• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    白蠟窄吉丁氣味結(jié)合蛋白AplaOBP3的免疫定位及配體結(jié)合特性

    2021-03-10 02:23:46王澤華張永軍王山寧
    昆蟲學(xué)報(bào) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:感器白蠟己烯

    宋 玄,王澤華,單 雙,張永軍,王山寧,*

    (1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所,北京 100097;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,北京 100193)

    白蠟窄吉丁Agrilusplanipennis,又名花曲柳窄吉丁、梣小吉丁,屬鞘翅目(Coleoptera)吉丁科(Buprestidae),主要為害木犀科(Oleaceae)白蠟屬Fraxinus樹木(魏霞等,2004;趙同海等,2005)。該蟲原產(chǎn)于東亞,自2002年傳入北美,因其隱蔽性強(qiáng),防治極為困難,迄今已造成北美地區(qū)數(shù)百萬白蠟樹死亡,嚴(yán)重威脅多種白蠟屬樹木的生存(Anulewiczetal.,2008;Herms and McCullough,2014;Wendyetal.,2018)。氣味分子介導(dǎo)的該蟲寄主識(shí)別和種間通訊已經(jīng)被證實(shí)。白蠟葉片揮發(fā)物中至少發(fā)現(xiàn)16種化合物能誘發(fā)成蟲觸角電位反應(yīng),如順-3-己烯醇、乙酸順-3-己烯酯、反-2-己烯醛等,其中順-3-己烯醇對(duì)雄蟲有很強(qiáng)的誘集作用(Rodriguez-Saonaetal.,2006)。白蠟樹皮揮發(fā)物中的6種倍半萜,包括α-蒎烯、α-可巴烯、α-葎草烯等均對(duì)成蟲具有觸角活性,含有這些化合物的兩種植物油manuka oil和phoebe oil在野外對(duì)成蟲具有誘捕效果(Crooketal.,2008b)。白蠟窄吉丁雌蟲釋放的具有觸角活性的化合物(3Z)-lactone能夠吸引雄性,被認(rèn)為是該蟲的性信息素組分(Barteltetal.,2007)。目前已經(jīng)根據(jù)寄主植物揮發(fā)物和性信息素研制開發(fā)了白蠟窄吉丁的多種引誘劑(Crooketal.,2008b;Silketal.,2015,2019;Katieetal.,2020)。但是,人們對(duì)該蟲的化學(xué)通訊分子機(jī)制還不太了解。

    昆蟲感知外界化學(xué)信息的過程中,氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins,OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)、氣味受體(odorant receptors,ORs)和離子型受體(ionotropic receptors,IRs)等多種嗅覺相關(guān)蛋白發(fā)揮至關(guān)重要的作用(Clyneetal.,1999;Coutoetal.,2005;Bentonetal.,2009;Leal,2013;Joseph and Carlson,2015)。昆蟲氣味結(jié)合蛋白(OBPs)是一類小分子的水溶性蛋白,此類蛋白廣泛分布在昆蟲的各類感受器官中(Pelosietal.,2018)。在昆蟲觸角中,OBP蛋白由位于化學(xué)感受器下方的輔助細(xì)胞合成,隨后被大量分泌到感器腔的淋巴液中,參與結(jié)合、溶解、運(yùn)輸疏水性氣味分子,在昆蟲感受外界環(huán)境中的化學(xué)信號(hào)過程中發(fā)揮重要功能(Vogt and Riddiford,1981;Angelietal.,1999;Leal,2013;Pelosietal.,2014,2018)。

    昆蟲氣味結(jié)合蛋白廣泛存在不同昆蟲中,參與昆蟲信息化合物的識(shí)別。在鞘翅目昆蟲大黑鰓金龜Holotrichiaoblita觸角轉(zhuǎn)錄組中鑒定出29個(gè)OBP基因,其中HoblOBP9和HoblOBP13分別參與大黑鰓金龜雌蟲對(duì)寄主植物揮發(fā)物苯乙醇和反-2-苯烯醇的識(shí)別(Yinetal.,2019)。松墨天牛MonochamusalternatusMaltOBP1,MaltOBP3和MaltOBP5能夠與部分寄主植物揮發(fā)物結(jié)合,它們可能在松墨天牛的寄主選擇過程發(fā)揮功能(Gao and Wang,2015;Zhangetal.,2020)。蘋果小吉丁AgrilusmaliAmalOBP3在雌雄觸角中高表達(dá),能夠結(jié)合醇類和醛類等多種寄主揮發(fā)物(Cuietal.,2018)。本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)白蠟窄吉丁基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,鑒定了11個(gè)氣味結(jié)合蛋白,組織表達(dá)譜結(jié)果表明AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3在雌雄成蟲觸角特異表達(dá),熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明AplaOBP1和AplaOBP2能夠與多種寄主揮發(fā)物結(jié)合,它們?cè)诎紫炚〖闹髯R(shí)別中發(fā)揮功能(Wangetal.,2020;宋玄等,未發(fā)表數(shù)據(jù)),推測AplaOBP3同樣在白蠟窄吉丁嗅覺感受行為中發(fā)揮功能。

