加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8/SVneo細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激JNK信號通路的凋亡作用

簡詠男 鄭文蘭

1.貴州中醫(yī)藥大學研究生院，貴州貴陽 550002；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院婦科，貴州貴陽 550000

異位妊娠（ectopic pregnancy，EP）是指孕卵在子宮體腔以外著床，其中輸卵管妊娠最為常見，占95%左右[1]。隨著患者逐漸年輕化及二孩政策的開放，要求保留生育功能的患者增多[2]，因此中醫(yī)藥的應用也受到了相應的重視。加味宮外孕Ⅱ號方治療EP 在貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院應用多年，其臨床療效好，前期研究表明該方有破壞滋養(yǎng)細胞超微結(jié)構(gòu)、誘導細胞凋亡的作用[3]，但殺胚的具體機制尚不清楚。據(jù)文獻報道，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（ERS）誘導細胞凋亡，是一條新的細胞凋亡信號傳導通路，許多疾病的防治都與過度ERS 引起的細胞凋亡有關(guān)[4]，但加味宮外孕Ⅱ號方是否通過ERS 途徑發(fā)揮藥效來治療EP 尚未見報道。本研究以人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞株（HTR-8/SVneo）細胞作為研究對象，采用Western blot 及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法，探討加味宮外孕Ⅱ號方對滋養(yǎng)細胞凋亡的相關(guān)機制，為臨床上加味宮外孕Ⅱ號方保守治療EP 提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞

SPF 級SD 健康雌性大鼠36 只，體重180～220 g，購于湖北省實驗動物研究中心，本實驗通過湖北省實驗動物管理與使用委員會批準（20182901），實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2015-0018，每次灌胃前禁食12 h，不禁水，給藥2 h 后恢復食物；HTR-8/SVneo購于華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院。

1.2 實驗藥物

加味宮外孕Ⅱ號方（丹參15 g、赤芍15 g、桃仁9 g、三棱9 g、莪術(shù)9 g、蜈蚣4 g、全蝎6 g、土鱉蟲10 g、紫草25 g）由貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，水煎濃縮成3 g/mL 的藥液，4℃保存?zhèn)溆?；甲氨喋呤：廣東嶺南制藥有限公司，批號：872016。

1.3 主要儀器及試劑

qRT-PCR 儀（美國ABI）；離心機（湖南湘儀）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司；P0010）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Q111-02）；引物合成（武漢擎科生物技術(shù)有限公司）；兔抗GAPDH 一抗（杭州賢至生物科技有限公司；AB-P-R 001）；兔抗IRE1一抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；27528-1-AP）；兔抗TRAF2、ASK1 一抗及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（武漢博士德生物工程有限公司；BA1444-2、BM4220、BA1054）；兔抗JNK1、JNK2、p-JNK 一抗（英國Abcam；ab199380、ab76125、ab4821）。

1.4 含藥血清的制備

36 只大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，采用隨機數(shù)字表法分為六組，即陰性對照組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥結(jié)合組，每組6 只。由人與大鼠等效劑量換算，以成人（體重以60 kg 計）每日用藥量的等效劑量比1∶7[5]為加味宮外孕Ⅱ號方低劑量組給藥劑量，低劑量的2 倍為中劑量組，低劑量的4 倍為高劑量組給藥劑量，即加味宮外孕Ⅱ號方低、中、高灌胃劑量分別為12、24、48 g/（kg·d）；陰性對照組予中藥中劑量等體積的生理鹽水灌胃；西藥組予中藥中劑量等體積的生理鹽水灌胃，并在取血前1 h 一次性肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg；中西藥結(jié)合組予中藥中劑量灌胃，并在取血前1 h 一次性肌注甲氨喋呤7.775 mg/kg。中藥及生理鹽水灌胃為1 次/d，連續(xù)8 d；西藥1 次為1 個療程。于末次給藥1 h 后在麻醉下行心臟采血，將取得的血液標本靜置2 h，3000 r/min離心10 min，離心半徑為12.5 cm，吸取血清，微孔濾器過濾，水浴滅活，將同組血清混合，各組分裝，-80℃冰箱保存。

