琥珀蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子基因AaSGF-1的克隆、原核表達(dá)及組織表達(dá)分析

李瓊艷,陳安利,荀利杰,劉增虎,廖鵬飛,楊偉克,董占鵬,*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所,云南蒙自 661101;2.安康學(xué)院,陜西安康 725000)

轉(zhuǎn)錄因子是參與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控并廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的一類蛋白質(zhì)，能直接或間接地與特異的DNA調(diào)控元件結(jié)合，從而調(diào)控目的基因的轉(zhuǎn)錄(Kaufmann and Knochel,1996)。Fox(forkhead box)蛋白是一大類含高度保守Forkhead box結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，Weigel等(1989)和 Weigel和J?ckle (1990)首次克隆鑒定到了黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的Fork head (FKH)基因，并發(fā)現(xiàn)該基因調(diào)控果蠅早期胚胎、腸道、外胚層的發(fā)育。此后，這類結(jié)構(gòu)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子相繼在小鼠Musmusculus、非洲爪蟾Xenopuslaevis和秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans等物種中被發(fā)現(xiàn)，并統(tǒng)一命名為Fox基因(Kaestneretal.,2000)。目前，F(xiàn)ox蛋白家族已經(jīng)在包括家蠶Bombyxmori(Matsunoetal.,1990;Machetal.,1995)在內(nèi)的一百多種動(dòng)物和真菌物種中被發(fā)現(xiàn)或預(yù)測，并有研究表明該基因家族參與調(diào)控細(xì)胞增殖分化及凋亡(Myat and Andrew,2000;Salih and Brunet,2008)、胚胎發(fā)育(Weigeletal.,1989;Hoodlessetal.,2001)、形態(tài)建成(Friedman and Kaestner,2006)、機(jī)體衰老(van de Horst and Burgering,2007)、糖脂代謝(Kaestner,2000；Costaetal.,2001)和免疫應(yīng)答(Jacksonetal.,2010;Benayounetal.,2011)等生物學(xué)過程。

Matsuno等(1990)在家蠶后部絲腺細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一類高量表達(dá)的作用因子，并將其命名為絲腺轉(zhuǎn)錄因子SGF-1(silk gland factor 1)；Mach等(1995)通過序列比對發(fā)現(xiàn)SGF-1蛋白含保守的Forkhead結(jié)構(gòu)域，是Forkhead家族的新成員，屬FOX A亞家族，這是在家蠶體內(nèi)克隆出來的第一個(gè)屬于Fox家族的基因。有研究表明SGF-1不僅能激活絲膠1(sericin-1,ser-1)基因的轉(zhuǎn)錄(Matsunoetal.,1989;Machetal.,1995)，還可與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同調(diào)控絲素輕鏈 (fibroin light chain,fib-L)基因、絲素重鏈 (fibroin heavy chain,fib-H)基因和P25基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)(Durandetal.,1992;Horardetal.,1997;Takiyaetal.,1997)。另外，Kokubo等(1996)利用原位雜交和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)SGF-1可能參與了家蠶胚胎期腸道、絲腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官的發(fā)育，運(yùn)用RNAi技術(shù)在家蠶胚胎期對SGF-1基因進(jìn)行干涉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)軸索發(fā)育受到影響，說明SGF-1在家蠶神經(jīng)發(fā)育過程中起著不可或缺的作用(Liuetal.,2016)。