    為深入解析氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受中的功能,本研究進(jìn)一步對(duì)AplaOBP3蛋白進(jìn)行了原核表達(dá),利用免疫組化技術(shù)檢測了該蛋白的亞細(xì)胞定位,通過熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)AplaOBP3重組蛋白與58種化合物的結(jié)合特性進(jìn)行了分析,并對(duì)3種氣味結(jié)合蛋白(AplaOBP1-3)的表達(dá)及配體結(jié)合特性進(jìn)行比較,以期為闡明白蠟窄吉丁氣味結(jié)合蛋白參與寄主識(shí)別的化學(xué)感受機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 供試?yán)ハx

    于北京郊區(qū)白蠟林地,將受害白蠟樹截成約50 cm的木段帶回室內(nèi),置于養(yǎng)蟲籠罩內(nèi)待白蠟窄吉丁成蟲自然羽化,成蟲羽化后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒內(nèi),飼喂白蠟樹葉片進(jìn)行飼養(yǎng),成蟲飼養(yǎng)條件為溫度25±0.5℃,相對(duì)濕度60%±5%,光周期16L∶8D。

    1.2 AplaOBP3重組蛋白的表達(dá)與純化

    利用SignalP 3.0 Server在線程序(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/)預(yù)測白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白(GenBank登錄號(hào):XM_025977151.1)信號(hào)肽序列,去信號(hào)肽后的核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行化學(xué)合成并克隆到原核表達(dá)載體pET30a(+),轉(zhuǎn)化大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)。將單克隆陽性菌株接種于含100 mg/mL卡那霉素的培養(yǎng)基中37℃ 200 r/min搖床中培養(yǎng),待OD600值為0.6~0.8時(shí),加入IPTG至終濃度為1 mmol/L,在18℃ 160 r/min搖床中誘導(dǎo)16 h。超聲破碎后分別收集上清及包涵體。參照Prestwich (1993)的方法,進(jìn)行包涵體的復(fù)性和重折疊,即用含0.2% Triton X-100的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)沖洗包涵體,隨后將包涵體溶解在6 mol/L的鹽酸胍中,經(jīng)氧化還原處理后獲得可溶性蛋白。利用親和層析鎳柱純化,純化的重組蛋白經(jīng)腸激酶25℃孵育過夜處理后,再次用親和層析鎳柱純化,超濾濃縮后得到無His標(biāo)簽的AplaOBP3重組蛋白。通過4%~20% SDS-PAGE電泳檢測各階段目的蛋白的表達(dá)及純化情況。純化的目的蛋白送北京信諾晶科生物技術(shù)有限公司制備多克隆抗體。

    1.3 Western blot檢測

    收集白蠟窄吉丁成蟲觸角,使用組織蛋白抽提試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)提取觸角組織粗蛋白。采用4%-20% SDS-PAGE電泳對(duì)觸角組織粗蛋白和純化的重組蛋白AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3進(jìn)行分離,其中AplaOBP1和AplaOBP2重組蛋白由本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)獲得(Wangetal.,2020;宋玄等,數(shù)據(jù)未發(fā)表)。采用One Step Western Kit HRP(Rabbit)(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)進(jìn)行Western blot,檢測AplaOBP3多克隆抗體的特異性;通過高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,北京)進(jìn)行發(fā)光檢測;使用化學(xué)發(fā)光成像分析儀(AI680,GE,美國)進(jìn)行曝光及圖像采集。

    1.4 免疫組織化學(xué)定位檢測

    1.3節(jié)收集的白蠟窄吉丁觸角樣品送至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所電鏡室進(jìn)行固定、制樣包埋、切片、免疫染色及電鏡觀察。1.2節(jié)制備的AplaOBP3多克隆抗體按照1∶5 000 (v/v)稀釋使用,以未免疫的兔血清代替抗體作為陰性對(duì)照,詳細(xì)步驟參照本實(shí)驗(yàn)室前期報(bào)道(Wangetal.,2020),檢測AplaOBP3在白蠟窄吉丁觸角感器中的表達(dá)定位。

