂肪酸[8]。一般認(rèn)為植物中的短鏈醛(C6，C9)主要來(lái)自C18不飽和脂肪酸的氧化降解，而海洋魚類中的短鏈醛則主要來(lái)自長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸(C20，C22)，藻類同時(shí)存在以上兩種短鏈醛的形成途徑。中鏈醛(C10)一般由長(zhǎng)鏈脂肪酸(C20)斷裂形成的，而長(zhǎng)鏈醛(C15，C17)則是在脂肪酸生成2-氫過(guò)氧酸的過(guò)程中形成的[6]，其中，C17不飽和醛主要通過(guò)脂氧化酶作用于不飽和(C18)脂肪酸產(chǎn)生[1]。

脂質(zhì)氧化產(chǎn)物還包含一些直鏈烷醛、甲基烷醛、2-烯醛和二烯烷醛等，如(E,Z)-2,6-壬二烯醛來(lái)自于n-3不飽和脂肪酸的降解，在食物中散發(fā)黃瓜味；2,4-癸二烯醛源于n-6脂肪酸的自氧化，也可以進(jìn)一步氧化為己醛和2-辛烯醛。而苯甲醛和甲基丁醛來(lái)自于氨基酸的Strecker降解反應(yīng)。除了脂肪酸與氨基酸，β-胡蘿卜素也是醛類的來(lái)源之一，如β-環(huán)檸檬醛就是由β-胡蘿卜素的C7和C8之間的雙鍵被酶裂解產(chǎn)生[22]。

2.2 揮發(fā)性酮的形成

藻類中的揮發(fā)性酮主要來(lái)自不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素和氨基酸的氧化、降解[33-34]。Le Pape等[11]發(fā)現(xiàn)PalmariaPalmatae中的3-辛酮來(lái)自脂肪酸的氧化。6-甲基-5-庚烯-2-酮、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮主要來(lái)自番茄紅素、八氫番茄紅素等類胡蘿卜素的氧化降解[24]。β-胡蘿卜素在C9和C10之間的雙鍵裂解可以得到β-紫羅蘭酮[22]。此外，海藻曬干過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致β-胡蘿卜素?zé)峤到猱a(chǎn)生2,2,6-三甲基環(huán)己酮、2,6,6-三甲基-2-羥基環(huán)己酮、5,6-環(huán)氧環(huán)離子酮和二氫內(nèi)酯[15]。然而，當(dāng)前對(duì)揮發(fā)性酮在藻類中的形成研究還不夠全面，有些酮的來(lái)源仍存在爭(zhēng)議。Yaylayan等[35]認(rèn)為具有餅干風(fēng)味的2,3-戊二酮是由L-丙氨酸的2個(gè)碳原子和葡萄糖的3個(gè)碳原子通過(guò)美拉德反應(yīng)而得的。然而，Le Pape等[11]在新鮮的紅藻P.palmata中檢測(cè)到了2,3-戊二酮，因此他認(rèn)為2,3-戊二酮是鮮藻的代謝產(chǎn)物。

2.3 揮發(fā)性醇的形成

藻類中的醇主要來(lái)自不飽和脂肪酸的氧化[22]。比如，1-辛烯-3-醇來(lái)自n-6多不飽和脂肪酸的降解，1-辛醇來(lái)自n-9多不飽和脂肪酸氧化分解[24]，(E)-2-戊烯-1-醇來(lái)則由n-3多不飽和脂肪酸氧化而得[23-24]。亞油酸和亞麻酸在脂肪氧化酶和過(guò)氧化氫裂解酶的還可以裂解生成六碳醇[36]133-134。此外，部分醇來(lái)自葡萄糖的分解，如3-甲基-1-丁醇與異丁醇[37]。葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑得到丙酮酸，丙酮酸通過(guò)2-酮酸途徑得到2-酮異戊酸酯，2-酮異戊酸酯經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)分別得到3-甲基-1-丁醇和異丁醇(圖1)。

2.4 揮發(fā)性烴的形成

揮發(fā)性烴在藻類中種類較多，其來(lái)源也較廣。烴類可以通過(guò)烷基自由基的自氧化過(guò)程或類胡蘿卜素分解過(guò)程形成，如十七烷烴來(lái)自β-胡蘿卜素的熱降解[34]、辛烷和十一烷主要來(lái)自不飽和脂肪酸[38]、1,3-(E)-5-(Z)-辛三烯來(lái)自于n-3脂肪酸的降解[11]。辛烷和癸烷在海洋褐藻中起到性激素的作用，可以由C20不飽和脂肪酸通過(guò)9-氫過(guò)氧化物、酶解和重排形成[39]。一些短鏈烴如乙烷、乙烯和戊烷是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物[39]。