琥珀蠶Antheraeaassama屬鱗翅目(Lepidoptera)大蠶蛾科(Saturniidae)柞蠶屬Antheraea絹絲昆蟲，其絲以耐磨和富有金黃色光澤而聞名，與家蠶絲相比有更好的強(qiáng)伸力、更強(qiáng)的吸濕性，并具有優(yōu)良的生物學(xué)特性(Lucasetal.,1960;Sen and Murugesh,2004;Goujonetal.,2012)，在紡織、生物醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域有較好的開發(fā)利用潛力，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。然而，琥珀蠶具有典型的野蠶特性，卵孵化嚴(yán)重不齊，且絲蛋白組成及滯育性都與家蠶存在差異，所以AaSGF-1是否參與琥珀蠶絲腺發(fā)育及絲蛋白合成都未可知。本研究結(jié)合RT-PCR與RACE方法克隆了琥珀蠶AaSGF-1基因，并利用生物信息學(xué)對基因序列及其編碼蛋白的理化特性進(jìn)行分析；通過原核表達(dá)得到目的蛋白，制備多克隆抗體驗(yàn)證特異性，利用免疫熒光技術(shù)檢測AaSGF-1在琥珀蠶絲腺中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究AaSGF-1基因在琥珀蠶絲腺發(fā)育及其在絲蛋白合成過程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的琥珀蠶及蠶卵由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所馴養(yǎng)保存。蠶卵于室溫催青孵化，幼蟲于室內(nèi)用新鮮天竺桂枝條飼養(yǎng)。取5齡第4天幼蟲的頭、中腸、脂肪體、絲腺、血液、表皮等組織器官，其中絲腺組織包括前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺。獲取的上述材料于液氮中速凍后，在-80℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA第1鏈合成

取1.1節(jié)中-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆玫溺晷Q組織樣品，利用RNA Plus(TaKaRa)提取組織總RNA，以1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，用超微量分光光度計(jì)(IMPLEN N50T)測定RNA樣品的濃度和純度(OD260/OD280)。用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 琥珀蠶AaSGF-1基因的克隆

根據(jù)GenBank中登錄的家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子SGF-1基因的核苷酸序列(GenBank登錄號(hào):NP_00103732)設(shè)計(jì)引物，上游引物SGF-1-F:5′-ATGATCTCGCAGAAGCTTTC-3′；下游引物SGF-1-R:5′-TCACAAGGGCGGCTGGGCGT-3′。以1.2節(jié)獲得的絲腺cDNA為模板，進(jìn)行SGF-1基因完整ORF的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系:rTaq 0.1 μL,10×Buffer 2 μL,dNTP Mix 1 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,模板2 μL,RNA free H2O 12.9 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后切膠、純化、回收，并克隆到pMD19-T質(zhì)粒，重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliTop10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后送樣測序。根據(jù)所獲得的SGF-1基因的序列設(shè)計(jì)3′-RACE和5′-RACE特異性引物，SGF-1-3′F:5′-GAACTCT GCCTCCCCGAGCACACG-3′;SGF-1-5′R:5′-AGA GATTCGGATAGGGCTGTGCTG-3′。按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(TaKaRa)試劑盒的說明書進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，經(jīng)菌液PCR鑒定后送樣測序。

1.4 目的基因的生物信息學(xué)分析

利用Compute pI/Mw(http:∥web.expasy.org/compute_pi/)對1.3節(jié)克隆的目的基因所編碼的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量與等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；利用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測；利用PSIpred(http:∥bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred_new/)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，利用BioEdit軟件對序列進(jìn)行拼接，利用DNAStar軟件中的MegAlign組件對目的基因以及NCBI數(shù)據(jù)庫中其他物種SGF-1蛋白和FKH蛋白的氨基酸序列進(jìn)行相似性分析；用ClustalX1.83軟件對篩選的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，并用MEGA 6.0(Tamuraetal.,2013)軟件的最大似然法(maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 qPCR檢測目的基因組織表達(dá)譜

以1.2節(jié)中獲得的各組織的cDNA為模板，根據(jù)1.3節(jié)克隆的基因序列設(shè)計(jì)定量引物qAaSGF1-F:5′-GGTGAAGATAAAGAAATGCG-3′；qAaSGF1-R:5′-CCGTGTGATGCTGAATGG-3′。以β-actin為內(nèi)參基因(陳安利等,2018)，引物序列為:β-actin-F:5′-CAAAACATTCAACACCCCCG-3′;β-actin-R:5′-TGGCGTGAGGCAGTGCGTAA-3′。在熒光定量PCR儀StepOne Plus Realtime PCR System (Applied Biosystems)上進(jìn)行qPCR檢測。參照羅氏熒光定量試劑盒說明書配制反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq (Roche,2×) 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,模板2 μL,RNase-free H2O 6.4 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃ 1 min;95℃ 30 s,58℃ 1 min,共40個(gè)循環(huán)。3頭蠶為1樣本，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用2-ΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.6 原核表達(dá)及純化

