Mdogg1基因參與家蠅體內氧化還原平衡的維持

張玉明,邵夢華,李亞靜,馮 琴,魏麗亞,*,柳峰松,*

(1.河北大學生命科學學院,河北保定 071002;2.河北大學生命科學與綠色發(fā)展研究院,河北保定 071002)

線粒體是細胞進行氧化磷酸化的場所，是細胞的能量和代謝調控中心。同時，氧化呼吸代謝旺盛的線粒體也是細胞內活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基生成的主要場所(Chakrabartyetal.,2018)。DNA分子中鳥嘌呤對ROS特別敏感，易受到氧化損傷而轉化為8-羥基鳥嘌呤(8-oxoguanine,8-oxoG)。8-羥基鳥嘌呤與胞嘧啶和腺嘌呤均可配對結合，會使DNA發(fā)生G:C到T:A的顛換突變，可能導致多種嚴重的疾病(Vlahopoulosetal.,2019)。因此，8-羥基鳥嘌呤是一種公認的DNA氧化損傷的標志物(Ba and Boldogh,2018)。線粒體DNA (mtDNA)結構中沒有組蛋白結合，裸露存在于線粒體基質中，比核基因組更易受ROS攻擊破壞。有報道稱，8-羥基鳥嘌呤在線粒體中的濃度可達到細胞核中3～16倍(Radyuketal.,2006)。

大腸桿菌Escherichiacoli中DNA糖苷酶MutM是最早發(fā)現(xiàn)具有切除8-羥基鳥嘌呤的酶(Michaelsetal.,1991)。隨后，研究證實釀酒酵母Saccaromycescerevisiae中8-羥基鳥嘌呤糖苷酶1(8-hydroxyguanine glycosylase 1,OGG1,EC 3.2.2.23)也具有相同功能(Nashetal.,1996;Sandigurskyetal.,1997)。然后，堿基剪切修復(base excision repair,BER)機制和OGG1功能才開始在哺乳動物中得到普遍關注，證實了OGG1對于mtDNA和核基因組DNA均具有重要的保護作用。OGG1酶兼具DNA糖基化酶和脫嘌呤/嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)裂解酶的活性，可特異性識別和切除8-羥基鳥嘌呤，從而恢復基因組中正常的G:C配對(陳黎媛等,2014)。在昆蟲中，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的ogg1研究最為深入，研究內容涉及基因克隆、結構分析和功能驗證(Dherinetal.,2000;Yasukawaetal.,2015;Okumuraetal.,2019)。

家蠅Muscadomestica是一種分布廣泛的雙翅目昆蟲，具有生活周期短、繁殖能力強和易于飼養(yǎng)等優(yōu)點(劉鍵柏等,2020)。研究者所在實驗室對家蠅中參與氧化應激和免疫調控的多種基因進行了功能鑒定，已經(jīng)將家蠅開發(fā)為研究氧化應激、先天性免疫和線粒體功能的理想模型生物(顧冀海等,2017;藺冬冬等,2019;Zhangetal.,2020)。前期研究發(fā)現(xiàn)，細菌刺激后的家蠅轉錄組中ogg1基因(Mdogg1)顯著上調(Tangetal.,2014)，暗示該基因在家蠅中具有參與氧化應激調控的功能。本研究旨在克隆鑒定家蠅Mdogg1基因，驗證其參與氧化應激調控的功能作用。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及飼養(yǎng)

家蠅種蠅為中國科學院動物研究所何鳳琴老師惠贈，已由本實驗室飼養(yǎng)繁殖多代。飼養(yǎng)條件為：溫度25℃，相對濕度50%～70%，光周期12L∶12D。家蠅幼蟲飼料由70 g麩皮和100 mL水組成；家蠅成蟲飼料為0.5 g白糖，1 g奶粉和10 mL水。

1.2 Mdogg1的克隆和原核表達

用RNAiso Plus試劑[大連寶生物(TaKaRa)有限公司]提取5頭家蠅幼蟲總RNA。提取獲得的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并利用核酸定量儀測定其濃度和純度后，以2 μg總RNA為模版，用Oligo (dT)18為引物反轉錄合成cDNA。