圖1 異丁醇和3-甲基-1-丁醇合成途徑[5]

2.5 其他揮發(fā)性物質(zhì)的形成

揮發(fā)性鹵代烴的來(lái)源之一是單鹵代和二鹵代脂肪酸的水解[40]；也有研究[41]表明揮發(fā)性鹵代烴的形成可能是由于清除藻類細(xì)胞中的強(qiáng)氧化劑，如次氯酸鹽和過(guò)氧化氫。

二甲基硫醚是大部分海洋藻類的特征風(fēng)味物質(zhì)[4, 23]，有學(xué)者[5]認(rèn)為二甲基硫醚是二甲基巰基丙酸在二甲基巰基丙酸裂解酶的作用下的產(chǎn)物，而二甲基巰基丙酸是甲硫氨酸在甲硫氨酸脫羧酶的作用下，經(jīng)過(guò)脫羧、氧化及甲基化得到(圖2)。有學(xué)者[42]稱甲硫醇是二甲基硫醚和二甲基三硫化物的前體物質(zhì)，也有文獻(xiàn)[36]138報(bào)道甲硫醇是甲硫氨酸降解的產(chǎn)物，可以進(jìn)一步被氧化成硫酯或硫醚等硫化物。

植物萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)通常有兩種合成途徑：甲羥戊酸途徑(MVA)和質(zhì)體非甲羥戊酸途徑(DXP)，其中類異戊二烯合成的基礎(chǔ)物質(zhì)為異戊烯二磷酸(IPP)和異戊烯丙基二磷酸(DMAPP)[43-45](圖3)。MVA途徑是合成倍半萜、甾醇和多萜的主要途徑，而DXP途徑是合成單萜的主要途徑。

圖2 二甲基硫醚合成[5]

DXS. 1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 DXR. 異構(gòu)酶 CMS. 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶 CMK. 4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶 MCS. 2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環(huán)二磷酸合酶 HDS. 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶 HDR. 1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶 IDI. 異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶 ISPS. 異戊二烯合成酶 GPPS. 香葉基二磷酸合成酶GPP. 香葉基二磷酸 ATOT. 乙酰乙酰輔酶A硫解酶 HMGS. 羥甲基戊二酰輔酶A合酶 HMGR. 羥甲基戊二酰輔酶A還原酶MVK. 甲羥戊酸激酶 PMK. 磷酸甲戊酸激酶 MDD. 甲羥戊酸焦磷酸脫氫酶 FPP. 法尼酰二磷酸 GGPP. 香葉基香葉基焦磷酸

3 藻類揮發(fā)性物質(zhì)的提取方法

揮發(fā)性物質(zhì)的分離鑒定一般采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)。其提取方法主要包括同時(shí)蒸餾萃取法、液—液萃取法、動(dòng)態(tài)頂空提取法和固相微萃取技術(shù)(或頂空固相微萃取技術(shù))[46]。不同提取方法對(duì)同一種藻提取得到的揮發(fā)性物質(zhì)存在一定的差異，如Lafarge等[32]分別使用固相微萃取法和超聲輔助液—液萃取法對(duì)小球藻中的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)固相微萃取法得到的揮發(fā)性物質(zhì)中醛類含量最高，而超聲輔助液—液萃取法則是以萜烯類為主，兩種提取方法所得揮發(fā)性物質(zhì)僅有一種共同物質(zhì)β-紫羅蘭酮。不同的提取方法有各自的特點(diǎn)，也各有優(yōu)缺點(diǎn)，幾種常見的揮發(fā)性物質(zhì)提取方法的特點(diǎn)及優(yōu)缺點(diǎn)見表6。

3.1 同時(shí)蒸餾萃取法

同時(shí)蒸餾萃取法(Simultaneous distillation extraction，SDE)通過(guò)對(duì)樣品的反復(fù)蒸餾和萃取，從而使樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)得到濃縮，再進(jìn)行氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用進(jìn)行分離鑒定。SDE法適用于提取高沸點(diǎn)、低揮發(fā)性的物質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)在于能對(duì)樣品中低濃度的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行濃縮[50]。采用SDE法需要的樣品量較多，王麗娟等[51]采用同時(shí)蒸餾萃取法對(duì)杜氏鹽藻進(jìn)行揮發(fā)性成分分析，需杜氏鹽藻粉10 g；而宋紹華等[52]在對(duì)滸苔進(jìn)行揮發(fā)性成分進(jìn)行分析時(shí)，采用固相微萃取法進(jìn)行提取，則只需滸苔0.08 g。