根據(jù)1.3節(jié)克隆的琥珀蠶AaSGF-1基因的完整序列設(shè)計(jì)原核表達(dá)載體構(gòu)建所需的引物：AaSGF-1-BamHI-F:5′-CAGCAAATGGGTCGCGGATCCATGAT CTCGCAGAAGCTCTCG-3′(下劃線序列為BamHⅠ酶切位點(diǎn))；AaSGF-1-EcoRI-R:5′-GCTTGTCGA CGGAGCTCGAATTCTCACAAGGGCGGCTG -3′(下劃線序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))，以琥珀蠶絲腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用BamHⅠ/EcoRⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物及pET-28a(+)載體并連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株；利用0.5 mmol/L的IPTG在37℃下誘導(dǎo)4 h進(jìn)行蛋白小量誘導(dǎo)表達(dá)檢測。小量誘導(dǎo)表達(dá)成功后進(jìn)行大批量誘導(dǎo)，挑單菌落于10 mL LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中，250 r/min 37℃過夜培養(yǎng)；于1 L的LB液體培養(yǎng)基(卡那抗性)中接入1%的過夜培養(yǎng)菌，250 r/min 37℃培養(yǎng)3 h，然后加入0.5 mmol/L的IPTG在37℃條件下誘導(dǎo)6 h；收集菌體，超聲破碎(300 W，超聲10 s，間隙10 s為一次)30次，4℃ 12 000 r/min離心15 min；沉淀用8 mol/L的尿素充分溶解，上樣于預(yù)先平衡好的NTA純化柱(3 mL NTA介質(zhì)，10倍柱體積NTA-0緩沖液平衡)進(jìn)行純化；使用10個(gè)柱體積的NTA-0緩沖液洗柱后，依次使用1個(gè)柱體積的NTA-X緩沖液(50 mmol/L PBS,pH 7.4,0.15 mol/L NaCl以及10,20,50,200和500 mmol/L咪唑)進(jìn)行洗脫，分步收集不同組分并進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，最終收集含目的蛋白的組分。

1.7 多克隆抗體的制備及效價(jià)測定

用1.6節(jié)純化的融合蛋白作為抗原免疫6周大小的新西蘭大白兔，初次免疫的抗原劑量為300 μg/只，后續(xù)3 次免疫每次為100 μg/只，免疫周期為20 d，免疫完后7-10 d取血(包括中途測試取血和最終放血)；第4 次免疫1周后從兔子耳緣靜脈取血，利用間接ELISA法檢測抗血清的效價(jià)；當(dāng)效價(jià)檢測合格后，從兔子的頸動(dòng)脈取血，于-20℃條件下保存。

1.8 抗體特異性檢測

取琥珀蠶絲腺50 g左右于預(yù)冷的研缽充分研磨至粉末狀，加入1 mL水化液(8 mol/L尿素，2% CHAPS，1% Destreak Reagent)繼續(xù)研磨樣品至呈勻漿液，將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，冰上裂解30 min,4℃ 12 000 g離心15 min，取上清液；得到的上清再在冰上裂解30 min，離心取上清，上清即琥珀蠶絲腺蛋白樣品，樣品用Bradford法測定蛋白濃度后于-20℃保存?zhèn)溆谩＠?2%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，用3%的封閉液室溫封閉1 h；用1∶1 000(v/v)稀釋的多克隆抗體，4℃孵育過夜，用PBST緩沖液洗3次，每次8 min；用二抗HRP(1∶2 000,v/v)標(biāo)記的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，后用PBST洗3次；按照超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù))操作說明進(jìn)行顯色，隨后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon-5200Multi)檢測。

