家蠶抗真菌因子BmSPI39對球孢白僵菌入侵的表達響應

李游山,路慶君,楊 璽,張 杰,羅竹星,夏慶友,趙 萍，*

(1.陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中 723001;2.陜西理工大學,陜南秦巴山區(qū)生物資源綜合開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,陜西漢中 723001;3.西南大學前沿交叉學科研究院,生物學研究中心,重慶 400715)

家蠶Bombyxmori是一種具有重要價值的絹絲昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的典型代表，具有深厚的基礎研究積淀。有研究報道，真菌等病原物在入侵宿主過程中會產生豐富的胞外蛋白酶，這些蛋白酶在病原物入侵中發(fā)揮著關鍵作用(St Leger,1995;Travisetal.,1995)。體壁降解蛋白酶是致病性真菌重要的毒力因子，通常在孢子萌發(fā)時分泌于宿主體壁，參與宿主表皮的穿透過程(St Leger,1995;Charnley,2003)。過表達這些毒力蛋白酶可以顯著增強致病性真菌的毒力(St Legeretal.,1996;Yangetal.,2005,2011;Zhangetal.,2008)。

盡管昆蟲體內沒有類似于哺乳動物的淋巴細胞、免疫球蛋白和完整的補體系統(tǒng)，但是昆蟲在長期進化過程中形成了復雜的天然免疫系統(tǒng)，其中絲氨酸蛋白酶抑制劑就是在昆蟲免疫中發(fā)揮著重要作用。蛋白酶抑制劑可通過調節(jié)內源蛋白酶活性參與昆蟲凝血、酚氧化酶激活或細胞因子激活等過程(Kanost,1999;Cereniusetal.,2010;Fullaondoetal.,2011)。昆蟲還會響應表達高豐度的蛋白酶抑制劑，用于抑制微生物侵入宿主的毒力蛋白酶的活性，以應對病原微生物的入侵(Fr?biusetal.,2000;Vilcinskas,2010;Lietal.,2016b)。筆者前期的研究對免疫相關的家蠶蛋白酶抑制劑進行了系統(tǒng)鑒定，發(fā)現多個TIL(trypsin inhibitor-like cysteine-rich domain)家族蛋白酶抑制劑在微生物添食感染家蠶后上調表達，暗示這些蛋白酶抑制劑可能參與家蠶的免疫過程(Zhaoetal.,2012)。在已發(fā)現的這些TIL家族蛋白酶抑制劑中，BmSPI38和BmSPI39不僅能夠抑制球孢白僵菌產生的體壁降解蛋白酶CDEP-1活性，還可以抑制CDEP-1誘導的有害黑化和白僵菌的分生孢子萌發(fā)，從而增強家蠶的抗真菌能力(Lietal.,2012,2015)。另有研究顯示，以BmSPI39為代表的TIL類蛋白酶抑制劑能夠隨家蠶泌絲過程進入繭層中，并通過抑制病原微生物分泌的毒力蛋白酶活性為繭內的蛹提供保護(Dongetal.,2013;Zhangetal.,2015;Guoetal.,2016;Lietal.,2016b)。家蠶是由野生桑蠶馴化而來，經過長期的馴化和選育，家蠶繭的重量已達到野生蠶繭的10倍以上。定量蛋白質組學研究結果表明，在野生蠶繭中，包括TIL家族蛋白酶抑制劑BmSPI39在內的眾多蛋白酶抑制劑的表達量都顯著高于家蠶繭(Daietal.,2019)。野生桑蠶、家蠶的絲腺組織的定量PCR和轉錄組數據進一步驗證了這一結果。進一步研究證實野生蠶繭中的微生物蛋白酶抑制劑活性明顯強于家蠶繭，暗示野生蠶繭中高豐度的蛋白酶抑制劑可能在抵御病原物入侵中發(fā)揮著保護作用，推測與其生活的較為惡劣的自然環(huán)境有關(Daietal.,2019)。