根據(jù)本實驗室家蠅轉錄組中序列信息(Tangetal.,2014)，設計Mdogg1基因開放閱讀框(ORF)擴增引物Ogg-F1(5′-ATGCTTTCAGTTTCATTCAAGT-3′)和Ogg-R1(5′-TCACTTCTTTCGTTTCTTGTTG-3′)。以獲得的家蠅cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(25 μL):cDNA模板(300 ng/μL) 1 μL,正反向引物(10 mmol/L)各1 μL,Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR條件:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,58℃退火40 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán)。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離純化后連接pMD18-T載體，重組載體轉化大腸桿菌EscherichiacoliDH5α宿主菌。PCR篩選陽性克隆后，測序驗證。

1.3 家蠅Mdogg1的生物信息學分析

使用ExPASy-Protparam (https:∥web.expasy.org/protparam/)預測蛋白質的理化性質；使用NCBI-CDD (https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)和SMART (http:∥smart.embl-heidelberg.de)數(shù)據(jù)庫分析蛋白質保守結構域；利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLASTp程序分析蛋白質序列相似性，使用Clustal W (http:∥www.clustal.org/clustal2/) 軟件進行多重比對，并利用MEGA軟件(http:∥www.megasoftware.net/)構建分子系統(tǒng)進化樹，然后使用ITOL網(wǎng)站(https:∥itol.embl.de/tree/)進行作圖分析。

1.4 家蠅不同發(fā)育階段和幼蟲組織中Mdogg1的表達水平分析

取家蠅卵、1齡和2齡幼蟲各15頭以及3齡幼蟲、蛹和成蟲各3頭為一個生物學重復，設置3個生物學重復。收集120頭家蠅3齡幼蟲血細胞以及5頭3齡幼蟲肌肉、腸道和脂肪體為一個生物學重復，設置3個生物學重復。采用1.2的方法合成cDNA，根據(jù)家蠅Mdogg1基因序列設計qRT-PCR定量引物Ogg-F2(5′-TCAACAAAACTAAAGGCGG-3′)和Ogg-R2(5′-AAGGACTCAAGGGACGGAA-3′)，檢測Mdogg1在家蠅不同發(fā)育時期和3齡幼蟲不同組織中的表達量。以家蠅組成型表達的β-actin基因作為內參基因，其正向引物actin-F(5′-GAGAAATCCTATGAA CTTCCCGACG-3′)和反向引物actin-R(5′-GGATA CCGCAAGATTCCATACCCAA-3′)。qRT-PCR反應體系(25 μL):cDNA(300 ng/μL) 2.5 μL，正反向引物(10 mmol/L)各1.25 μL,2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL,ddH2O 7.5 μL。qRT-PCR反應條件:95℃預變性1 min;95℃變性20 s,60℃退火10 s,40次循環(huán)。目的基因相對定量用公式2-ΔΔCT計算(Livak and Schmittgen,2001)。

1.5 脅迫刺激后家蠅Mdogg1的表達水平分析

參照Tang等(2019)描述的方法，選取2.5,5,10,20,40,60,80和100 mmol/L的CdCl2水溶液替代家蠅幼蟲培養(yǎng)基中的水與麩皮混勻，投喂2齡家蠅幼蟲進行持續(xù)脅迫處理24 h，以未經(jīng)CdCl2處理的家蠅2齡幼蟲為對照組，對照組和實驗組均設置3組平行實驗，每組處理30頭家蠅幼蟲，取樣檢測Mdogg1表達水平，同時使用基于酶聯(lián)免疫吸附法的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶檢測試劑盒(上海羽朵生物技術有限公司,產(chǎn)品編號001)測定8-羥基鳥嘌呤含量。根據(jù)本實驗室前期研究結果(Fengetal.,2020)，使用0.1 g/L的鹽酸阿霉素(doxorubicin hydrochloride,DOX)溶液浸泡30頭家蠅2齡幼蟲30 min，然后恢復培養(yǎng)6,12和24 h后檢測Mdogg1基因的表達水平，以未經(jīng)DOX處理的家蠅2齡幼蟲為對照組。將30頭家蠅2齡幼蟲置于紫外燈(波長280～315 nm，強度5 J/cm2)下分別照射5,10,20和30 min進行紫外線(ultraviolet,UV)脅迫，然后取樣檢測Mdogg1基因的表達水平，以未經(jīng)紫外線處理的家蠅2齡幼蟲為對照組。上述脅迫刺激實驗的生物學重復和技術重復均為3次，利用qRT-PCR分析各實驗組與對照組中家蠅幼蟲Mdogg1基因表達情況，qRT-PCR的反應體系與條件與1.4節(jié)中相同。