1.9 免疫熒光觀察

將解剖的琥珀蠶蟻蠶的絲腺和表皮及4齡幼蟲絲腺組織(每頭蠶為一樣品，每組織共3個(gè)樣品重復(fù))放入1×PBS緩沖液中沖洗；然后轉(zhuǎn)移到2 mL多聚甲醛固定液中，冰上靜置30 min；棄固定液，加入2 mL免疫組化通透液，室溫靜置20 min提高細(xì)胞通透性；吸去通透液，加入2 mL封閉液，室溫旋轉(zhuǎn)孵育2 h，去除封閉液；加入1 mL按體積比1∶1 000稀釋的AaSGF-1抗體，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，用封閉液沖洗組織后，再加入封閉液旋轉(zhuǎn)漂洗3次，每次15 min；加入1 mL cy3標(biāo)記的山羊抗免IgG抗體(二抗，用二抗稀釋液按體積比1∶5 000稀釋)，室溫避光旋轉(zhuǎn)孵育2 h，加入封閉液沖洗組織1次；加入DAPI室溫避光旋轉(zhuǎn)孵育30 min，去除DAPI后用封閉液沖洗2次，再用封閉液避光旋轉(zhuǎn)漂洗3次，每次15 min；在載玻片上滴加適量抗熒光猝滅劑，將各組織均勻展開于抗熒光猝滅劑中，蓋上蓋玻片在倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73)下觀察。

2 結(jié)果

2.1 琥珀蠶AaSGF-1基因的克隆及序列分析

PCR擴(kuò)增獲得一條大小為1 050 bp的完整ORF序列(圖1)，GC堿基含量為51.8%，編碼349個(gè)氨基酸殘基(圖2)，利用3′和5′特異性引物進(jìn)行RACE擴(kuò)增全長cDNA序列，得到AaSGF-1基因60 bp的5′非編碼區(qū)域的基因信息，GenBank登錄號(hào)為MK889510.1。通過Compute pI/Mw對目的基因所編碼的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量與等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為38.8 kD，理論等電點(diǎn)(pI)8.74。SMART軟件分析顯示SGF-1含有1個(gè)Forkhead結(jié)構(gòu)域(第111-201位氨基酸)和一個(gè)HNF-C結(jié)構(gòu)域(第297-347位氨基酸)，無跨膜結(jié)構(gòu)域(圖2)。利用PSIpred軟件在線預(yù)測目的蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示AaSGF-1中N末端(第1-116位氨基酸)和C末端(第199-349位氨基酸)的氨基酸殘基都處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)，其他部分(第117-198位氨基酸)形成4個(gè)α螺旋(helix)和2個(gè)延伸鏈(extended strand)。

圖1 琥珀蠶AaSGF-1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification product of AaSGF-1 of Antheraea assamaM:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker;1:PCR產(chǎn)物PCR product.

圖2 琥珀蠶AaSGF-1基因的核苷酸和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AaSGF-1 gene of Antheraea assama方框內(nèi)為起始密碼子和終止密碼子，陰影部分為Forkhead結(jié)構(gòu)域，下劃線為HNF-C結(jié)構(gòu)域。Letters inside box were the initiation codon and stop codon.The sequence in gray background represents Forkhead domain.The underline stands for the HNF-C domain.

2.2 AaSGF-1的氨基酸序列特征與系統(tǒng)進(jìn)化分析

對琥珀蠶AaSGF-1及其他物種SGF-1及FKH的氨基酸序列進(jìn)行比對分析，結(jié)果表明琥珀蠶AaSGF-1的Forkhead結(jié)構(gòu)域序列與家蠶Bombyxmori、帝王斑蝶Danausplexippus、斜紋夜蛾Spodopteralitura和菜青蟲Pierisrapae的SGF-1蛋白的Forkhead結(jié)構(gòu)域相似性達(dá)到100%，氨基酸序列一致性也都在90%以上。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)結(jié)果表明，AaSGF-1與同屬鱗翅目昆蟲的家蠶、斜紋夜蛾、菜青蟲、帝王斑蝶及避債蛾的SGF-1蛋白親緣關(guān)系較近，聚在一個(gè)支上，但與其他的非脊椎動(dòng)物及哺乳動(dòng)物的遺傳距離較遠(yuǎn)。