    1.5 熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

    為了與前期報(bào)道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的配體結(jié)合特性進(jìn)行比較,本研究選取了58種相同的化合物作為候選配體(表1),其中27種揮發(fā)物的選擇是來自于白蠟窄吉丁為害的寄主植物。使用F-380熒光分光光度計(jì)(天津港東科技發(fā)展股份有限公司)進(jìn)行熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn),激發(fā)波長337 nm,掃描發(fā)射波長范圍370~550 nm。采用N-苯基-1-萘胺 (N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)作為熒光探針。候選配體和熒光探針用色譜級(jí)甲醇溶解,配制成濃度為1 mmol/L的工作液。于PBS緩沖液(pH 7.4)中加入AplaOBP3重組蛋白,終濃度為2 μmol/L,再加入1-NPN,使探針濃度從2 μmol/L遞增至12 μmol/L,重復(fù)3次,測定熒光強(qiáng)度變化,計(jì)算AplaOBP3與探針的結(jié)合能力曲線和解離常數(shù)。將AplaOBP3加入PBS緩沖液(pH 7.4)中,終濃度為2 μmol/L,加入相同濃度的1-NPN,記錄熒光強(qiáng)度,隨后加入待測配體,濃度從2 μmol/L開始遞增至20 μmol/L,記錄熒光強(qiáng)度變化,重復(fù)3次。計(jì)算得出使熒光強(qiáng)度降低一半時(shí)的配體濃度,即IC50值。利用下列公式計(jì)算出配體解離常數(shù)KD∶KD=[IC50]/(1+[1-NPN]/K1-NPN),[1-NPN]是未結(jié)合的1-NPN的濃度,K1-NPN為AplaOBP3與1-NPN的解離常數(shù)(Guetal.,2011)。

    2 結(jié)果

    2.1 AplaOBP3的重組表達(dá)

    SDS-PAGE結(jié)果表明,氣味結(jié)合蛋白AplaOBP3重組蛋白在包涵體中表達(dá)(圖1),對(duì)包涵體進(jìn)行復(fù)性,通過親和層析獲得重組蛋白,腸激酶切去His標(biāo)簽后得到分子量約為14 kD的目的蛋白,用于抗體制備及競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

    2.2 Western blot檢測

    Western blot檢測了AplaOBP3多克隆抗體與白蠟窄吉丁觸角粗蛋白以及純化的AplaOBP1,AplaOBP2和AplaOBP3重組蛋白的結(jié)合特異性,結(jié)果表明,僅在觸角粗蛋白和AplaOBP3蛋白樣品中檢測到分子量約14 kD特異性條帶,表明AplaOBP3多克隆抗體僅與AplaOBP3蛋白結(jié)合,可以滿足后續(xù)的免疫組織化學(xué)檢測(圖2)。

    2.3 AplaOBP3在觸角中的表達(dá)定位

    免疫組化結(jié)果表明,黑色膠體金顆粒標(biāo)記的AplaOBP3蛋白分布在白蠟窄吉丁錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器下方(圖3)。錐形感器類型Ⅰ的感器壁具有明顯的微孔,是嗅覺感受器,推測AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁嗅覺感受過程中發(fā)揮著重要的作用。

    圖1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;1:未誘導(dǎo)的大腸桿菌菌體Non-induced Escherichia coli;2:經(jīng)IPTG誘導(dǎo)16 h的大腸桿菌菌體E.coli induced by 1 mmol/L IPTG for 16 h;3:上清液Supernatant;4:包涵體蛋白Inclusion body protein;5:帶His標(biāo)簽重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 with His-tag;6:無His標(biāo)簽的重組蛋白AplaOBP3 Recombinant AplaOBP3 without His-tag.

    圖2 白蠟窄吉丁AplaOBP3多克隆抗體的SDS-PAGE (A)和Western blot (B)檢測Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysis of the polyclonal antibody against AplaOBP3 of Agrilus planipennisM:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Protein molecular weight marker;1:提取自白蠟窄吉丁的觸角粗蛋白Crude protein extracted from antennae of A.planipennis;2:AplaOBP1重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP1;3:AplaOBP2重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP2;4:AplaOBP3重組蛋白R(shí)ecombinant AplaOBP3.

