抑咽側體素基因在大猿葉蟲生殖滯育準備中的功能分析

田 忠,劉 茜,朱 莉,劉 文,朱 芬,王小平

(華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院,昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點實驗室,武漢 430070)

滯育是昆蟲借以度過不良環(huán)境、維持種群延續(xù)的一種生存對策，主要由遺傳因子和環(huán)境因子共同調控(Danks,1987)。依據(jù)昆蟲進入滯育的生活史階段可分為胚胎滯育、幼蟲滯育、蛹滯育和成蟲滯育，成蟲滯育又稱作生殖滯育(Danks,1987)。當具生殖滯育特性的昆蟲接受到光周期、溫度等外部環(huán)境信號的刺激后，會通過內分泌系統(tǒng)調節(jié)昆蟲激素滴度的變化以促進滯育的發(fā)生(Denlingeretal.,2012)。保幼激素(juvenile hormone,JH)是由昆蟲咽側體(corpus allatum,CA)中合成的一種倍半萜類化合物，參與了昆蟲發(fā)育、變態(tài)、生殖、滯育等諸多生理事件(周樹堂等,2012;Jindraetal.,2013)。前人在淡色庫蚊Culexpipiens(魯加龍等,1993;Kangetal.,2014)、始紅蝽Pyrrhocorisapterus(Smykaletal.,2014)、七星瓢蟲Coccinellaseptempunctata(劉夢姚等,2019)等眾多生殖滯育型昆蟲中已經(jīng)證實，保幼激素信號的缺乏是雌成蟲順利進入并維持滯育的關鍵因素，而咽側體內JH的合成調控對昆蟲順利完成生殖滯育準備至關重要(Denlingeretal.,2012)。

促咽側體素(allatotropin,AT)和抑咽側體素(allatostatin,AST)是由昆蟲腦分泌的兩種重要的CA活性調節(jié)劑，雖然只在較短的時段內發(fā)揮效應，卻能有效激活或抑制一系列酶促反應，從而促進或抑制CA中JH的合成(劉艷等,2007;Stay and Tobe,2007)。前人的研究發(fā)現(xiàn)，對煙草天蛾Manducasexta的CA外源施加AT能顯著促進JH的合成(Lietal.,2002)，沉默淡色庫蚊的AT也能有效抑制雌成蟲卵巢的發(fā)育，促使個體由生殖向生殖滯育的轉變(Kangetal.,2014)。而抑咽側體素(ASTs)分別屬于AST-A(Cockroach ASTs或FGL amides),AST-B[Cricket ASTs或W(X)6W amides]和AST-C(ManducaASTs或PISCFs) 3個不同的家族(Bendenaetal.,1999;Gilbertetal.,2000)，其種類和功能在不同的昆中存在較大的差異。例如，紅頭麗蠅Calliphoravomitoria的AST-A對自身CA不具敏感性，卻對太平洋折翅蠊Diplopterapunctata的CA中JH合成具有顯著的抑制效果(Duveetal.,1994)；雙斑蟋蟀Gryllusbimaculatus的AST-A和AST-B雖然均對自身JH合成具有明顯的抑制效果，但AST-B的抑制效果顯著高于AST-A(Lorenzetal.,1995)；而對埃及伊蚊Aedesaegypti的離體CA施加純化獲得內源性的AST-C也能明顯抑制CA活性(Lietal.,2006)。這些研究表明，AT和AST確實可以增強或抑制CA的活性以調節(jié)JH的合成速率，但其是否也能通過調控JH合成以促進或抑制昆蟲的生殖滯育準備，仍缺乏明確證據(jù)。