蛹是從幼蟲到成蟲的變態(tài)過渡階段，也是蠶生命周期中最脆弱的階段，基本上不能對威脅作出反應。迄今為止，人們對昆蟲先天性免疫進行了廣泛的研究，但對蛹期昆蟲應對病原物感染的基本策略知之甚少。受限于蛋白檢測手段，人們對抗真菌因子BmSPI39在家蠶體內生理功能和作用機制的認識還十分有限。蛹期家蠶體壁中BmSP39的表達能否響應球孢白僵菌Beauveriabassiana入侵過程尚不清楚。因此，獲得廉價、高效、特異的BmSP39抗體對研究家蠶TIL家族蛋白酶抑制劑體內功能尤為重要。本研究擬制備兔抗家蠶BmSPI39的多克隆抗體，并對球孢白僵菌誘導下的游走期之后家蠶體壁中的BmSPI39的表達特征進行分析，對深入研究BmSPI39在家蠶體內的生理功能和深化對家蠶蛹期抗真菌機制的認識有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試生物和抗體

供試家蠶“大造”品系、球孢白僵菌B.bassianaBb1菌株和重組表達載體BmSPI39-p28均由西南大學家蠶基因組生物學國家重點實驗室提供。在自然光照周期下以新鮮桑葉飼養(yǎng)家蠶，飼養(yǎng)溫度為25℃，相對濕度為75%±5%。成年新西蘭雄兔購自重慶辛創(chuàng)生物技術有限公司。小鼠抗α-tubulin抗體、HRP標記山羊抗兔IgG(H+L)、HRP標記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購自碧云天公司。

1.2 BmSPI39的誘導表達和純化

BmSPI39蛋白的表達與純化可參照筆者先期報道的方法(Lietal.,2015)，略有調整。將構建好的重組表達載體BmSPI39-p28轉化入大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，待OD600=0.6～1.0時，加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L，在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)5 h。融合表達的BmSPI39的蛋白N末端連有一個的多聚組氨酸標簽(MGHHHHHHM)。收集菌體，用結合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,pH 7.9)重懸菌體，超聲波破碎后，4℃ 16 000×g離心30 min，分別收集上清和沉淀部分。利用Ni2+-NTA親和層析柱(Merck)純化BmSPI39重組蛋白。最后將純化后的BmSPI39重組蛋白透析至0.9% NaCl溶液中，用作免疫用抗原蛋白。

1.3 BmSPI39重組蛋白膠內蛋白酶抑制劑活性染色檢測

將1.2節(jié)誘導表達的蛋白樣品與4×Native PAGE加樣緩沖液(40 mmol/L Tris-HCl，40%甘油，0.032%溴酚藍，pH 8.0)混合，并利用10% Native PAGE(pH 8.3)對純化前后不同稀釋度的蛋白樣品進行分離。另外，將蛋白樣品與不含還原劑的SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后，不進行加熱處理，直接利用15% SDS-PAGE進行分離。蛋白樣品經10% Native PAGE(pH 8.3)或非還原SDS-PAGE分離后，參照筆者先前報道的方法(Lietal.,2012b)進行膠內活性染色。將電泳后蛋白膠置于0.07%的枯草桿菌Bacillussubtilis蛋白酶A溶液(0.1 mol/L Tris-HCl,10 mmol/L CaCl2,pH 7.5)中，37℃避光條件下，45 r/min振蕩孵育15 min?；厥盏鞍酌溉芤?，并利用ddH2O清洗膠2次，每次10 s，然后37℃條件下靜置15 min。按照1∶10的體積比加入底物[20 mg N-乙?；?D,L-苯丙氨酸-β-萘酯(N-acetyl-D,L-phenylalanine-β-naphthylester,APNE)溶于10 mL N，N′-二甲基甲酰胺(N,N′-dimethylformamide)]和染色液[100 mg固藍B鹽(Fast Blue B Salt)溶于100 mL 0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液]的混合溶液，37℃ 45 r/min條件下避光孵育20 min。最后，棄除染色液，加入ddH2O清洗膠面以終止反應。染色原理如下：凝膠上的蛋白酶可分解生色底物APNE，生成的β-萘酚通過重氮偶合反應將膠染成紫紅色。膠內蛋白酶抑制劑若能抑制相應的蛋白酶活性，其所在位置將不會被染色，而呈現為白色條帶。