    圖3 AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁觸角的表達(dá)定位Fig.3 Expression localization of AplaOBP3 protein in the antenna of Agrilus planipennisA:顯示黑色顆粒標(biāo)記的AplaOBP3蛋白分布在錐形感器類型Ⅰ的感器腔及感器基部的縱切圖Longitudinal section showing that AplaOBP3 proteins labeled with black spots are distributed in the hair lumen and the base of the sensilla basiconica type I;B:錐形感器類型Ⅰ的感器腔Hair lumen of the sensilla basiconica type I;C:錐形感器類型Ⅰ的感器基部Base of the sensilla basiconica type I;D:顯示AplaOBP3蛋白在錐形感器類型Ⅰ的感器腔中表達(dá)的橫切圖,箭頭表示感器上的壁孔Cross section showing the expression of AplaOBP3 protein at the hair lumen of sensilla basiconica type I,arrows indicating the wall pores on the sensillum;E:顯示未免疫的兔血清陰性對(duì)照未被標(biāo)記的縱切圖Longitudinal section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled;F:顯示未免疫的兔血清陰性對(duì)照未被標(biāo)記的橫切圖Cross section showing that the negative control of unimmunized rabbit serum was not labeled.

    2.4 AplaOBP3重組蛋白配體結(jié)合特征

    熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AplaOBP3與熒光探針1-NPN的解離常數(shù)為0.4 μmol/L,1-NPN和重組蛋白AplaOBP3的結(jié)合曲線及Scatchard方程見圖4 (A)。AplaOBP3與候選配體的結(jié)合曲線(圖4:B)和解離常數(shù)(表1)可以看出,在58種氣味揮發(fā)物中,AplaOBP3可以特異性結(jié)合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮、β-紫羅蘭酮和羅勒烯,AplaOBP3與β-紫羅蘭酮結(jié)合能力最強(qiáng),解離常數(shù)為1.72 μmol/L,與苯甲醛的結(jié)合能力次之,其解離常數(shù)為4.03 μmol/L,與反-2-己烯醛的結(jié)合能力最弱,其解離常數(shù)為6.20 μmol/L。

    2.5 AplaOBP3與AplaOBP1和AplaOBP2的表達(dá)及配體結(jié)合特性比較

    AplaOBP3與前期報(bào)道的白蠟窄吉丁AplaOBP1和AplaOBP2蛋白的表達(dá)及配體結(jié)合特性(表2)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),AplaOBP3與AplaOBP2具有相似的表達(dá)及配體結(jié)合特性,但與AplaOBP1的明顯不同。AplaOBP3和AplaOBP2均在觸角錐形感器類型I表達(dá),而AplaOBP1在錐形感器類型I和III均表達(dá)。在58種候選配體中,共有15種化合物至少與一種AplaOBP重組蛋白結(jié)合。與AplaOBP3結(jié)合的5種配體中,其中4種(反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮)也與AplaOBP2結(jié)合,而與AplaOBP1結(jié)合的多數(shù)配體與AplaOBP3和AplaOBP2不結(jié)合,其中僅羅勒烯與AplaOBP3結(jié)合。

    圖4 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3的結(jié)合特征Fig.4 Binding properties of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennisA:1-NPN和AplaOBP3的結(jié)合曲線及Scatchard方程Binding curve and Scatchard plot of 1-NPN to AplaOBP3;B:AplaOBP3與候選配體的結(jié)合曲線Binding curves of AplaOBP3 to candidate ligands.

    3 討論

    白蠟窄吉丁觸角上分布有3種多孔的錐形感器,在雌雄成蟲感受外界嗅覺刺激信號(hào)中發(fā)揮著重要的作用(Crooketal.,2008a)。免疫組化結(jié)果表明,AplaOBP3蛋白在白蠟窄吉丁錐形感器類型I中表達(dá),推測AplaOBP3可能與嗅覺感受有關(guān)。本研究選擇58種揮發(fā)物作為候選配體,其中包括27種寄主揮發(fā)物,AplaOBP3重組蛋白能與多種揮發(fā)物結(jié)合,其中與AplaOBP3重組蛋白結(jié)合的5種配體中,3種配體即羅勒烯、反-2-己烯醛和4′-乙基苯乙酮屬于白蠟窄吉丁寄主植物白蠟樹的葉片揮發(fā)物,它們可以引起白蠟窄吉丁EAG反應(yīng),并且反-2-己烯醛對(duì)白蠟窄吉丁具有吸引作用(Rigsbyetal.,2017;Wangetal.,2020;宋玄等,未發(fā)表數(shù)據(jù)),表明AplaOBP3可能在白蠟窄吉丁選擇寄主植物過程中發(fā)揮重要嗅覺感受功能。AplaOBP3和AplaOBP2表現(xiàn)出大致相同的表達(dá)及配體結(jié)合特征,它們均可結(jié)合反-2-己烯醛、苯甲醛、4′-乙基苯乙酮和β-紫羅蘭酮。Zhong等(2018)的研究發(fā)現(xiàn)茶翅蝽5種OBPs與報(bào)警信息素組分反-2-癸烯醛具有強(qiáng)的結(jié)合能力。蘋果小吉丁OBP2和OBP8與十二醇、橙花醇、法尼醇和十二烷等多種配體均具有強(qiáng)的結(jié)合能力(Cuietal.,2018)。因此,昆蟲中不同種類的氣味結(jié)合蛋白能夠結(jié)合同一種揮發(fā)物,推測可能共同參與某種化合物的識(shí)別。