本研究以一種可被長光照誘導進入生殖滯育的十字花科蔬菜害蟲——大猿葉蟲Colaphellusbowringi為模型開展研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，JH信號在大猿葉蟲生殖和滯育的決定的調控中發(fā)揮著舉足輕重的作用，低水平的JH通過抑制大猿葉蟲雌成蟲卵黃原蛋白(vitellogenin,Vg)基因Vg1和Vg2的表達以抑制卵巢的發(fā)育，從而促進滯育的發(fā)生(Liuetal.,2016)。本研究克隆大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C基因，再通過RNAi和qRT-PCR等技術，明確CbAT和CbASTs在滯育與非滯育雌蟲頭部的表達差異；檢測其對JH合成途徑的乙酰-CoA乙酰轉移酶(acetyl-CoA acetyltransferase)基因AACT，法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase)基因FPPS，以及JH合成限速酶保幼激素酸O-甲基轉移酶(juvenile hormone acid O-methyltransferase)基因JHAMT以及受JH的誘導表達Krüppelhomolog1(Kr-h1)基因和保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase)基因JHE1的表達變化以指示JH信號水平的變化(Noriega,2014;Zhuetal.,2017)；同時檢測卵黃原蛋白合成基因Vg1和Vg2表達量變化，探究其在其生殖滯育準備期對JH信號以及卵黃積累的調控功能，以期為進一步明確昆蟲滯育的上游調控路徑、挖掘害蟲防治新靶標提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試大猿葉蟲Colaphellusbowringi成蟲(約500頭)于2017年11月采自江西省修水縣(29°1′N,114°4′E)。在智能人工氣候箱(HP-250-GS，武漢瑞華儀器設備有限公司)中，以新鮮的長羽裂蘿卜Raphanussativusvar.longipinnatus葉片飼養(yǎng)2019年秋季滯育解除的大猿葉蟲成蟲，獲得繁殖個體。在溫度25℃和RH 70%的飼養(yǎng)條件下，大猿葉蟲幼蟲期約為8 d，蛹期約為4 d(薛芳森等,2002)，蛹期可進行雌雄鑒別(Wangetal.,2006)。飼養(yǎng)溫度25℃和光周期12L∶12D時，可獲得注定非滯育個體，雌成蟲4日齡前為產(chǎn)卵前期，期間卵巢內卵黃原大量積累而脂肪積累較少；飼養(yǎng)溫度25℃和光周期16L∶8D時，可獲得注定滯育個體，雌成蟲4日齡前為滯育準備期，此期間卵巢發(fā)育受到抑制而脂肪體內積累大量脂質(Xueetal.,2002;Wangetal.,2004;Tanetal.,2016)。

1.2 基因鑒定、克隆及序列分析

利用前期建立的大猿葉蟲轉錄組數(shù)據(jù)庫(Tanetal.,2015)，鑒定大猿葉蟲CbAT和CbASTs基因，通過NCBI網(wǎng)站在線工具ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)搜索其開放閱讀框(ORFs)，并利用ExPASy在線翻譯工具Translate(http:∥web.expasy.org/translate/)對其進行氨基酸的序列轉換。利用Premier 5.0軟件設計試驗所需引物(表1)?？寺∧康幕騊CR反應體系及條件參照TransTaqDNA Polymerase High Fidelity試劑盒(TransGen Biotech)說明書，將目標片段進行膠回收(AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,Axygen)并連接pMD18-T載體(TaKaRa)后測序以驗證序列正確性。

基于NCBI的Protein數(shù)據(jù)庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)中檢索獲得的不同物種AT和AST氨基酸序列，并利用Blast工具(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與其他物種氨基酸序列進行相似度比較，再通過MEGA 6.6軟件中鄰接(neighbor-joining)法進行系統(tǒng)進化分析。利用ExPASy在線軟件pI/Mw(https:∥web.expasy.org/compute_pi/)分別對大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C蛋白質的等電點和分子量進行預測。

1.3 總RNA提取與反轉錄

對1.1節(jié)飼養(yǎng)的供試大猿葉蟲注定滯育與注定非滯育2-3日齡雌蛹、初羽化雌成蟲(定義為0日齡)和1-4日齡雌成蟲頭部(去除觸角)剪下，液氮速凍于無RNA酶離心管中，每樣本大于10頭，重復3次。將樣品用液氮研磨至粉末后，利用Trizol法進行總RNA的提取，具體步驟可參考RNAiso Plus(TaKaRa)說明書。