1.5 細胞培養(yǎng)和干預

將HTR-8/SVneo 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）+1%青鏈霉素（penicillin-streptomycin solution）的1640 培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)條件為37℃恒溫培養(yǎng)，二氧化碳濃度為5%，待細胞的密度達到80%時，用胰蛋白酶消化傳代。取第5 代對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo 細胞隨機分為七組，即空白對照組，陰性對照組，中藥低、中、高劑量組，西藥組，中西藥結(jié)合組，培養(yǎng)24 h。再將各組別的含藥血清分別與相對應組別的細胞共培養(yǎng)，24 h 后收集細胞用于后續(xù)實驗?？瞻讓φ战M為未用血清處理的細胞，以排除血清成分復雜所帶來的干擾。

1.6 Western blot 法

Western blot 法測定IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達，具體參照前期課題組方法[6]。

1.7 qRT-PCR 法

qRT-PCR 法 測 定IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 基因表達具體，參照前期課題組方法[6]。引物序列及產(chǎn)物大小詳見表1。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 25.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間均數(shù)兩兩比較采用LSD 及S-N-K 分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較

與空白對照組比較，陰性對照組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與陰性對照組比較，中藥各劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組除JNK1、JNK2 外，IRE1α、TRAF2、ASK1、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組中TRAF2 蛋白表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），在中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組中TRAF2 蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組IRE1α、ASK1、p-JNK蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組中ASK1 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05），西藥組及中西藥結(jié)合組ASK1 蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組IRE1α、TRAF2、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥高劑量組比較，西藥組TRAF2 蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），中西藥結(jié)合組TRAF2 蛋白表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與中藥高劑量組比較，西藥組及中西藥結(jié)合組IRE1α、ASK1、p-JNK 蛋白表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與西藥組比較，中西藥結(jié)合組IRE1α 蛋白表達量無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），ASK1 蛋白表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），而TRAF2、p-JNK 蛋白表達量均減少，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖1、表2。

表1 基因引物序列及大小

2.2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較

圖1 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達的電泳圖

與空白對照組比較，陰性對照組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05）。與陰性對照組比較，中藥各劑量組、西藥組及中西藥結(jié) 合 組IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組中TRAF2、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05），中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組TRAF2、JNK2 mRNA 表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組IRE1α、ASK1、JNK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組ASK1 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05），西藥組和中西藥結(jié)合組ASK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組、西藥組及中西藥結(jié)合組IRE1α、TRAF2、JNK1、JNK2 mRNA表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）；與中藥高劑量組比較，西藥組和中西藥結(jié)合組IRE1α、JNK1 mRNA 表達量均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05），西藥組和中西藥結(jié)合組TRAF2、ASK1、JNK2 mRNA 表達量無明顯變化（P ＞0.05）；與西藥組比較，中西藥結(jié)合組IRE1α、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA表達量無明顯變化（P ＞0.05），TRAF2 mRNA 表達量減少，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較（±s，n=3）

表2 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2、p-JNK 蛋白表達情況比較（±s，n=3）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，★P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，◆P ＜0.05；與西藥組比較，△P ＜0.05

表3 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較（±s，n=3）

表3 各組HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 表達情況比較（±s，n=3）

注：與陰性對照組比較，*P ＜0.05；與中藥低劑量組比較，▲P ＜0.05；與中藥中劑量組比較，★P ＜0.05；與中藥高劑量組比較，◆P ＜0.05；與西藥組比較，△P ＜0.05

3 討論

細胞凋亡為細胞的程序性死亡，凋亡過程受細胞內(nèi)一系列分子的調(diào)控[7]。MAPK 為一類絲蛋白/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)外信號傳導的主要傳導分子之一[8]。JNK 信號通路是MAPK 家族主要成分之一，在細胞凋亡中也是重要的信號通路，與多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-13]。已有研究表明，JNK 信號通路參與了過度ERS 所引發(fā)的細胞凋亡[14]。最新研究表明ERS 是誘導細胞凋亡的關(guān)鍵分子機制，現(xiàn)階段研究認為ERS 發(fā)生的主要原因是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊蛋白功能異常，導致錯誤蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)堆積，短時間的ERS 是細胞自我修復的一種方法，但長期ERS 發(fā)生即可引起細胞凋亡[15-16]。ERS 需3 種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白即PERK、IRE1 和ATF6介導[17]。