2.3 AaSGF-1基因在幼蟲不同組織中的表達(dá)情況

qPCR檢測AaSGF-1在琥珀蠶5齡第4天幼蟲不同組織的表達(dá)結(jié)果如圖4(A)所示，AaSGF-1在絲腺組織中高量表達(dá)，在其他組織中幾乎不表達(dá)。從絲腺不同部位的表達(dá)情況(圖4:B)來看，AaSGF-1在前部絲腺中幾乎不表達(dá)，而主要表達(dá)于中部和后部絲腺，尤其在后部絲腺中表達(dá)量最高。

圖4 qPCR檢測AaSGF-1在琥珀蠶5齡幼蟲不同組織(A)和絲腺不同部位(B)中的表達(dá)量Fig.4 Expression levels of AaSGF-1 in various tissues (A) and different parts of silk gland (B) of the 5th instar larvae of Antheraea assama detected by qPCRHe:頭Head;Mg:中腸Midgut;Sg:絲腺Silk gland;He:血液Hemolymph;Cu:表皮Cuticle;Fb:脂肪體 Fat body;ASG:前部絲腺Anterior silk gland;MSG:中部絲腺M(fèi)iddle silk gland;PSG:后部絲腺Posterior silk gland.

2.4 AaSGF-1的原核表達(dá)與蛋白純化

基于pET-28a(+)載體構(gòu)建獲得琥珀蠶AaSGF-1基因重組表達(dá)質(zhì)粒。用BamHⅠ與EcoRⅠ雙酶切AaSGF-1/pET-28a(+)重組表達(dá)質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到的目的片段與預(yù)期大小一致(圖5:A)，且基因測序證實(shí)載體構(gòu)建成功。將陽性表達(dá)質(zhì)粒AaSGF-1/pET-28a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株后用0.5 mmol/L的IPTG在37℃下誘導(dǎo)4 h，收集菌體進(jìn)行超聲破碎，分別取上清與沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示上清與沉淀中都有大小與目的蛋白相近的條帶，說明AaSGF-1蛋白以可溶的形式和包涵體的形式表達(dá)(圖5:B)。

圖5 AaSGF-1/pET-28a(+)表達(dá)載體鑒定(A)、及重組蛋白表達(dá)(B)和蛋白純化(C)的SDS-PAGE檢測Fig.5 Identification of the expression vector AaSGF-1/pET-28a(+) (A),and SDS-PAGE detection of expression of the recombinant protein (B) and protein purification (C)M1:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker;1:重組質(zhì)粒Recombinant plasmid;2:質(zhì)粒酶切產(chǎn)物Enzyme digest of recombinant plasmid;3:AaSGF-1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物PCR product of AaSGF-1;M2:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;4:總菌體裂解液(未誘導(dǎo))Total bacterial lysate (not induced);5:經(jīng)過37℃ 0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后的總菌體裂解液Total bacterial lyasate induced by 0.5 mmol/L IPTG at 37℃ for 4 h;6:超聲上清Ultrasonic supernatant;7:超聲沉淀Ultrasonic precipitation;8:超聲沉淀用尿素溶解液(未純化)Urea dissolution under ultrasonic precipitation (unpurified);9:流穿液Flow-through sample;10-14:分別用濃度為10,20,50,200和500 mmol/L的咪唑洗脫獲得的蛋白The protein sample washed with 10,20,50,200 and 500 mmol/L imidazole elution buffer,respectively.