    表1 白蠟窄吉丁重組蛋白AplaOBP3與候選配體結(jié)合能力Table 1 Binding capabilities of the recombinant AplaOBP3 of Agrilus planipennis to candidate ligands

    續(xù)表1 Table 1 continued

    表2 3種AplaOBP蛋白表達(dá)及配體結(jié)合特征比較Table 2 Comparison of expression and ligand binding characteristics of three AplaOBP proteins

    順-3-己烯醇是白蠟葉片揮發(fā)物重要組分,其可以引起白蠟窄吉丁的EAG反應(yīng),且對(duì)白蠟窄吉丁具有誘集活性,已應(yīng)用于商業(yè)化誘餌關(guān)鍵組分(Rodriguez-Saonaetal.,2006;Grantetal.,2010,2011)。目前,未發(fā)現(xiàn)一種AplaOBP蛋白能夠與順-3-己烯醇結(jié)合。白蠟窄吉丁11個(gè)AplaOBPs中,除觸角特異表達(dá)的3個(gè)AplaOBPs以外,AplaOBP6和AplaOBP7基因在觸角的表達(dá)量高于其他組織(Wangetal.,2020),它們是否能夠與順-3-己烯醇結(jié)合還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。另外,其他水溶性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如化學(xué)感受蛋白(CSPs)也可能參與寄主揮發(fā)物的識(shí)別。Andersson等(2019)對(duì)白蠟窄吉丁基因組進(jìn)行分析,共注釋了14個(gè)AplaCSPs基因。目前,關(guān)于AplaCSPs在白蠟窄吉丁化學(xué)感受中的功能未見報(bào)道。我們推測觸角特異或高表達(dá)的AplaCSPs也很有可能參與順-3-己烯醇等寄主揮發(fā)物的識(shí)別。

    綜上,本研究對(duì)白蠟窄吉丁AplaOBP3蛋白在觸角感器中的定位進(jìn)行了解析,通過體外功能研究的方法證明AplaOBP3可能參與白蠟窄吉丁對(duì)寄主植物揮發(fā)物的識(shí)別,同時(shí)比較了AplaOBP3與已報(bào)道的AplaOBP1和AplaOBP2的配體結(jié)合異同,為闡明氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識(shí)別中的功能奠定了一定基礎(chǔ),也為基于氣味結(jié)合蛋白的功能篩選白蠟窄吉丁新的信息化合物提供了依據(jù)。然而,對(duì)于氣味結(jié)合蛋白在白蠟窄吉丁寄主識(shí)別中的具體生理功能還需進(jìn)一步通過基因干擾或基因編輯進(jìn)行驗(yàn)證。