1.4 BmSPI39的多克隆抗體制備

購買的新西蘭大白兔在本實驗室動物房中飼養(yǎng)1周后，通過耳動脈采集少量免疫前血液，室溫靜置1 h，然后置于4℃過夜，4℃ 4 000 r/min離心10 min分離血清，用作陰性對照。將1.2節(jié)純化的1 mg BmSPI39重組蛋白與弗氏完全佐劑(BBI)等體積充分混勻乳化，背部皮下多點免疫大白兔。間隔2周后，將500 μg BmSPI39重組蛋白與弗氏不完全佐劑(BBI)等體積混勻乳化后，加強免疫大白兔。10 d之后，再加強免疫一次。7 d之后，從耳緣靜脈采集少量血液，分離血清，檢測抗血清效價。待抗血清效價達到預期水平時，經心臟采血，分離血清，置于-80℃冰箱保存。

采用間接ELISA法對His6-BmSPI39的抗血清進行測定。利用包被液(0.15% Na2CO3,0.293% NaHCO3,pH 9.6)將抗原His6-BmSPI39稀釋至5 ng/mL，以100 μL/孔加入酶標板中，4℃包被過夜。經PBST液[0.8% NaCl,0.02% KH2PO4,0.29% Na2HPO4·12H2O,0.02% KCl,0.05%(v/v)Tween-20]洗滌3次后，加入350 μL 1%脫脂奶粉，于37℃封閉2 h。PBST洗滌3次后，加入100 μL倍比稀釋(1∶1 000,1∶2 000,1∶4 000,1∶8 000,1∶16 000,1∶32 000,1∶64 000,1∶128 000)的免疫血清及免疫前血清，37℃孵育1 h，每個濃度設置3個重復。接著，依次進行洗滌、HRP標記的二抗中37℃孵育1 h(1∶2 000,100 μL/孔)、洗滌、TMB顯色液中室溫顯色15 min(100 μL/孔)，最后加入100 μL 2 mol/L H2SO4終止反應。采用BioTek Epoch全波長酶標儀測定492 nm的吸光值，評估抗體效價。

1.5 BmSPI39的多克隆抗體的純化

依次利用硫酸銨分級沉淀法和HiTrap rProtein A親和層析柱(GE Healthcare)對1.4節(jié)制備的BmSPI39多克隆抗體進行純化。取10 mL血清，加入等體積的0.9% NaCl溶液，再逐滴加入5 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為20%的(NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min。3 000 r/min離心20 min，棄去沉淀后，逐滴加入15 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為50% (NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min。離心，棄上清。利用10 mL 0.9% NaCl溶液重新溶解沉淀后，逐滴加入5 mL飽和(NH4)2SO4溶液，使之成為33%的(NH4)2SO4溶液，室溫靜置30 min，離心棄上清，重復此步驟3次。然后，加入5 mL 0.02 mol/L PBS(pH 7.4)重新溶解沉淀，于4℃ PBS(0.02 mol/L,pH 7.4)中透析24 h，每8 h更換一次緩沖液。用PBS平衡HiTrap rProtein A親和層析柱后，取5 mL透析后的多克隆抗體上樣，待PBS漂洗至基線平穩(wěn)后，采用0.1 mol/L檸檬酸三鈉溶液(pH 3.5)進行洗脫，并于每毫升洗脫液中加入100 μL 1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)以中和pH值，置于-80℃保存。最后，利用15%的SDS-PAGE和硝酸銀染色對純化后的多克隆抗體進行檢測。

1.6 基于轉錄組數據的BmSPI39的時空表達分析

前期研究顯示，重組BmSPI39能夠抑制球孢白僵菌的孢子萌發(fā)，體表浸潤法包被BmSPI39蛋白能夠顯著提高家蠶的抗白僵菌能力(Lietal.,2015)。為了分析BmSPI39在家蠶免疫相關的組織和器官中的時空表達情況，由家蠶開放性數據庫SilkDB 3.0(Luetal.,2020)，獲取BmSPI39(Gene ID:BMSK0001557)在4齡第3天至化蛹后1 d家蠶的體壁、中腸和脂肪體中表達數據，并利用Heml1.0軟件進行熱圖分析。