經(jīng)檢測AaSGF-1蛋白能以可溶形式和包涵體形式表達(dá)，但可溶形式表達(dá)的蛋白未獲較好純化效果，所以用包涵體形式表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化制備抗體。目的蛋白在變性條件下與Ni-NTA柱結(jié)合效果較好，在50～500 mmol/L咪唑處可洗脫獲得目的蛋白(圖5:C)，收集純化度高的目的蛋白，用BSA標(biāo)準(zhǔn)品測定目的蛋白的濃度為0.8 mg/mL，達(dá)到制備多克隆抗體的要求。

2.5 AaSGF-1的多克隆抗體的效價(jià)及特異性檢測

利用原核表達(dá)的琥珀蠶AaSGF-1的包涵體形式制備多克隆抗體。重組蛋白的抗體效價(jià)檢測結(jié)果顯示，Anti-AaSGF-1多克隆抗體的效價(jià)比較高，符合抗體效價(jià)要求，且抗體最優(yōu)稀釋濃度應(yīng)控制在1∶15 000之內(nèi)。以pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白及AaSGF-1/pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白為抗原，Anti-His為一抗,以琥珀蠶絲腺蛋白及原核表達(dá)純化的His-AaSGF-1融合蛋白為抗原，Anti-AaSGF-1多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果表明制備的多克隆抗體可與目的蛋白AaSGF-1結(jié)合，在理論位置處出現(xiàn)明顯的雜交條帶，而陰性對照組(免疫前血清)不發(fā)生反應(yīng)(圖6:B)，且Anti-His可以和AaSGF-1/pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白結(jié)合而與pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白不反應(yīng)(圖6:A)。結(jié)果說明制備的Anti-AaSGF-1多克隆抗體具有良好的特異性，抗體制備成功。

圖6 Western blot檢測His標(biāo)簽抗體(A)和Anti-AaSGF-1多克隆抗體(B)的特異性Fig.6 Specifcity of His-tag antibody (A) and polyclonal antibody Anti-AaSGF-1 (B) detected by Western blot1:pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白Expressed protein from bacteria containing plasmid pET-28a(+);2:AaSGF-1/pET-28a(+)質(zhì)粒菌表達(dá)蛋白Expressed protein from bacteria containing recombinant plasmid AaSGF-1/pET-28a(+);3:免疫前血清(陰性對照)Pre-immune serum as the negative control;4:琥珀蠶絲腺蛋白Silk protein of Antheraea assama;5:融合蛋白His-AaSGF-1 Fusion protein His-AaSGF-1.

2.6 AaSGF-1表達(dá)的免疫熒光分析

免疫螢光觀察結(jié)果如圖7所示，琥珀蠶蟻蠶絲腺及4齡幼蟲的絲腺經(jīng)Anti-AaSGF-1多克隆抗體染色后，可以觀察到紅色熒光，并能與經(jīng)過DAPI染色的細(xì)胞核區(qū)域完全重合，但蟻蠶表皮經(jīng)Anti-AaSGF-1多克隆抗體染色后觀察不到紅色熒光。這一結(jié)果表明AaSGF-1蛋白在琥珀蠶蟻蠶絲腺及4齡幼蟲的絲腺中有表達(dá)，而在蟻蠶表皮中不表達(dá)。

圖7 琥珀蠶AaSGF-1的免疫熒光分析結(jié)果Fig.7 Immunofluorescence results of AaSGF-1 of Antheraea assamaA-C:蟻蠶絲腺Silk gland of the newly hatched larva;D-F:蟻蠶中部絲腺M(fèi)iddle silk gland of the newly hatched larva;G-I:4齡幼蟲中部絲腺M(fèi)iddle silk gland of the 4th instar larva;J-L:蟻蠶表皮Cuticle of the newly hatched larva.DAPI:以4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽染色Stained with 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride;AaSGF-1:以Anti-AaSGF-1多克隆抗體染色Stained with polyclonal antibody Anti-AaSGF-1;Merge:前兩圖的合并Merge of the former two pictures.