利用1.0 μg獲得的總RNA進行cDNA合成，具體方法與步驟參照Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)進行。

1.4 qRT-PCR檢測目的基因表達

將1.3節(jié)反轉錄獲得的cDNA用ddH2O稀釋20倍后，用于目的基因表達量檢測。供試qRT-PCR引物序列及擴增效率等信息參考(表1)。qRT-PCR方法參照實驗室前期在大猿葉蟲中建立的平臺(Liuetal.,2016)，以RPL19和Actin1作為內參基因(Tanetal.,2015)，利用SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)進行體系配制，并在LightCycler 96(Roche)程序上完成數(shù)據(jù)采集及分析。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.5 RNA干擾

基因的RNAi試驗方法參考前期建立的大猿葉蟲RNAi平臺(Liuetal.,2016)。利用表1中RNAi引物對CbAST-B和CbAST-C的dsRNA區(qū)段進行PCR擴增，連接pMD18-T載體(TaKaRa)后測序以驗證序列正確性。參照1.2節(jié)方法，利用測序正確后的pMD18-T-CbAST-B和pMD18-T-CbAST-C以及實驗室前期構建的pGEX-4T-GFP為模板，分別對CbAST-B,CbAST-C和GFP基因進行PCR擴增后，切膠回收獲得3個基因的dsRNA合成模板，并測定濃度；分別取1.0 μg的CbAST-B,CbAST-C和GFP的dsRNA合成模板，參照T7 RNA Polymerase(Invitrogen)方法合成dsRNA。

將200.0 nL的質量為2.0 μg的CbAST-B和CbAST-C的dsRNA注射至注定滯育2日齡雌蛹腹腔。對于CbAST-B和CbAST-C基因的混合RNA干擾試驗，每個基因2.0 μg的dsRNA均勻混合為200.0 nL，然后注射到蟲體中。所有RNAi實驗均以dsGFP為對照。RNAi后，按1.1節(jié)方法飼養(yǎng)至4日齡雌成蟲，剪下雌成蟲頭部(去除觸角)并解剖脂肪體，均置于無RNA酶離心管中，每樣本組織大于10頭，液氮速凍置于-80℃冰箱保存，同時觀察卵巢發(fā)育情況。依據(jù)1.3節(jié)方法對樣品進行總RNA提取和反轉錄反應，再利用qRT-PCR(同1.4節(jié))檢測頭部(去除觸角)樣品中的目標基因的沉默效率以及JH合成基因AACT(GenBank登錄號:MT977124),FPPS(GenBank登錄號:MT977125)和JHAMT(GenBank登錄號:MT977123)以及脂肪體中JH應答基因Kr-h1(GenBank登錄號:KX753345.1)和JHE1(GenBank登錄號:KY229689.1)和卵黃原蛋白基因Vg1(GenBank登錄號:KU516007.1)和Vg2(GenBank登錄號:KU516008.1)的表達量變化。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基因的相對表達量計算采用2-ΔΔCT法(Schmittgen and Livak,2008)，基于3次生物學重復。基因的相對表達量數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均值±標準差，其差異顯著性分析均采用SPSS 11.5軟件中獨立樣本t測驗(independent samplest-test)進行，再利用GraphPad Prism 8.0繪圖。

2 結果

2.1 大猿葉蟲CbAT和CbASTs基因的鑒定與序列特征

在大猿葉蟲轉錄組中，鑒定到一個促咽側體素基因CbAT(GenBank登錄號:MT977128)和兩個抑咽側體素基因CbAST-B(GenBank登錄號:MT977126)和CbAST-C(GenBank登錄號:MT977127)，ORF分別長408,600和303 bp，分別編碼135,199和100個氨基酸，預測等電點分別為9.57,6.53和9.18，預測蛋白分子量分別為15.67,23.21和11.64 kD。