1.6 RNAi干擾Mdogg1后家蠅體內Mdogg1表達水平和氧化還原指標測定

按照顧冀海等(2017)報道的方法，制備Mdogg1基因dsRNA，首先根據(jù)Mdogg1序列信息設計干擾引物dsOgg-F(5′-CCCAAGCTTAGAGGAAGC AACGATGCCAAT-3′)和dsOgg-R(5′-CCGCTCGAG ACTCAAGGGACGGAAATGTGT-3′)，以1.2節(jié)合成的家蠅2 齡幼蟲cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系和反應條件與方法1.2節(jié)相同。將獲得的擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠回收、酶切后連接L4440載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆并測序驗證，得到L4440-Mdogg1干擾載體，提取質粒轉化大腸桿菌HT115感受態(tài)細胞，誘導dsRNA表達，純化dsRNA并測定其濃度。同時設計綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP) dsRNA引物dsGFP-F(5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′)和dsGFP-R(5′-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCG TCCATG-3′)，以dsGFP作為對照。通過顯微注射分別將0.5 ng dsMdogg1和dsGFP注射到家蠅2齡幼蟲體內。

將RNAi處理24 h的家蠅2齡幼蟲取樣。各實驗組與對照組中家蠅幼蟲Mdogg1基因表達水平的檢測方法、qRT-PCR的反應體系和條件與1.4節(jié)中描述相同。并且，按照Zhang等(2020)描述的方法提取家蠅2齡幼蟲總蛋白，采用Bradford法(Bradford,1976)測定蛋白濃度。使用丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(南京建城生物工程研究所，貨號A003-1-2)測定MDA含量，使用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，產(chǎn)品編號S0033)測定ROS水平，使用總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)測定試劑盒(南京建城生物工程研究所，產(chǎn)品編號A001-3-2)測定SOD活性，使用基于酶聯(lián)免疫吸附法的8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶檢測試劑盒(上海羽朵生物技術有限公司,產(chǎn)品編號001)測定8-羥基鳥嘌呤含量。各生化指標測定實驗的生物學重復和技術重復均為3次，每個生物學重復使用15頭家蠅2齡幼蟲。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)分析使用Excel和SPSS 20.0軟件程序進行，數(shù)據(jù)結果均以平均值±標準差表示。實驗組超過2組時，使用one-way ANOVA方法進行分析處理，并運用Turkey氏顯著性檢測方法進行多重比較；2組實驗數(shù)據(jù)分析時，使用Student氏t檢驗進行檢驗分析。

2 結果

2.1 Mdogg1基因的克隆與序列分析

克隆得到家蠅Mdogg1基因序列(GenBank登錄號:AYK27449.1)，cDNA長1 062 bp，編碼353個氨基酸殘基，該蛋白的理論分子量和等電點分別為41.08 kD和9.02。MdOGG1與4種模式生物(人Homosapiens，小鼠Musmusculus，黑腹果蠅Drosophilamelanogaster，斑馬魚Daniorerio)OGG1氨基酸序列一致性分別為38.41%,38.72%,49.02%和36.08%。保守結構域分析顯示(圖1)，盡管MdOGG1與其他模式生物的OGG1蛋白質的氨基酸序列相似性不高，但5種OGG1二級結構保守，分子中均含有螺旋-發(fā)夾-螺旋(Helix-hairpin-Helix,HhH)基序和核酸內切酶Ⅲ(endonuclease III)保守結構域ENDO3c。從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取膜翅目、鱗翅目、半翅目、鞘翅目和雙翅目昆蟲OGG1氨基酸序列進行分子進化分析，結果表明這些OGG1家族成員嚴格地聚為5個類群(圖2)，與物種的進化關系高度吻合。