1.7 球孢白僵菌體表接觸接種家蠶

球孢白僵菌體表接觸接種家蠶按照筆者前期報道的方法(李游山等,2018)進行。首先，利用滅菌ddH2O配制2×106孢子/mL和2×107孢子/mL的球孢白僵菌分生孢子懸液。然后，將單層無菌紗布包裹的游走期(即家蠶“熟蠶”期)家蠶幼蟲于不同濃度的孢子懸液中浸泡10 s，取出置于塑料盒中的無菌簇具上，于28℃感染家蠶幼蟲體表。就“大造”品系而言，在正常飼養(yǎng)條件下，游走期一般為1～2 d，上蔟吐絲結束進入預蛹，再經1～2 d左右蛹皮形成，進入蛹期。ddH2O處理組作為空白對照。收集接種球孢白僵菌后36 h(吐絲期),60 h(預蛹期),84 h(化蛹后1 d),108 h(化蛹后2 d)和120 h(化蛹后3 d)的家蠶體壁，液氮中速凍后，置于-80℃保存，用于進一步研究家蠶幼蟲在上蔟吐絲至化蛹階段BmSPI39蛋白是否在體壁中表達，其表達能否響應球孢白僵菌入侵。

1.8 Western blot球孢白僵菌侵染后家蠶體壁中BmSPI39的表達

為了進一步研究在上蔟吐絲至化蛹階段BmSPI39蛋白是否在家蠶體壁中表達，其表達能否響應球孢白僵菌入侵，利用不同濃度的球孢白僵菌接種起始上蔟吐絲的家蠶，并對接種后不同時間點(也即幼蟲上蔟吐絲起始后的不同時間點)的幼蟲和蛹期體壁中的BmSPI39進行Western blot分析。采用組織裂解液(8 mol/L尿素，2% CHAPS,0.4% DTT)提取1.7節(jié)中接種球白僵菌后不同時間點的家蠶體壁蛋白質，并利用Bradford法(Bradford,1976)測定蛋白質濃度。蛋白樣品經15%的還原性SDS-PAGE分離后，電轉印記至PVDF膜上。將膜置于5%脫脂奶粉中，4℃條件下封閉過夜。使用針對BmSPI39的多克隆抗體作為第一抗體(1∶2 500)和HRP標記山羊抗兔IgG(1∶40 000)作為二抗。以α-tubulin作為內參。使用ECL檢測試劑盒(Roche)顯色，檢測其化學發(fā)光信號。運用Quantity One軟件對Western blot的條帶進行灰度分析。首先將目的蛋白條帶的灰度值除以內參蛋白條帶的灰度值，進行歸一化處理。然后以空白對照組歸一化后的灰度值為基數，實驗組歸一化后的灰度值與其比值為相對灰度值，也即蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 BmSPI39原核表達

原核表達結果表明，在0.2 mmol/L IPTG誘導培養(yǎng)5 h條件下，BmSPI39在BL21(DE3)菌株上清中高量表達(圖1:A)，經鎳柱親和純化后獲得一個約18 kD的高純度蛋白質(圖1:B)，其表觀分子量與BmSPI39重組蛋白的二聚體大小一致。鑒于BmSPI39能夠抑制枯草桿菌蛋白酶等微生物物源的蛋白酶活性(Lietal.,2015)，利用10% Native PAGE(pH 8.3)對純化前后不同稀釋度的蛋白樣品進行分離和進行蛋白酶抑制劑膠內活性染色檢測，結果顯示純化后的重組BmSPI39蛋白能夠強烈抑制枯草桿菌蛋白酶A的活性(圖1:C)，證實該純化蛋白為有生物學活性的His6-BmSPI39重組蛋白。

圖1 家蠶BmSPI39的重組表達 (A)、純化(B)及其對枯草桿菌蛋白酶A的膠內活性染色檢測(C)Fig.1 Expression (A),purification (B) of the recombinant BmSPI39 of Bombyx mori and its activity to the subtilisin A detected by in-gel activity staining (C)CK-S和CK-U分別表示對照組的菌體上清和不可溶成分；IPTG-S和IPTG-U分別表示IPTG誘導組中的菌體上清和不可溶成分。His6- BmSPI39表示含組氨酸標簽的BmSPI39重組蛋白；箭頭所示為BmSPI39重組蛋白條帶及其活性染色帶；C圖中白色條表示帶膠內BmSPI39具有能抑制枯草桿菌蛋白酶A的蛋白酶活性。CK-S and CK-U indicate the supernatant and insoluble components of the E.coli cells in the control group,respectively.IPTG-S and IPTG-U indicate the supernatant and insoluble components of the IPTG-induced E.coli cells,respectively.His6-BmSPI39 denotes the hexahistidine-tagged recombinant BmSPI39.The arrowheads show the protein bands and activity-stained bands of the recombinant BmSPI39.The white band in figure C indicates that BmSPI39 in the gel can inhibit the protease activity of subtilisin A.下同The same below.