2.2 大猿葉蟲CbAT和CbASTs蛋白的系統(tǒng)進化分析與多重序列比對

為了進一步鑒定大猿葉蟲中CbAT,CbAST-B和CbAST-C的同源基因，本研究分別對這3個基因的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析和序列的同源比對。研究發(fā)現(xiàn)，利用不同物種AT蛋白構建的有根的系統(tǒng)發(fā)育進化樹中，不同目的昆蟲之間在分支上彼此分離，大猿葉蟲的CbAT與赤擬谷盜Triboliumcastaneum的TcAT聚為一支，所有昆蟲AT均與非昆蟲外群物種大型溞Daphniamagna親緣關系最遠(圖1:A)。與鞘翅目、雙翅目、膜翅目以及直翅目等昆蟲AT進行氨基酸序列多重比對發(fā)現(xiàn)，大猿葉蟲CbAT的氨基酸序列具備保守的TARGF(Y)G區(qū)域以及典型的KR位點(Veenstra and Costes,1999)，其序列與赤擬谷盜、埃及伊蚊以及歐洲熊蜂Bombusterrestris的AT的序列一致性分別為32.6%,22.5%和20.8%(圖2:A)。再分別以大型溞的DmAST-B和挪威龍蝦Nephropsnorvegicus的NnAST-C為外群構建昆蟲的ASTs進化樹，大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C分別處于昆蟲AST-B和AST-C兩大基因家族分支下，并與鞘翅目昆蟲在小分支上距離最近(圖1:B,C)。同時，通過氨基酸序列的多重序列比對發(fā)現(xiàn)，大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C的氨基酸序列中均具備多個經(jīng)典的KR位點，其中CbAST-B具有6個典型的W(X)6W結構，分別為WNRDLSMW-amide,WNNIHGGW-amide,WQKFQGGW-amide,WNKFTDGW-amide,WDNFRGTW-amide和WTNLKGMW-amide，且大多W(X)6W的碳(C)端都具有一個甘氨酸(Glycine,G)殘基(圖2:B)；而CbAST-C同樣具備典型序列區(qū)段RFRA(Q)CYFNPV(I)SCF(圖2:C)，且在YFNPVS兩端的兩個半胱氨酸(Cysteine,C)形成一個二硫鍵橋(Mengetal.,2015)。另外，CbAST-B與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata、赤擬谷盜以及堆沙白蟻Cryptotermessecundus序列一致性分別為62.0%,52.7%和27.0%(圖2:B)，而CbAST-C與赤擬谷盜、黑腹果蠅Drosophilamelanogaster和家蠶的AST-C氨基酸序列一致性分別為30.9%,23.6%和25.0%(圖2:C)。以上進化樹和氨基酸序列比對分析結果表明，本研究獲得的3個基因分別是大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C的同源基因。

圖1 基于氨基酸序列的大猿葉蟲CbAT (A),CbAST-B (B)和CbAST-C (C)蛋白的系統(tǒng)進化分析(鄰接法)Fig.1 Phylogenetic analysis of CbAT (A),CbAST-B (B) and CbAST-C (C) proteins in Colaphellus bowringi based on the amino acid sequences by neighbor-joining method蛋白來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:LmAT:東亞飛蝗Locusta migratoria (AKN21240.1);SgAT:沙漠蝗蟲Schistocerca gregaria (AKC92815.1);BmAT:家蠶Bombyx mori (XP_021207265.1);MsAT:煙草天蛾Manduca sexta (AAB08759.1);CpAT:淡色庫蚊Culex pipiens (AHG94987.1);AaAT:埃及伊蚊Aedes aegypti (AAB06179.1);BtAT:歐洲熊蜂Bombus terrestris (XP_003398476.1);HsAT:印度跳蟻Harpegnathos saltator (XP011135972.1);CbAT:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17938);TcAT:赤擬谷盜Tribolium castaneum (EFA09244.2);DmAT:大型溞Daphnia magna (JAN79122.1);HhAST-B:茶翅蝽Halyomorpha halys(XP_024219541.1);PsAST-B:小珀椿象Plautia stali (BAU88428.1);CsAST-B:二化螟Chilo suppressalis (ALM30300.1);SfAST-B:草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda (ALM30300.1);AaAST-B:埃及伊蚊Aedes aegypti (AAB06179.1);DaAST-B:銀額果蠅Drosophila albomicans (XP_034105339.1);TcAST-B:赤擬谷盜Tribolium castaneum (XP_008191729.1);CbAST-B:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17936);LdAST-B:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (AIW62335.1);DmAST-B:大型溞Daphnia magna (XP_032788834.1);HaAST-C:棉鈴蟲Helicoverpa armigera (AGH25547.1);BmAST-C:家蠶Bombyx mori (BAG68396.1);PsAST-C:小珀椿象Plautia stali (BAV78790.1);NlAST-C:褐飛虱Nilaparvata lugens (BAO00971.1);LdAST-C:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata (AIW62334.1);CbAST-C:大猿葉蟲Colaphellus bowringi (QNT17937);TcAST-C:赤擬谷盜Tribolium castaneum (EFA09152.2);DmAST-C:黑腹果蠅Drosophila melanogaster (NP_523542.1);LcAST-C:銅綠蠅Lucilia cuprina (XP_023293632.1);NnAST-C:挪威龍蝦Nephrops norvegicus (BX89028.1).