圖1 家蠅與幾種模式生物的OGG1氨基酸序列比對Fig.1 Alignment of amino acid sequences of OGG1 from Musca domestica and other model species蛋白質來源物種及GenBank登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers:MdOGG1:家蠅Musca domestica,AYK27449.1;HsOGG1:人Homo sapiens,NP_001341580.1;MmOGG1:小鼠Mus musculus,NP_035087.3;DmOGG1:黑腹果蠅Drosophila melanogaster,NP_572499.2;DrOGG1:斑馬魚Danio rerio,NP_001116780.1.HhH基序在框中標出，下劃線標識的字母是ENDO3c結構域。Sequence of the HhH motif is marked in the box，and the ENDO3c domain is marked with underline.

圖2 鄰接法構建的基于氨基酸序列的OGG1系統(tǒng)進化樹(1 000次重復)Fig.2 Phylogenetic tree of OGG1 constructed by using neighbor-joining method based on amino acid sequences (1 000 replicates)

2.2 Mdogg1在家蠅不同發(fā)育階段和3齡幼蟲組織中的表達

qRT-PCR結果顯示(圖3)，Mdogg1在家蠅卵中表達量最高，達到其他發(fā)育階段的10倍以上(P<0.05)。Mdogg1基因在家蠅1齡幼蟲到成蠅的發(fā)育過程中表達量呈現(xiàn)逐步上升趨勢，蛹和成蟲階段顯著高于幼蟲階段(P<0.05)。對家蠅3齡幼蟲不同組織中Mdogg1的表達量分析顯示，Mdogg1在脂肪體中表達量最高，血細胞、肌肉和腸道中表達量顯著較低(P<0.05)。

2.3 脅迫刺激后家蠅2齡幼蟲中Mdogg1的表達水平及8-羥基鳥嘌呤含量變化

圖3 Mdogg1在家蠅不同發(fā)育階段(A)和3齡幼蟲組織(B)中的相對表達量Fig.3 Relative expression levels of Mdogg1 in different developmental stages (A) and tissues of the 3rd instar larvae (B) of Musca domesticaE:卵Egg;L1-3:分別為1-3齡幼蟲1st-3rd instar larva,respectively;P:蛹Pupa;Ad:成蟲Adult;M:肌肉Muscle;F:脂肪體Fat body;G:腸道Gut;H:血細胞Hemocyte.不同發(fā)育時期的基因表達量使用卵的表達量進行均一化處理；不同組織中的表達量使用肌肉中的表達量進行均一化處理。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上不同字母表示不同發(fā)育階段或組織間基因表達量存在顯著性差異(P<0.05,one-way ANOVA，Turkey氏多重比較)。The expression levels of Mdogg1 in different developmental stages were normalized to that in the egg.The expression levels of Mdogg1 in different tissues were normalized to that in the muscles.Data in the figure are mean±SD.Different letters above bars indicate significant differences in the expression level between different developmental stages and tissues (P<0.05,one-way ANOVA,Turkey’s multiple comparison).

圖4 CdCl2脅迫24 h后家蠅2齡幼蟲體內的Mdogg1表達量(A)和8-羥基鳥嘌呤含量(B)Fig.4 Expression levels of Mdogg1 (A) and 8-oxoG contents (B) in the 2nd instar larvae of Musca domestica after exposure to CdCl2 for 24 hCK:H2O.圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差;柱上星號和雙星號分別表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)(Student氏t檢驗)。Data in the figure are mean±SD.Asterisk and double asterisk above bars denote significant difference (P<0.05) and extremely significant difference (P<0.01) (Student’s t-test),respectively,from the control group.圖5-6同The same for Figs.5 and 6.