IRE1 是ERS 的傳感器，它可以將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應激信號傳遞給細胞質(zhì)和細胞核[18]，其自身具有核酸內(nèi)切酶活性，IRE1α 是其中一種亞型，廣泛存在于各種細胞中[19]。在非ERS 條件下，IRE1α 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶結(jié)合在一起，處于無活性的狀態(tài)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)異常折疊的蛋白聚集引起ERS 反應時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶就會與IRE1α 解離，活化后的IRE1α 可以募集TRAF2，IRE1α 與TRAF2 共同激活ASK1，形成IRE1α/TRAF2/ASK1 三聚體，可促使JNK 的磷酸化激活形成p-JNK[20]，最終導致細胞凋亡。Chen 等[21]認為IRE1 是決定細胞生存或者凋亡的關(guān)鍵，因此可通過檢測IRE1α 來判斷是否發(fā)生了過度ERS，那么，在HTR-8/SVneo 細胞中是否也存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白IRE1α 的激活呢？鄧高丕課題組認為體外培養(yǎng)的輸卵管妊娠滋養(yǎng)細胞與正常宮內(nèi)早孕滋養(yǎng)細胞相似，故選用HTR-8/SVneo 細胞進行研究[22]。為了排除大鼠含藥血清對實驗結(jié)果的干擾，故設未用含藥血清處理的細胞作為空白對照組。本實驗研究運用Western blot 及qRT-PCR技術(shù)檢測加味宮外孕Ⅱ號方對HTR-8/SVneo 細胞JNK信號通路各凋亡調(diào)控因子蛋白及mRNA 的影響。結(jié)果顯示，陰性對照組和空白對照組結(jié)果各指標比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），提示含藥血清未對實驗造成干擾，與陰性對照組比較，無論是中藥各劑量組、西藥組還是中西藥結(jié)合組，HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α 蛋白及mRNA 均高水平表達，說明加味宮外孕Ⅱ號方和甲氨蝶呤均能通過持續(xù)激活IRE1α 進而誘發(fā)細胞發(fā)生過度ERS。與陰性對照組比較，中藥及西藥組處理后的HTR-8/SVneo 細胞中IRE1α、TRAF2、ASK1、p-JNK 蛋白與IRE1α、TRAF2、ASK1、JNK1、JNK2 mRNA 的表達量均上調(diào)，說明經(jīng)加味宮外孕Ⅱ號方和甲氨蝶呤干預后，HTR-8/SVneo 細胞內(nèi)JNK 信號通路被激活，活化的JNK 通路可誘導細胞凋亡[23]。因此，加味宮外孕Ⅱ號方治療EP 的機制可能與加味宮外孕Ⅱ號方能激活ERS JNK 信號通路，進而促進細胞凋亡有關(guān)。中藥及西藥組處理后的HTR-8/SVneo細胞中JNK1、JNK2 蛋白表達與陰性對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05），但基因表達增加，考慮可能是因為JNK1、JNK2 剪切激活時受到了抑制[24]。另外中藥低、中、高劑量組IRE1α、p-JNK 蛋白和IRE1α、JNK1 mRNA 表達量逐漸增加，且P ＜0.05，提示中藥各劑量組可能呈劑量相關(guān)性，劑量越高，促凋亡作用越強，此結(jié)果與鄭文蘭等[25]研究結(jié)果一致，對指導臨床用藥劑量的選擇具有參考價值。

此外，從本研究結(jié)果看，單純西藥組在上調(diào)IRE1、TRAF2、p-JNK 蛋白表達上優(yōu)于單純中藥組和中西藥結(jié)合組，且P ＜0.05，提示JNK 信號通路中甲氨蝶呤發(fā)揮促凋亡的作用最強。而本課題組前期研究中，加味宮外孕Ⅱ號方在Caspase-12 通路中促細胞凋亡作用最好[6]。此差異性說明加味宮外孕Ⅱ號方誘導細胞凋亡可能存在不同的分子機制，還可能受到其他凋亡通路的調(diào)控，故JNK 通路并不是加味宮外孕Ⅱ號方誘導細胞凋亡的唯一通路。

綜上所述，本研究顯示加味宮外孕Ⅱ號方含藥血清可以促進HTR-8/SVneo 細胞凋亡，JNK 信號通路的激活可能是其中的機制之一。