    猜你喜歡
    感器白蠟己烯
    十氟己烯在兩相浸沒式冷卻系統(tǒng)中的應(yīng)用
    咖啡果小蠹成蟲觸角感器的掃描電鏡觀察
    白蠟種質(zhì)資源收集保存及應(yīng)用研究
    白蠟外齒莖蜂防治試驗(yàn)研究
    某型壓氣機(jī)溫度受感器恢復(fù)特性研究
    電子測試(2018年18期)2018-11-14 02:30:16
    對(duì)節(jié)白蠟盆景欣賞(下)
    花卉(2016年12期)2016-12-10 08:06:48
    竹斑蛾觸角感器電鏡掃描觀察
    擬龜紋圓瓢蠟蟬觸角掃描電鏡觀察
    環(huán)己烯制備實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)
    酸洗條件對(duì)未漂硫酸鹽麥草漿己烯糖醛酸去除的影響
    中國造紙(2014年1期)2014-03-01 02:10:08
    精品午夜福利在线看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 不卡一级毛片| 看片在线看免费视频| 性欧美人与动物交配| 搡老妇女老女人老熟妇| 日日撸夜夜添| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日日干狠狠操夜夜爽| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产毛片a区久久久久| 国产色爽女视频免费观看| 久久99热6这里只有精品| 日韩av在线大香蕉| 深夜a级毛片| 亚洲av五月六月丁香网| 赤兔流量卡办理| 久久久久久久久久黄片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美区成人在线视频| 亚洲电影在线观看av| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 国产高清三级在线| 国产亚洲欧美98| 1024手机看黄色片| av视频在线观看入口| 国产成人福利小说| 色吧在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日本黄色视频三级网站网址| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 欧美3d第一页| 久久久色成人| 亚洲国产精品成人综合色| 床上黄色一级片| 免费av毛片视频| 久久人人精品亚洲av| 1000部很黄的大片| 久久久久国产网址| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 精品日产1卡2卡| 男人和女人高潮做爰伦理| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲av中文av极速乱| av.在线天堂| 国产毛片a区久久久久| 国产免费男女视频| 久久久欧美国产精品| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产在视频线在精品| 精品无人区乱码1区二区| 超碰av人人做人人爽久久| 色综合站精品国产| 国产高清视频在线观看网站| 免费av毛片视频| 亚洲美女视频黄频| 村上凉子中文字幕在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美日韩综合久久久久久| 尾随美女入室| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品电影一区二区三区| 国产在线精品亚洲第一网站| 又爽又黄a免费视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 99热6这里只有精品| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 一个人观看的视频www高清免费观看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲熟妇熟女久久| 十八禁网站免费在线| 麻豆国产97在线/欧美| 男女下面进入的视频免费午夜| 2021天堂中文幕一二区在线观| 午夜福利在线在线| 在线观看av片永久免费下载| 日本黄色视频三级网站网址| 国产熟女欧美一区二区| 免费av不卡在线播放| 搞女人的毛片| av在线亚洲专区| 亚洲av成人精品一区久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品久久电影中文字幕| 久久99热6这里只有精品| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜爱爱视频在线播放| 精品欧美国产一区二区三| 成人无遮挡网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美一区二区亚洲| 久久久久久国产a免费观看| 久久人人爽人人爽人人片va| av免费在线看不卡| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久国产乱子免费精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 婷婷精品国产亚洲av在线| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲美女黄片视频| 村上凉子中文字幕在线| 国产精品无大码| 国产av在哪里看| 日本五十路高清| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 丰满的人妻完整版| 久久精品国产清高在天天线| av免费在线看不卡| 十八禁网站免费在线| 久久久久久国产a免费观看| 91久久精品国产一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲七黄色美女视频| 免费人成视频x8x8入口观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 最后的刺客免费高清国语| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 六月丁香七月| 成人无遮挡网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 日韩亚洲欧美综合| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品一区www在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 精品无人区乱码1区二区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久九九热精品免费| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产真实乱freesex| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 免费在线观看成人毛片| 少妇熟女欧美另类| 一级av片app| 久久精品夜色国产| 简卡轻食公司| 麻豆乱淫一区二区| 干丝袜人妻中文字幕| 在线免费观看不下载黄p国产| 三级毛片av免费| 成年免费大片在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 精品福利观看| 国语自产精品视频在线第100页| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 亚洲精品一区av在线观看| 国产男靠女视频免费网站| 日韩一本色道免费dvd| 日韩欧美 国产精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 日本五十路高清| 国产精品无大码| 免费看a级黄色片| 美女免费视频网站| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人鲁丝片一二三区免费| 91精品国产九色| 真实男女啪啪啪动态图| 日韩欧美在线乱码| 久久久久国产网址| 欧美区成人在线视频| 日韩人妻高清精品专区| av国产免费在线观看| 亚洲av免费在线观看| 欧美一区二区亚洲| 一区二区三区免费毛片| 好男人在线观看高清免费视频| 国产视频内射| 欧美高清性xxxxhd video| 久久久a久久爽久久v久久| 成人精品一区二区免费| 亚洲性久久影院| h日本视频在线播放| 精品一区二区三区人妻视频| 久久热精品热| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 91久久精品国产一区二区成人| 久久九九热精品免费| 国产日本99.