3 討論

Fox蛋白在果蠅中研究的最為深入，果蠅FKH蛋白在胚胎唾液腺的發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，不僅促進(jìn)唾液腺形成早期分泌細(xì)胞的形成(Myat and Andrew,2000)，還能夠阻遏唾液腺細(xì)胞凋亡，提高唾液腺細(xì)胞分泌功能，維持唾液腺的正常生理狀態(tài)(Abramsetal.,2006)。家蠶絲腺和果蠅的唾液腺是同源的器官，具有相似的發(fā)育調(diào)控機(jī)制。家蠶SGF-1蛋白包含有保守的Forkhead結(jié)構(gòu)域，與果蠅FKH蛋白同源。研究發(fā)現(xiàn)，家蠶SGF-1能與Ser-1基因啟動(dòng)子區(qū)域的SA位點(diǎn)結(jié)合并激活Ser-1基因轉(zhuǎn)錄(Weigeletal.,1989)，還可以與絲素重鏈fib-H基因的SA和SB位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控fib-H基因的表達(dá)，并在fib-L和P25基因中同樣鑒定到了SGF-1可能的結(jié)合位點(diǎn)(Huietal.,1990)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SGF-1參與后部絲腺細(xì)胞中P25基因的時(shí)空表達(dá)調(diào)控(Julienetal.,2002)，可以與轉(zhuǎn)錄因子Bmsage結(jié)合共同調(diào)控fib-H的轉(zhuǎn)錄(Zhaoetal.,2014)。另有研究結(jié)果表明，PI3K/AKT/TORC1信號(hào)通路抑制劑處理可降低家蠶幼蟲后部絲腺中SGF-1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控絲素蛋白的合成(郭亞新等,2017)。除此之外，Kokubo等(1996)用原位雜交和免疫組化的方法發(fā)現(xiàn)SGF-1可能參與了家蠶胚胎期腸道、絲腺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等器官的發(fā)育。

本研究對琥珀蠶的AaSGF-1基因進(jìn)行初步研究，通過克隆成功獲得琥珀蠶AaSGF-1的全長cDNA序列，生物信息學(xué)分析顯示琥珀蠶AaSGF-1蛋白包含有Fox家族典型的Forkhead結(jié)構(gòu)域(圖2)，且與家蠶Forkhead蛋白結(jié)構(gòu)具有高度保守性。另外，免疫熒光結(jié)果顯示AaSGF-1在蟻蠶絲腺中有表達(dá)(圖7)，暗示AaSGF-1蛋白可能在琥珀蠶絲腺發(fā)育過程中具有重要的生物學(xué)功能。組織表達(dá)結(jié)果表明，AaSGF-1在絲腺組織中大量表達(dá)而在其他組織中幾乎不表達(dá)(圖4)，且抗體染色結(jié)果表明AaSGF-1在絲腺組織中有蛋白水平上的表達(dá)(圖7)，推測琥珀蠶AaSGF-1可能參與琥珀蠶絲蛋白的合成與分泌。然而，琥珀蠶屬大蠶蛾科的絹絲昆蟲除生活習(xí)性、飼料、滯育性等與家蠶存在差異外，絲蛋白編碼基因與家蠶也不同，家蠶絲蛋白主要由絲素蛋白和絲膠蛋白構(gòu)成，絲素蛋白由fib-H(350 kD)、fib-L(26 kD)和P25蛋白(fibrohexamerin,27/30 kD)按照6∶6∶1比例構(gòu)成(Inoueetal.,2000)。大蠶蛾科的絲素蛋白只由fib-H構(gòu)成，不含fib-L及P25蛋白(Adarshetal.,2015)。Dong等(2015)對包括琥珀蠶在內(nèi)的6種大蠶蛾非桑蠶的絲腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果只在蓖麻蠶絲腺中發(fā)現(xiàn)P25的同源體，而fib-L在6種大蠶蛾非桑蠶的幼蟲絲腺中都沒有被發(fā)現(xiàn)。所以有關(guān)AaSGF-1調(diào)控琥珀蠶絲蛋白基因表達(dá)以及如何參與琥珀蠶絲腺發(fā)育的分子機(jī)制，有待進(jìn)一步的研究。