2.2 BmSPI39多克隆抗體的制備、純化及Western blot分析

間接ELISA法測定結果表明，BmSPI39抗血清的效價達1∶128 000(圖2:A)。親和層析結果顯示，在多克隆抗體的洗脫峰出現在洗脫體積30～35 mL之間，且峰值較高(圖2:B)。SDS-PAGE結果顯示，在表觀分子質量約55和28 kD處檢測到清晰的抗體重鏈和輕鏈條帶(圖2:C)，獲得了較高純度的BmSPI39多克隆抗體。

Western blot結果顯示，在BmSPI39重組蛋白二聚體和三聚體分子量大小處皆出現清晰的蛋白條帶，且BmSPI39重組蛋白主要以二聚體形式存在，少量以三聚體形式存在(圖3:D)。為排除樣品中雜蛋白非特異結合對Western blot結果的干擾，我們利用非還原SDS-PAGE對BmSPI39重組蛋白進行分離后，采用膠內活性染色法檢測其對枯草桿菌蛋白酶的抑制活性。結果顯示，IPTG誘導后的菌體上清中只檢測到BmSPI39蛋白的二聚體的活性條帶，純化后的BmSPI39重組蛋白中除檢測到很強的二聚體活性條帶外，還能檢測到微弱的三聚體活性條帶(圖2:E)。上述結果表明，制備的多克隆抗體能夠識別BmSPI39重組蛋白的各種形式，可用于BmSPI39生理功能的相關研究。

2.3 基于轉錄組數據的BmSPI39的時空表達分析

基于轉錄組數據的BmSPI39時空表達熱圖分析表明，BmSPI39在游走期和預蛹期的家蠶體壁中皆有表達，但在4齡第3天-5齡第3天之間及化蛹第1天的家蠶體壁中都不表達；BmSPI39在預蛹期的脂肪體中的表達量較高，但在各時期的中腸中均未檢測到表達(圖3)。

圖2 家蠶BmSPI39多克隆抗體的純化及Western blot分析Fig.2 Purification and Western blot analysis of anti-BmSPI39 polyclonal antibody of Bombyx moriA:BmSPI39抗血清的效價測定Titer determination of BmSPI39 antiserum;B:BmSPI39多克隆抗體的親和純化Affinity purification of anti-BmSPI39 polyclonal antibody;C:純化的BmSPI39多克隆抗體的SDS-PAGE分析SDS-PAGE analysis of the purified anti-BmSPI39 polyclonal antibody;D:基于Western blot技術的純化的BmSPI39多克隆抗體的抗原結合特性分析Analysis of antigen-binding properties of the purified anti-BmSPI39 polyclonal antibody by Western blot;E:經非還原SDS-PAGE分離后BmSPI39重組蛋白的膠內活性分析In-gel activity analysis of BmSPI39 recombinant protein after separation by non-reducing SDS-PAGE.Trimer:三聚體;Dimer:二聚體.FT&WF:流穿和漂洗部分Flow-through and washing fractions;EF:洗脫部分Elution fraction.

圖3 基于家蠶開放性數據庫SilkDB 3.0利用Heml1.0對BmSPI39在家蠶免疫相關的組織中的時空表達熱圖分析Fig.3 Heat map analysis of the spatiotemporal expression of BmSPI39 gene in immune-related tissues of Bombyx mori based on the open database SilkDB 3.0 using Heml 1.0