免费观看| 精品日产1卡2卡| 精品久久久噜噜| 国产精品不卡视频一区二区| 免费av不卡在线播放| 日韩人妻高清精品专区| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产精品,欧美在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 欧美成人一区二区免费高清观看| 在线免费十八禁| 亚洲人成网站在线播| 亚洲人成网站在线观看播放| 欧美不卡视频在线免费观看| 成年女人看的毛片在线观看| av中文乱码字幕在线| 国产高清激情床上av| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丝袜美腿在线中文| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| av在线老鸭窝| 色5月婷婷丁香| 免费在线观看影片大全网站| 国产精品福利在线免费观看| av免费在线看不卡| 97在线视频观看| 毛片一级片免费看久久久久| 国产成人aa在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 高清毛片免费看| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美不卡视频在线免费观看| 欧美三级亚洲精品| 久久人人精品亚洲av| 亚州av有码| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品女同一区二区软件| 日本一二三区视频观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲性久久影院| 精品一区二区三区视频在线观看免费| av天堂在线播放| 国产私拍福利视频在线观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲精品影视一区二区三区av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产免费男女视频| 亚洲色图av天堂| 国产精品无大码| 亚洲无线在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻人人看人人澡| 全区人妻精品视频| av在线观看视频网站免费| 天堂动漫精品| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产一区二区在线观看日韩| 直男gayav资源| 精品久久久久久久久久免费视频| 大香蕉久久网| 无遮挡黄片免费观看| 哪里可以看免费的av片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲在线自拍视频| 黄色日韩在线| 亚洲美女黄片视频| 国产一区二区激情短视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 91狼人影院| 中文字幕av成人在线电影| 亚州av有码| 一级毛片我不卡| 欧美另类亚洲清纯唯美| 免费av观看视频| 国内精品美女久久久久久| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品女同一区二区软件| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 亚洲精品成人久久久久久| 变态另类丝袜制服| 俺也久久电影网| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲无线观看免费| 亚洲av中文av极速乱| 变态另类丝袜制服| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 不卡视频在线观看欧美| 嫩草影视91久久| 久久久久久久久大av| 亚洲av一区综合| 韩国av在线不卡| 国产精品野战在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 色吧在线观看| 俺也久久电影网| 国产久久久一区二区三区| 国产成人freesex在线 | 国内精品宾馆在线| 十八禁国产超污无遮挡网站| 婷婷精品国产亚洲av| 午夜福利18| 露出奶头的视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 啦啦啦韩国在线观看视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产精品久久久久久精品电影| 嫩草影院新地址| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线国产一区二区在线| av在线观看视频网站免费| 精品久久久久久久久av| 久久久久九九精品影院| 午夜久久久久精精品| 亚洲成人av在线免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久韩国三级中文字幕| 色视频www国产| 97超碰精品成人国产| 精品人妻偷拍中文字幕| a级毛片免费高清观看在线播放| 在现免费观看毛片| 亚洲人成网站高清观看| 国产视频一区二区在线看| 精品一区二区免费观看| 欧美日韩乱码在线| 久久草成人影院| 少妇熟女aⅴ在线视频| 看非洲黑人一级黄片| 性色avwww在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲经典国产精华液单| 少妇丰满av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产探花极品一区二区| 搡老岳熟女国产| 欧美在线一区亚洲| 老司机福利观看| 久久久久国产网址| 日韩精品有码人妻一区| 色播亚洲综合网| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲电影在线观看av| 黑人高潮一二区| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产免费一级a男人的天堂| 天堂√8在线中文| 久久人人爽人人片av| 日韩成人伦理影院| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 色视频www国产| 久久久久国产网址| 热99在线观看视频| 成人无遮挡网站| 丝袜喷水一区| 我的老师免费观看完整版| 国产成年人精品一区二区| 精品一区二区三区视频在线| 99久久精品一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| 丰满乱子伦码专区| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久色成人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 美女免费视频网站| 久久精品国产亚洲av天美| 日韩高清综合在线| 国产真实乱freesex| 美女被艹到高潮喷水动态| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜激情欧美在线| 内射极品少妇av片p| 精品人妻视频免费看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产黄色小视频在线观看| 99热这里只有精品一区| 欧美日韩综合久久久久久| 久久99热这里只有精品18| 午夜福利在线观看吧| 观看免费一级毛片| 亚洲成人久久性| 美女黄网站色视频| 国产淫片久久久久久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜爱爱视频在线播放| 