Sun等[18]利用同時(shí)蒸餾萃取法(SDE)和靜態(tài)真空同時(shí)蒸餾萃取法(V-SDE)分別對(duì)100 g新鮮藻進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)成分研究。其中同時(shí)蒸餾萃取法是將100 g綠藻切成5 cm的小段，放入5 L的圓底燒瓶中，加入2 L雙蒸餾水，再加入1 mL 2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)(即蒸餾水中10 μg/mL)，加入50 mL重蒸餾乙醚萃取，萃取時(shí)間為3 h。利用氮?dú)?純度99.99%)使提取物濃縮至10 mL，用無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行干燥，再進(jìn)一步濃縮至0.2 mL，-80 ℃保存?zhèn)溆谩６o態(tài)真空同時(shí)蒸餾萃取法是將100 g新鮮藻和600 mL重蒸餾水混合在2.5 mL的燒瓶中，同樣加入1 mL 2,4,6-三甲基吡啶作為內(nèi)標(biāo)，加入3 mL異辛烷在真空下萃取3 h,裝置在加熱前利用真空泵進(jìn)行抽真空。結(jié)果表明SDE檢測(cè)到的醛類比V-SDE的多15種，尤其長(zhǎng)鏈醛，只有SDE法檢測(cè)到，而V-SDE法檢測(cè)到的酮類多于SDE法。SDE適用于高沸點(diǎn)揮發(fā)性物質(zhì)的提取，在此過(guò)程中可能會(huì)造成一些物質(zhì)的熱降解，而V-SDE法彌補(bǔ)了這一缺陷。

3.2 液—液萃取法

液—液萃取法(liquid-liquid extraction，LLE)常以超聲輔助，樣品與萃取劑、內(nèi)標(biāo)物混合，超聲后將懸浮液離心，上清液進(jìn)行脫水、過(guò)濾、濃縮后，采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)濃縮后的萃取物進(jìn)行分離鑒定。Lafarge等[32]利用超聲輔助LLE法對(duì)小球藻中的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析研究，將5 g藻樣、25 mL萃取劑(摩爾比為59.55/40.45的共沸物“丙烷-2-酮/環(huán)戊烷”)和100 μL內(nèi)標(biāo)物強(qiáng)烈攪拌5 min，再將燒瓶置于超聲10 min，超聲后立即取出懸浮液離心，離心后取上清液，并用硫酸鈉脫水，提取物過(guò)濾后濃縮，利用GC-MS對(duì)濃縮液進(jìn)行分析。研究發(fā)現(xiàn)LLE法適用于沸點(diǎn)較高且閾值較高的揮發(fā)性物質(zhì)。若溶劑選擇恰當(dāng)，LLE法只需一步就可以將目的揮發(fā)性物質(zhì)全部提取[32]。然而，LLE法需要大量的萃取溶劑，且這些溶劑多數(shù)有毒，處理比較困難[50]。LLE法相比于同時(shí)蒸餾萃取和固相微萃取法，測(cè)定所需樣品中揮發(fā)性物質(zhì)濃度較高[53]。

3.3 動(dòng)態(tài)頂空提取法

動(dòng)態(tài)頂空提取法(Dynamic headspace extraction，DHE)是一種氣體取樣方法，通過(guò)惰性氣體(通常為氦氣)的連續(xù)流動(dòng)，使揮發(fā)性物質(zhì)被吸附在吸附劑上，載氣從容器中循環(huán)或從容器中吹出，從樣品中分離出揮發(fā)性成分，在進(jìn)行GC-MS分析之前需要進(jìn)行熱脫附[46]。這種方法不需要對(duì)初始產(chǎn)物進(jìn)行加熱，適用于沸點(diǎn)較低的揮發(fā)性物質(zhì)[11]。Takahashi等[28]使用動(dòng)態(tài)頂空提取法對(duì)海帶中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行收集，然后采用SDE法進(jìn)行分離，再使用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，得到3種海帶的揮發(fā)性物質(zhì)分別為47，49，41種。