如圖4(A)所示，在2.5～100 mmol/L CdCl2脅迫下，家蠅2齡幼蟲Mdogg1基因表達量隨著CdCl2濃度的升高呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢。當CdCl2濃度為20 mmol/L時，Mdogg1基因的表達量達到最大。當CdCl2濃度從20 mmol/L提高到100 mmol/L，Mdogg1基因的表達量出現(xiàn)逐步回落的現(xiàn)象，但其表達量均顯著高于對照組(P<0.05)。同時，家蠅幼蟲體內DNA損傷標志物8-羥基鳥嘌呤含量隨著CdCl2濃度的提高逐漸增加，尤其是當CdCl2濃度超過10 mmol/L時，8-羥基鳥嘌呤含量上升更為迅速，顯著高于對照組(P<0.05)(圖4:B)。

家蠅2齡幼蟲浸泡于0.1 g/L DOX 30 min，并恢復培養(yǎng)12和24 h后Mdogg1的表達量較未處理對照顯著升高(P<0.05) (圖5:A)。家蠅幼蟲中Mdogg1的表達量隨著UV處理時間的延長而升高(圖5:B)，其中，紫外線照射30 min時Mdogg1表達量較未處理對照呈現(xiàn)極顯著增高(P<0.01)。

2.4 敲低Mdogg1對家蠅2齡幼蟲體內氧化還原狀態(tài)的影響

dsMdogg1注射家蠅 2齡幼蟲處理24 h后，實驗組家蠅幼蟲中Mdogg1的表達量顯著低于注射dsGFP的對照組(P<0.05) (圖6:A)。Mdogg1敲低表達后，家蠅幼蟲中DNA損傷標志物8-羥基鳥嘌呤含量較對照組顯著增高(P<0.05) (圖6:B)，氧化應激標志物ROS水平和MDA含量顯著升高(P<0.05)(圖6:C,D)。同時，家蠅幼蟲體內SOD酶活性極顯著降低(P<0.01) (圖6:E)。結果說明，Mdogg1基因表達水平敲低后，家蠅幼蟲體內氧化還原水平失衡，發(fā)生氧化損傷。

圖5 家蠅2齡幼蟲受到鹽酸阿霉素(A)和紫外線(B)脅迫處理后Mdogg1的表達量Fig.5 Expression levels of Mdogg1 in the 2nd instar larvae of Musca domestica after exposed to doxorubicin hydrochloride (A) and ultraviolet (B)CK:未經(jīng)任何處理的對照組Control group without treatment.2齡幼蟲浸泡于0.1 g/L DOX溶液中30 min并恢復6,12和24 h后,或在280-315 nm紫外線(強度5 J/cm2)下分別照射5,10,20和30 min后檢測基因表達量。The gene expression level was detected after the 2nd instar larvae were soaked in 0.1 g/L DOX solution for 30 min and then recovered for 6,12 and 24 h,or exposed to UV (280-315 nm) at the dose of 5 J/cm2 for 5,10,20 and 30 min,respectively.

圖6 敲低Mdogg1表達對家蠅2齡幼蟲體內氧化應激的影響Fig.6 Effect of knock-down of Mdogg1 on the oxidative stress in the 2nd instar larvae of Musca domesticaA:Mdogg1基因相對表達量Relative expression level of Mdogg1;B:8-羥基鳥嘌呤含量8-oxoG content;C:活性氧水平ROS level;D:丙二醛含量MDA content;E:SOD活性SOD activity.注射dsGFP為對照組。Injection with dsGFP as the control group.

3 討論

DNA損傷修復是生物體生長發(fā)育過程中的重要事件，修復基因的表達紊亂可導致多種代謝疾病的發(fā)生。ogg1基因在哺乳動物中的功能已經(jīng)得到充分關注，然而昆蟲中該基因的功能研究相對較少。本研究對家蠅Mdogg1基因進行了克隆與生物信息學分析。MdOGG1蛋白結構中含有與DNA結合相關的HhH結構域，還具有核酸內切酶Ⅲ保守結構域(ENDO3c)(圖1)，這2個結構域是MdOGG1發(fā)揮核酸內切酶功能的結構基礎，也是具有DNA糖基化酶/AP裂解酶活性的修復蛋白的共同結構特征(Kimetal.,2012)。對MdOGG1與幾種模式生物OGG1的氨基酸序列分析顯示，HhH和ENDO3c結構域在不同物種間均存在，這說明OGG1在不同物種間結構保守。選擇昆蟲中OGG1同源蛋白氨基酸序列，分析OGG1在不同物種間聚類分析，結果顯示昆蟲的OGG1家族成員聚類方式與系統(tǒng)分類地位嚴格一致(圖2)，說明OGG1在物種間保守而重要。