2.4 球孢白僵菌感染后家蠶體壁中BmSPI39蛋白的表達特征

接種后不同時間點幼蟲體壁中BmSPI39 的Western blot分析結果表明，接種白僵菌后36 h(吐絲期)和60 h(預蛹期)，對照組及2×106和 2×107孢子/mL孢子懸浮液處理組中的家蠶體壁中皆未檢測到BmSPI39的表達(圖4:A,D);接種后84 h(化蛹第1天)，BmSPI39的蛋白前體以同源四聚體和三聚體的形式表達于家蠶體壁中(圖4:B)，隨著家蠶的發(fā)育進程其N端信號肽被切除，形成成熟體蛋白的同源四聚體和三聚體(圖4:B,C)。與對照組相比，2×106和 2×107孢子/mL分生孢子孢子懸浮液接種家蠶后84 h時BmSPI39的表達量分別上調至2.29和1.45倍，108 h(化蛹第2天)時的表達量分別下調至0.39和0.54倍(圖4:E)。2×107孢子/mL分生孢子孢子懸浮液接種家蠶后120 h(化蛹第3天)時BmSPI39的表達量進一步下調至對照組的0.10倍(圖4:F)。上述結果提示，家蠶體壁中的BmSPI39蛋白的表達能夠響應球孢白僵菌的入侵過程，且在接種后84 h(化蛹第1天)表達響應至高峰，后下調低于未接種球孢白僵菌的對照組。

圖4 Western blot檢測感染孢白僵菌不同時間后家蠶幼蟲和蛹體壁中BmSPI39的表達量Fig.4 Expression levels of BmSPI39 in the integument of Bombyx mori larvae and pupae at different time after infection of Beauveria bassiana detected by Western blot幼蟲感染后時間Time post infection to larvae:A,D:36,60 h;B,E:84,108 h;C,F:120 h.α-tubulin:內參蛋白Reference protein;CK:空白對照組Blank control group;Bb1,Bb2:分別表示2×106和2×107孢子/mL分生孢子懸浮液處理組Groups treated with 2×106 and 2×107 conidia/mL of conidial suspension,respectively;Tr:蛋白三聚體Trimeric protein;Te:蛋白四聚體Tetrameric protein.Tr*:成熟體蛋白三聚體Trimeric mature protein;Te*:成熟體蛋白四聚體Tetrameric mature protein.圖D,E,F分別為圖A,B,C的相對表達量分析。Figures D,E and F are the relative expression level analysis of figures A,B and C,respectively.

3 討論

本研究成功制備了家蠶中TIL家族蛋白酶抑制劑BmSPI39的多克隆抗體，并基于該抗體蛋白發(fā)現家蠶體壁中的BmSPI39蛋白的表達能夠響應球孢白僵菌的入侵。

鎳柱親和純化后的BmSPI39重組蛋白經還原性SDS-PAGE分離后，在相對分子質量約為18 kD的位置出現一條豐度較高的單一條帶，其表觀分子量與BmSPI39重組蛋白的二聚體大小一致(圖1:B)。然而，純化后的蛋白有3條活性抑制活性帶，提示有多種活性存在形式(圖1:C)，這與我們前期的研究報道一致。我們的前期研究表明，家蠶TIL家族的BmSPI38和BmSPI39重組蛋白非還原條件下都傾向形成多聚體(Lietal.,2016a)，且多聚體化對這兩個抑制劑的活性至關重要(Lietal.,2018)。在還原劑和SDS存在條件下，BmSPI39重組蛋白的四聚體可轉換為更加穩(wěn)定的二聚體形式，其三聚體含量又低于考馬斯亮藍染色的檢測下限，因此在SDS-PAGE分析中只檢測到一條均一的二聚體條帶。截止目前文獻報道，這種多聚體化現象在典型TIL家族蛋白酶抑制劑中未見報道。Western blot分析和非還原SDS-PAGE分離后的膠內活性染色結果表明(圖2:D,E)，純化的BmSPI39重組蛋白主要以二聚體形式存在，少量以三聚體形式存在，制備的多克隆抗體能夠有效結合各種多聚體化狀態(tài)下的BmSPI39蛋白，可用于BmSPI39的檢測。需要指出的是，重組BmSPI39蛋白經非還原SDS-PAGE電泳分離后仍能保持活性可能與其特殊的高級結構有關。三維結構建模顯示，BmSPI39中只含有2個反平行的β折疊片以及一個小α螺旋，其余區(qū)域都是柔性的loop區(qū)域。其TIL結構域中含有4對二硫鍵(Cys29-Cys62,Cys40-Cys54,Cys44-Cys92和Cys64-Cys76)，這4對二硫鍵維持著蛋白剛性結構的穩(wěn)定，使大片的柔性loop區(qū)域形成一個相對緊湊而又具有一定柔性的穩(wěn)定結構(Lietal.,2016a)。因而，在SDS存在下仍能保持生物學活性。