2.3 CbAT和CbASTs在注定滯育和注定非滯育大猿葉蟲不同發(fā)育階段頭部中的表達差異

CbAT在大猿葉蟲注定非滯育3日齡雌成蟲頭部出現(xiàn)表達高峰(圖3:A)，而CbAST-B和CbAST-C分別在注定滯育2和4日齡雌成蟲頭部出現(xiàn)表達高峰(圖3:B,C)。在整個注定滯育與注定非滯育2日齡雌蛹到4日齡雌成蟲期間，CbAT基因始終無表達差異(圖3:A)；而CbAST-B和CbAST-C分別自雌成蟲1和2日齡開始在注定滯育個體顯著高表達(P<0.05)，且表達差異一直持續(xù)到滯育準備期結束(圖3:B,C)。

圖3 CbAT (A),CbAST-B (B)和CbAST-C (C)在注定滯育和注定非滯育大猿葉蟲不同發(fā)育階段雌蟲頭部中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of CbAT (A),CbAST-B (B) and CbAST-C (C) in the head of the diapause-destined and non-diapause-destined females of Colaphellus bowringi at different developmental stages2-3dP:分別為2-3日齡雌蛹2-day-old and 3-day-old female pupa,respectively;0dA:初羽化雌成蟲Newly emerged female adult;1-4dA:分別為1-4日齡雌成蟲1-4-day-old female adult,respectively.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，基于3次生物學重復。nsP>0.05;*P<0.05;**P<0.01(獨立樣本t檢驗)。Data in the figure are mean±SD based on three biological replicates.nsP>0.05;*P<0.05;**P<0.01 (independent samples t-test).下同The same below.

2.4 沉默CbASTs基因對JH信號基因表達的影響

為進一步明確CbASTs基因在大猿葉蟲滯育準備調控中的功能，本研究分別沉默CbAST-B，CbAST-C以及共同沉默CbAST-B+CbAST-C，并檢測JH合成基因AACT,FPPS和JHAMT以及JH的應答基因Kr-h1和JHE1的表達量變化。研究發(fā)現(xiàn)，無論是單獨沉默CbAST-B和CbAST-C，還是同時沉默CbAST-B和CbAST-C，均有較高的沉默效率，達到72.8%～96.8%(圖4)。另外，AACT,FPPS,JHAMT,Kr-h1和JHE1的表達均被不同程度顯著上調(圖5)。這些結果表明，沉默CbAST-B或CbAST-C基因可顯著促進JH合成基因的表達。

圖4 注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲頭部的CbAST-B (A),CbAST-C (B)和CbAST-B+CbAST-C (C) RNAi效率檢測Fig.4 RNAi efficiency of CbAST-B (A),CbAST-C (B) and CbAST-B+CbAST-C (C) in the head of the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi dsGFP為對照。dsGFP was used as the control.下同The same below.