表6 幾種常見揮發(fā)性物質(zhì)提取方法

Lepape等[11]采用DHE法提取紅藻P.palmata的揮發(fā)性物質(zhì)，先對(duì)藻進(jìn)行破碎，使用吹掃捕集器，在60 mL/min 下用氦氣吹掃樣品的頂部空間，并在25 ℃下掃入多孔吸附劑聚合物，揮發(fā)性化合物在-40 ℃下使用二氧化碳進(jìn)行冷聚焦，并通過(guò)在195 ℃下加熱捕集器進(jìn)行熱解吸，最后利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，共得到揮發(fā)性物質(zhì)23種，包括醛類7種，鹵化物7種，烴類4種，醇類3種和酮類2種。

3.4 固相微萃取法

固相微萃取法(Solid-phase microextraction，SPME)的概念最早由Belardi和Pawliszyn在1982年率先提出，隨后由Pawliszyn及其同事繼續(xù)發(fā)展了這一概念[50]。SPME技術(shù)利用“相似相溶” 的原理，依賴裝置中的纖維萃取頭對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行吸附，再將萃取頭放置于氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行高溫解吸，利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)所解析的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分離鑒定。SPME適用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性的物質(zhì)[11]。Lafarge等[32]研究發(fā)現(xiàn)，SPME更適合于沸點(diǎn)<160 ℃的揮發(fā)性物質(zhì)。SPME具有操作簡(jiǎn)便快速、樣品需求量少、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點(diǎn)[49]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者采用此法對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究。如Hosoglu等[23]采用固相微萃取法對(duì)3種海水微藻和2種淡水微藻進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)和氣味的研究，鑒定了21種芳香活性物質(zhì)，另外有6種無(wú)法鑒定。

張敏等[55]利用頂空固相微萃取法分別對(duì)鼠尾藻、滸苔、龍須菜、紅毛菜和條斑紫菜進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)的提取，再利用氣相色譜—質(zhì)譜對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。頂空固相微萃取法只需0.3 g風(fēng)干粉碎的藻樣，將其放入15 mL固相微萃取頂空瓶中進(jìn)行水浴，水浴后將老化后的萃取頭插入頂空瓶中萃取0.5 h，靜置10 min后立刻將萃取頭放置在進(jìn)樣口解吸，利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析。采用此法鑒定出鼠尾藻中揮發(fā)性物質(zhì)共29種，滸苔中22種，龍須菜中29種，紅毛菜中32種，條斑菜中28種，其中烴類在5種藻中種類最多。固相微萃取法在提取揮發(fā)性物質(zhì)過(guò)程中所需樣品量少，用時(shí)短，并且無(wú)有機(jī)溶劑參與，因此提高了分析速率，保障了環(huán)境安全。

當(dāng)前，藻類揮發(fā)性物質(zhì)的提取方法還是基于以上幾種食品常用的提取方法，要更好地了解和分析藻類揮發(fā)性物質(zhì)的組成特點(diǎn)，除了清楚各種方法的優(yōu)缺點(diǎn)外，還應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康某浞挚紤]傳統(tǒng)提取方法是否能夠?qū)⒃孱愄赜械膿]發(fā)性物質(zhì)提取出來(lái)。比如，微藻的尺寸小且細(xì)胞壁堅(jiān)硬，使用傳統(tǒng)方法提取前，先進(jìn)行破壁處理，有利于使揮發(fā)性物質(zhì)提取完全。此外，溶劑的選擇也是至關(guān)重要的。

4 展望

藻類獨(dú)特的風(fēng)味主要是由其揮發(fā)性物質(zhì)成分決定。合理設(shè)計(jì)脫腥方案可以將藻類中的腥臭味物質(zhì)脫除，從而使藻類能夠更好地應(yīng)用于產(chǎn)品中。此外，了解藻類中的揮發(fā)性物質(zhì)特別是風(fēng)味物質(zhì)的形成途徑，將有利于今后采用培養(yǎng)條件優(yōu)化或基因工程等方法提高藻類目的風(fēng)味物質(zhì)的含量。

當(dāng)前關(guān)于絕大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)的形成機(jī)制還不是很清楚。若能對(duì)藻類揮發(fā)性物質(zhì)的形成機(jī)制有更深入的了解，將為今后從源頭調(diào)節(jié)藻類揮發(fā)性物質(zhì)的形成提供理論依據(jù)。藻類揮發(fā)性物質(zhì)的研究，提取方法的選擇也非常重要。開發(fā)一種快捷、簡(jiǎn)便、靈敏，且能夠更全面地將藻類中揮發(fā)性物質(zhì)提取出來(lái)的方法是促進(jìn)揮發(fā)性物質(zhì)研究的關(guān)鍵。