成人精品一区二区免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费大片18禁| 午夜精品国产一区二区电影 | 日韩av不卡免费在线播放| 国产欧美日韩精品亚洲av| 热99re8久久精品国产| 国产探花极品一区二区| eeuss影院久久| 日韩高清综合在线| 99热这里只有是精品50| 12—13女人毛片做爰片一| 深爱激情五月婷婷| 国产单亲对白刺激| 日韩精品中文字幕看吧| 丰满人妻一区二区三区视频av| 插阴视频在线观看视频| 成人一区二区视频在线观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产精品一区二区性色av| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品国产精品| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲不卡免费看| 99久久九九国产精品国产免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品乱码一区二三区的特点| 99久久中文字幕三级久久日本| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产精品国产高清国产av| 亚洲精品一区av在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产探花在线观看一区二区| av在线观看视频网站免费| 午夜老司机福利剧场| av专区在线播放| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男人和女人高潮做爰伦理| 搞女人的毛片| 在线免费观看的www视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 国产精品女同一区二区软件| 日韩欧美国产在线观看| 久久久午夜欧美精品| 可以在线观看毛片的网站| 成人av在线播放网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 简卡轻食公司| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲内射少妇av| 亚洲美女搞黄在线观看 | 一级毛片我不卡| 日韩成人伦理影院| 国产一区二区三区av在线 | 最近手机中文字幕大全| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产精品一及| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品免费久久久久久久清纯| 日本在线视频免费播放| 久久久午夜欧美精品| 午夜老司机福利剧场| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费高清视频大片| 成熟少妇高潮喷水视频| 1000部很黄的大片| av卡一久久| 亚洲无线观看免费| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99久国产av精品| 悠悠久久av| 夜夜爽天天搞| 国产精品不卡视频一区二区| 黑人高潮一二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 性插视频无遮挡在线免费观看| 18+在线观看网站| 99热只有精品国产| 特大巨黑吊av在线直播| 91久久精品电影网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品无大码| 久久久国产成人免费| 黄色欧美视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产精品久久视频播放| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 日日啪夜夜撸| av在线播放精品| 天堂网av新在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 好男人在线观看高清免费视频| 天天一区二区日本电影三级| 成人特级av手机在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人三级黄色视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费av不卡在线播放| 免费大片18禁| a级一级毛片免费在线观看| 久久99热这里只有精品18| 男人狂女人下面高潮的视频| 在线观看av片永久免费下载| 亚洲欧美清纯卡通| 久久鲁丝午夜福利片| 18禁在线播放成人免费| 99久久精品一区二区三区| 亚洲av.av天堂| 内地一区二区视频在线| 日本五十路高清| 久久久国产成人免费| 免费av不卡在线播放| а√天堂www在线а√下载| 欧美高清成人免费视频www| 国产男人的电影天堂91| 高清毛片免费看| 91av网一区二区| 国产日本99.免费观看| 国产精品一区二区性色av| 男女视频在线观看网站免费| 伊人久久精品亚洲午夜| 99九九线精品视频在线观看视频| av专区在线播放| 亚洲18禁久久av| av黄色大香蕉| 美女免费视频网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 婷婷精品国产亚洲av在线| 精品一区二区三区视频在线| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美激情国产日韩精品一区| 91久久精品国产一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精品久久电影中文字幕| 日本色播在线视频| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 一级毛片久久久久久久久女| 真人做人爱边吃奶动态| АⅤ资源中文在线天堂| 国产精品一区二区免费欧美| 日日撸夜夜添| 久久久久久久久久久丰满| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲欧美精品综合久久99| 深夜a级毛片| 秋霞在线观看毛片| ponron亚洲| 一本一本综合久久| 精品一区二区三区人妻视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲经典国产精华液单| 最近中文字幕高清免费大全6| 国产免费男女视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产伦一二天堂av在线观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲无线观看免费| 99九九线精品视频在线观看视频| a级一级毛片免费在线观看| 久久精品影院6| 国内精品久久久久精免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产综合懂色| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 亚洲国产精品sss在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 村上凉子中文字幕在线| 久久久国产成人精品二区| 精品人妻视频免费看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 日韩中字成人| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产久久久一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲不卡免费看| 美女黄网站色视频| 丝袜喷水一区| 免费高清视频大片| 可以在线观看毛片的网站| 国产一区二区在线av高清观看| 波多野结衣巨乳人妻| 露出奶头的视频| 搞女人的毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久久九九精品影院| av在线蜜桃| 可以在线观看的亚洲视频| 国产男靠女视频免费网站| 免费看日本二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看|