體壁是蠶體最外的組織，在防止病原體入侵中發(fā)揮著重要作用。脂肪體是重要的中間代謝組織，也是抗菌肽合成的重要場所。有研究顯示，BmSPI39在5齡第5天家蠶幼蟲的前中部絲腺中高量特異表達，但在體壁和脂肪體中不表達(Lietal.,2016b)。為分析抗真菌因子BmSPI39是否在家蠶體壁和脂肪體中表達，基于SilkDB 3.0轉錄組數據，我們對BmSPI39在家蠶免疫相關組織中的表達特征進行分析。結果顯示BmSPI39在游走期和預蛹期的體壁及預蛹期的脂肪體中轉錄表達，而于上蔟前的家蠶幼蟲體壁和脂肪體中不表達(圖3)。

家蠶中有很多TIL家族的蛋白酶抑制劑參與家蠶對真菌入侵的免疫應答。我們前期運用基因芯片、半定量RT-PCR、qPCR等技術對添食感染球孢白僵菌后的家蠶幼蟲中的蛋白酶抑制劑基因表達進行分析，結果發(fā)現BmSPI37(BGIBMGA009073),BmSPI38(BGIBMGA009094),BmSPI39(BGIBMGA009092),BmSPI46(BGIBMGA004727),BmSPI48(BGIBMGA010892)等TIL家族蛋白酶抑制劑基因顯著上調表達(李游山等,2012;Zhaoetal.,2012)。邢東旭等利用體表接觸感染法接種“抗8”品系家蠶5齡第1天幼蟲，并采用RNA-Seq對接種球孢白僵菌后96 h的差異表達基因進行分析，結果顯示，與對照組相比，接種白僵菌的家蠶幼蟲中的BmSPI38,BmSPI39和BmSPI41(BGIBMGA009073)基因表達量顯著上調(Xingetal.,2017)。非標定量蛋白質組學分析顯示，接種球孢白僵菌36 h后的5齡幼蟲中的BmSPI35(GenBank登錄:XP_004924403)和BmSPI36(GenBank登錄:XP_004924401)皆下調表達(Luetal.,2019)。這些結果顯示，包括BmSPI39在內的多個TIL家族的蛋白酶抑制劑對家蠶幼蟲不同時期接種的球孢白僵菌都有一個顯著上調表達的響應，后表達響應下調，即存在一個對病原真菌入侵刺激的響應表達高峰。本研究Western blot檢測結果(圖4)也表明，對家蠶5齡末的游走期幼蟲(即上蔟吐絲期幼蟲)接種球孢白僵菌后，幼蟲體壁中的BmSPI39表達響應高峰在接種后84 h(化蛹第1天)，后表達響應下調，進一步證實了家蠶BmSPI39響應病原真菌入侵的表達特征。

筆者前期研究中利用不同濃度的球孢白僵菌接種剛進入游走期的家蠶幼蟲(即起始上蔟吐絲的家蠶幼蟲)，并對接種后不同時間點的幼蟲血淋巴中的蛋白酶抑制劑的活性表達特征進行分析。膠內活性染色結果顯示，家蠶蛹期血淋巴中存在一種真菌誘導型蛋白酶抑制劑SI-3，該抑制劑僅在球孢白僵菌接種組表達，且在接種后84 h(化蛹第1天)、108 h(化蛹第2天)和120 h(化蛹第3天)時表現出對枯草桿菌蛋白酶的抑制活性，其活性高峰在接種后84 h(李游山等,2018)。本研究發(fā)現，BmSPI39蛋白也在接種白僵菌后84 h(化蛹第1天)、108 h(化蛹第2天)和120 h(化蛹第3天)時的家蠶中表達，其表達響應高峰也出現在接種白僵菌后84 h(圖4)。鑒于BmSPI39與SI-3都能抑制劑枯草桿菌蛋白酶A活性，且對響應白僵菌入侵的表達特征基本一致，不排除它們?yōu)橥环N蛋白的可能性。由于膠內活性染色法的局限性和血淋巴中蛋白的復雜性，尚無法通過質譜鑒定等方法對SI-3蛋白進行鑒定。本研究僅對上蔟后家蠶體壁中的BmSPI39蛋白對白僵菌入侵的響應表達進行了分析，BmSPI39蛋白在蛹期家蠶中的抗真菌機制尚需進一步探究。