在不同生長發(fā)育階段中，家蠅卵中的Mdogg1的表達量最高(圖3:A)。卵中細胞發(fā)育分化最為迅速，我們推測Mdogg1基因具有調控生長發(fā)育和能量代謝的作用。有報道稱蜜蜂中ogg1基因在個體發(fā)育過程中均呈現(xiàn)穩(wěn)定表達狀態(tài)，該基因對于維持西方蜜蜂Apismellifera線粒體功能十分重要(Aamodt,2009)。人體ogg1基因在胚胎組織和睪丸組織中顯著高表達，具有維持遺傳物質穩(wěn)定和參與胚胎發(fā)育的重要作用(Audebertetal.,2002)。脂肪體是家蠅中重要的代謝調控中樞和免疫調節(jié)器官(Wangetal.,2020)。本研究顯示，Mdogg1基因在家蠅幼蟲脂肪體中表達量最高(圖3:B)，暗示該基因具有參與機體能量代謝和免疫調控的功能。對生物體進行外源脅迫因子處理，引發(fā)機體氧化應激，可以觸發(fā)體內氧化還原基因的表達變化，這是研究基因功能的有效手段(Kimetal.,2011;Wonetal.,2012;Tangetal.,2019)。因此，我們進一步對家蠅分別進行CdCl2、DOX和UV脅迫處理，研究Mdogg1基因的表達變化規(guī)律。

鎘能夠引起細胞內金屬離子失衡，破壞含有金屬離子的蛋白質結構和活性，導致機體發(fā)生氧化損傷(Kumar and Sharma,2019)。本研究顯示，CdCl2處理導致家蠅幼蟲中8-羥基鳥嘌呤含量出現(xiàn)顯著上升現(xiàn)象(圖4:B)，且與CdCl2暴露劑量呈現(xiàn)典型的濃度依賴效應。值得指出的是，2.5-20 mmol/L濃度范圍內CdCl2刺激會逐漸上調家蠅幼蟲Mdogg1基因轉錄(圖4:A)。我們推測Mdogg1在抗逆過程中表達量升高與是其響應細胞內氧化水平的直接體現(xiàn)，即機體通過調高Mdogg1基因轉錄表達，修復受損傷的DNA，并發(fā)揮維持家蠅體內氧化還原平衡狀態(tài)的作用。DOX是一種對包括白血病在內的多種惡性腫瘤具有抑制作用的蒽環(huán)類藥物，該藥物發(fā)揮作用過程中會誘發(fā)機體產(chǎn)生氧化應激(Mortonetal.,2019)。紫外線輻射可引發(fā)人和動物皮膚光老化，造成DNA、脂質產(chǎn)生明顯的氧化應激損傷(Cadet and Wagner,2013)。我們實驗室前期研究顯示，0.1 g/L的DOX處理家蠅2齡幼蟲30 min后，會誘導其發(fā)生氧化應激反應(Tangetal.,2019;Fengetal.,2020)；并且，5 J/cm2的紫外線照射也會引發(fā)家蠅2齡幼蟲體內MDA和ROS水平顯著增加(藺冬冬等,2019)。本研究表明，Mdogg1基因轉錄水平也會受到相同劑量DOX和紫外線的脅迫處理而上調(圖5)，這說明該基因具有響應家蠅體內氧化應激水平的功能。