圖5 沉默CbAST-B (A,D),CbAST-C (B,E)和CbAST-B+CbAST-C (C,F)對注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲JH信號基因表達的影響Fig.5 Effects of knocking down CbAST-B (A,D),CbAST-C (B,E) and CbAST-B+CbAST-C (C,F) on the expression of JH signaling genes in the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi檢測去除觸角的頭部樣品中JH合成基因AACT,FPPS和JHAMT以及脂肪體樣品中JH應答基因Kr-h1和JHE1的表達量。The expression levels of JH biosynthesis genes AACT,FPPS and JHAMT in head samples without antenna and JH-responsive genes Kr-h1 and JHE1 in fat body samples were determined.

2.5 沉默CbASTs基因對大猿葉蟲卵黃原蛋白基因表達和卵巢發(fā)育的影響

為了進一步明確CbAST-B和CbAST-C介導的保幼激素信號能否調節(jié)大猿葉蟲滯育準備，在注定滯育的大猿葉蟲中沉默CbASTs觀察卵巢發(fā)育程度并檢測了卵黃原蛋白基因Vg1和Vg2的表達量變化。研究發(fā)現(xiàn)，沉默干擾CbAST-B,CbAST-C和CbAST-B+CbAST-C后，大猿葉蟲4日齡注定滯育雌成蟲脂肪體中Vg1和Vg2的表達均被顯著上調(圖6:A,B,C)，但雌成蟲卵巢發(fā)育程度均未沒有明顯的促進效果，卵巢管仍呈現(xiàn)絲狀或膨大狀且無明顯的卵黃積累(圖6:D)。推測在注定滯育的大猿葉蟲中，CbAST-B和CbAST-C抑制了脂肪體內Vg1和Vg2的表達，有限地抑制了雌成蟲卵巢的發(fā)育，促進滯育準備的完成。

圖6 沉默CbAST-B (A),CbAST-C (B)和CbAST-B+CbAST-C (C)對注定滯育大猿葉蟲4日齡雌成蟲脂肪體中Vg1和Vg2表達以及卵巢發(fā)育(D)的影響Fig.6 Effects of knocking down CbAST-B (A),CbAST-C (B) and CbAST-B+CbAST-C (C) on the expression of Vg1 and Vg2 in the fat body and ovarian development (D) in the diapause-destined 4-day-old female adults of Colaphellus bowringi

3 討論

在具生殖滯育特性的昆蟲中，活化的咽側體會生成更多的JH來促進昆蟲的產(chǎn)卵并繁殖后代，而抑制其咽側體的活性來維持較低的JH水平是昆蟲順利進入生殖滯育的先決條件(Denlingeretal.,2012)。在許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)，由腦分泌的AT和AST在成蟲CA的活化和JH的合成調控中扮演了重要的角色(Weaver and Audsley,2009)。AT作為一種重要的昆蟲JH合成生物促進因子，已經(jīng)在煙草天蛾、埃及伊蚊等多種昆蟲中均被成功鑒定(Kataokaetal.,1989;Veenstra and Costes,1999)。ASTs在昆蟲中分化為A,B和C 3個不同的家族，在家蠶和雙斑蟋蟀中可以鑒定到AST-A和AST-B，馬鈴薯甲蟲中鑒定到AST-B和AST-C，而煙草天蛾和黑腹果蠅中可以同時鑒定到3種ASTs的同源基因(Stay and Tobe,2007;Mengetal.,2015)。本研究在大猿葉蟲中鑒定到了一個CbAT和兩個CbAST-B和CbAST-C的同源基因，其氨基酸序列均能在進化樹上與鞘翅目物種聚為一支(圖1)。同時，大猿葉蟲CbAT,CbAST-B和CbAST-C的序列分別具備保守結構域TARGF(Y)G,W(X)6W以及PV(I)SCF以及經(jīng)典的KR位點(圖2)，但與赤擬谷盜同源基因的氨基酸序列一致性卻分別僅為32.6%,52.7%和30.9%。這是由于昆蟲AT和AST作為神經(jīng)肽基因，編碼肽鏈氨基酸數(shù)量較少，因此在物種間序列分化程度較高，這也進一步驗證了其序列上保守的結構與區(qū)段在物種進化過程中的高度保守性。

對于淡色庫蚊、始紅蝽以及大猿葉蟲等具生殖滯育特性的昆蟲而言，JH對雌成蟲卵粒的成熟具有明顯的促進作用，而JH缺乏會導致雌成蟲卵巢發(fā)育停滯并進入生殖滯育(Kangetal.,2014;Smykaletal.,2014;Liuetal.,2016)。但關于JH合成是如何被促進或抑制的機制一直未能明確，而神經(jīng)肽作為昆蟲生命活動的重要調節(jié)因子，其在JH合成中的調控功能被廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)，AT可以刺激煙草天蛾CA產(chǎn)生大量的JH，促進雌成蟲卵粒的成熟(Nijhout and Riddiford,1974;Kataokaetal.,1989)，沉默AT基因可導致淡色庫蚊雌成蟲卵巢發(fā)育停滯，引發(fā)生殖向滯育的轉變(Kangetal.,2014)，但在大猿葉蟲中，CbAT基因對滯育誘導光信號的變化并不敏感，其表達水平在滯育誘導末期到滯育準備期結束均與生殖個體無顯著的分化(圖3)，據(jù)此推測其對生殖和滯育的決定不起主要作用。然而，CbAST-B和CbAST-C在滯育準備期的表達量均顯著高于產(chǎn)卵前期(圖3)，暗示CbASTs基因可能參與了大猿葉蟲注定滯育個體中JH含量的下調和滯育準備，隨后的RNAi實驗進一步驗證了這一推測。當沉默注定滯育大猿葉蟲的CbAST-B和CbAST-C后，JH合成起始步驟基因AACT以及限速酶基因JHAMT的表達也被顯著上調(圖5)，這可能是由于沉默CbASTs基因打破了其對CA中檸檬酸從線粒體到細胞質的轉運的阻隔作用，促進了JH合成初級底物乙酰-CoA的生成(Nouzovaetal.,2015)，進而有效激活了JH合成及其信號通路，從而進一步促進了下游轉錄因子Kr-h1基因以及受JH誘導的JHE1的表達(圖5)。另外，本研究沉默大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C后均能促進脂肪體內卵黃原蛋白基因Vg1和Vg2的表達，卻不能逆轉雌成蟲卵巢的發(fā)育狀態(tài)(圖6)。這是由于卵巢的發(fā)育是多層次的，包括卵母細胞、濾泡細胞、滋養(yǎng)細胞等的組織器官自身發(fā)育以及卵黃原蛋白的合成及卵母細胞對其的攝取等諸多過程。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲卵黃原蛋白在脂肪體中合成，并通過囊泡運輸至昆蟲血淋巴，從而被卵母細胞吸收積累與卵巢小管(龔和和翟啟慧,1979)。另外，JH可以促進濾泡細胞膜的開放以及卵黃原蛋白受體(vitellogenin receptor)基因VgR的表達，從而促進卵黃原蛋白的吸收(Davey,1981;Liuetal.,2018)，而大猿葉蟲CbAST-B和CbAST-C通過抑制了JH的合成限制了卵黃原蛋白的生成和吸收，而對于卵巢細胞自身的分化和發(fā)育并沒有明顯的調控功能。綜上所述，CbAST-B和CbAST-C作為重要的JH合成調控因子，在長光照誘導的大猿葉蟲滯育準備階段抑制了JH的合成，進而抑制了卵黃的生成、促進了滯育的發(fā)生；而促咽側體素基因CbAT不在表達水平上響應滯育誘導光周期，因此可能不是生殖和滯育轉變的關鍵調控因子。本研究進一步揭示了昆蟲生殖滯育準備期保幼激素信號的調控機制，有助于進一步理解昆蟲對環(huán)境的季節(jié)性適應策略，為開發(fā)害蟲防控新靶標提供了理論借鑒。