ogg1基因功能在人和哺乳動物中的研究較為深入。例如，潰瘍性結腸炎患者體內ogg1表達水平與氧化應激水平呈現(xiàn)正相關(Kumagaeetal.,2018)。Kim等(2016)發(fā)現(xiàn)，內毒素誘導小鼠Musmusculus發(fā)生炎癥反應后，與氧化應激信號通路密切相關的信號分子STAT1(signal transducer and activator of transcription 1)會結合到ogg1基因啟動子區(qū)域以調控該基因轉錄表達。并且，當細胞受到嚴重的氧化脅迫時，OGG1會與受損DNA結合形成中間物，進而激活DNA損傷信號物PARP1[poly(ADP-ribose) polymerase 1]的活性，從而啟動受損細胞凋亡途徑，以保護機體免于更為嚴重的損害(Wangetal.,2018)。近些年，ogg1基因在無脊椎動物中的研究也開始獲得關注。Kim等(2012)使用紫外線和重金屬處理劍水溞Tigriopusjaponicus，發(fā)現(xiàn)ogg1基因表達呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，推測該基因具有保護機體免于環(huán)境污染物損傷的作用。Alaraby等(2017)等使用重鉻酸鉀飼喂黑腹果蠅，發(fā)現(xiàn)ogg1基因表達發(fā)生下調；他們進一步對黑腹果蠅飼喂納米氧化銅顆粒(一種抗腫瘤潛在藥物)，ogg1基因又呈現(xiàn)上調表達趨勢。另一項黑腹果蠅相關研究顯示，20 mmol/L百草枯處理12 h可引發(fā)線粒體功能損傷和黑腹果蠅OGG1酶活性下降(Sandersetal.,2017)。Yasukawa等(2015)研究也顯示10 mmol/L百草枯處理的黑腹果蠅會抑制ogg1基因表達，并伴隨8-羥基鳥嘌呤水平的顯著上升。

本研究顯示，家蠅Mdogg1表達水平與CdCl2處理劑量密切相關，并伴隨家蠅中DNA氧化損傷產(chǎn)物8-羥基鳥嘌呤水平持續(xù)增加(圖4)。我們分析，低劑量的脅迫劑量會激發(fā)Mdogg1基因表達，以修復體內DNA損傷；隨著處理劑量的增大，機體的抗氧化系統(tǒng)崩潰，Mdogg1會發(fā)生下調表達趨勢。據(jù)此，我們認為Mdogg1基因具有維持家蠅體內氧化還原平衡的作用。為了驗證該推測，我們使用RNAi技術敲低家蠅幼蟲中Mdogg1表達。我們進行RNAi干擾實驗時，首先驗證了dsRNA注射家蠅幼蟲后4個時間點(6,12,24和48 h)的Mdogg1表達量變化，結果顯示Mdogg1的表達量在RNAi干擾24 h和48 h時均發(fā)生顯著降低(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，且24 h時干擾效果最好(圖6:A)。因此，本研究隨后針對干擾24 h后的家蠅幼蟲進行體內氧化還原指標測定，我們發(fā)現(xiàn)，家蠅幼蟲不僅表現(xiàn)出ROS水平升高，而且8-羥基鳥嘌呤和MDA的含量均出現(xiàn)顯著上升，伴隨SOD活性顯著降低(圖6:B～E)。細胞內氧化失衡會導致ROS暴發(fā)，并攻擊細胞膜上不飽和脂肪酸的雙鍵，導致脂質過氧化損傷而積累MDA。因此，細胞中ROS和MDA水平升高是機體發(fā)生氧化應激反應的標志。本研究對Mdogg1基因的敲低表達后，家蠅幼蟲體內發(fā)生氧化還原平衡紊亂?；诖耍覀冋J為Mdogg1具有維持細胞內氧化還原平衡的功能。再結合Mdogg1對于CdCl2、DOX和UV脅迫處理的轉錄響應結果，我們認為該基因直接參與了家蠅氧化還原平衡的調控，具有保護機體抵抗氧化損傷的生物學效應。最新研究顯示，ogg1不僅具有DNA修復功能，還可以調控多種細胞代謝通路，維持機體代謝平衡。例如，Simon等(2020)發(fā)現(xiàn)，ogg1基因敲除的小鼠會易發(fā)生腸道炎癥和肥胖，并導致腸道微生物菌群變化；ogg1基因敲除的小鼠受到缺氧脅迫處理后，其腦和肺部組織中多種與炎癥調控的基因發(fā)生表達紊亂(Rognlienetal.,2018)。在本研究中，我們通過外源刺激物脅迫處理和RNAi技術研究了Mdogg1的生理功能，發(fā)現(xiàn)該基因具有維持家蠅體內氧化還原平衡的作用。當然，Mdogg1發(fā)揮調控作用的分子機制還需要在后續(xù)工作中深入研究。