基因突變與α-突觸核蛋白在帕金森病的研究進(jìn)展

胡春波， 楊 穎， 孫江萌綜述， 沈麗華審校

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是目前世界第二大神經(jīng)退行性疾病。PD是由黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元大量丟失和α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)聚集形成路易小體(Lewy Body,LBS)和路易神經(jīng)纖維(Lewy Neurites)為特征的病變[1]。Spillantini等人于1997年發(fā)現(xiàn)α-syn淀粉樣纖維是導(dǎo)致PD發(fā)生的毒性物質(zhì)；最近的研究證實(shí)，α-syn在聚集初始階段形成有毒性的寡聚體是導(dǎo)致PD細(xì)胞死亡的神經(jīng)毒性物質(zhì)[2]，提示α-syn在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。目前已發(fā)現(xiàn)的與PD發(fā)病相關(guān)的基因有20多個(gè)(見表1)。SNCA、LRRK2和VPS35的常染色體顯性突變和PINK1、DJ-1和Parkin的常染色體隱性突變導(dǎo)致PD具有高外顯性。表中所示各基因在細(xì)胞內(nèi)的定位及功能不同，如parkin、PINK1、DJ-1存在線粒體，參與線粒體相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng),突變會(huì)導(dǎo)致受損的線粒體清除障礙，進(jìn)而導(dǎo)致α-syn的聚集[3]；LRRK2的存在與溶酶體、內(nèi)溶酶體及自噬途徑相關(guān)，LRRK2突變?cè)黾恿甩?syn聚集[4]；VPS35介導(dǎo)囊泡的運(yùn)輸，其異常突變，增加α-syn錯(cuò)誤折疊和毒性[5]。表2列出了這幾個(gè)基因與PD相關(guān)的突變。我們將對(duì)以上SNCA、PRKN、PINK1、DJ-1、LRRK2和VPS35基因與α-syn的關(guān)系以及相互作用機(jī)制的最新進(jìn)展作相關(guān)綜述。

1 α-syn的結(jié)構(gòu)和致病機(jī)制

1.1 α-syn的結(jié)構(gòu) SNCA基因編碼的α-syn是一種14 kDa的蛋白分子，可分為3個(gè)主要區(qū)域：兩親水性的N-末端(1-60)、疏水性中心非淀粉樣成分(61-95)和酸性C-末端(96-140)。N-端是由 7個(gè)重復(fù)的 11個(gè)賴氨酸殘基組成的區(qū)域，形成兩個(gè)α-螺旋、3個(gè)轉(zhuǎn)角，目前所有已知的與α-syn相關(guān)的病理性突變均發(fā)生在該區(qū)域[6]，該區(qū)域可能還在突觸小泡運(yùn)輸過程起作用[2]。其次，α-syn的C-末端結(jié)構(gòu)域由許多帶電荷的氨基酸殘基組成的酸性不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，該區(qū)域包含大多數(shù)翻譯后修飾位點(diǎn)，還介導(dǎo)α-syn與其他蛋白質(zhì)、配體和金屬離子的相互作用。而中心區(qū)域非淀粉樣成分，形成核心，這個(gè)區(qū)域是淀粉樣的，負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)聚集。α-syn存在一個(gè)天然的未經(jīng)折疊的三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且α-syn呈α-螺旋折疊的四聚體結(jié)構(gòu)是天然構(gòu)象，未折疊的單體是α-syn在腦中主要的生理存在形式?？扇苄怨丫垠w(原纖維)是由兩個(gè)或以上的α-syn單體的聚集形成的，是纖維和包涵體形式的中間體，最初蛋白的錯(cuò)誤折疊，經(jīng)過多級(jí)反應(yīng)過程后，導(dǎo)致寡聚體的形成并進(jìn)一步形成纖維和包涵體。α-syn亞型在PD中也有不同的表達(dá)，異構(gòu)體α-syn-98聚集體被注射到小鼠黑質(zhì)后，可顯著提高內(nèi)源性α-syn的磷酸化水平，α-syn的積聚與泛素結(jié)合蛋白p62和泛素共定位，其病理表現(xiàn)出與人Lewy Body相似的特性[7]。

1.2 α-syn致病機(jī)制 目前多數(shù)人認(rèn)為PD的患病可能與基因突變導(dǎo)致的α-syn的自身聚集以及聚集早期形成的寡聚體有關(guān)[8]。1997 年P(guān)olymeropoulos等人發(fā)現(xiàn)α-syn首個(gè)突變A53T，為α-syn第 53 位氨基酸由丙氨酸變?yōu)樘K氨酸，會(huì)導(dǎo)致編碼的α-syn由原先α-螺旋結(jié)構(gòu)變成新的β-片層結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其降解障礙，α-syn發(fā)生聚集。另外，A30P則是α-syn第 30 位氨基酸由丙氨酸變?yōu)楦彼?以及E46K、A53E突變都會(huì)導(dǎo)致α-syn的錯(cuò)誤折疊。而G51D突變是唯一一個(gè)導(dǎo)致α-syn聚集風(fēng)險(xiǎn)降低的。目前α-syn導(dǎo)致PD的機(jī)制尚不完全清楚，α-syn寡聚體和纖維哪一個(gè)毒性更大仍需要研究。2011年Winner等人，通過上調(diào)體內(nèi)寡聚體，發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞和線粒體的毒性較上調(diào)纖維的毒性更大[2]。據(jù)報(bào)道，異常聚集的α-syn可能存在于線粒體內(nèi)，也可能位于線粒體外膜影響其結(jié)構(gòu)和功能[9]，具有許多不同的致病作用，包括細(xì)胞骨架改變；膜通透性(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、囊泡)；增加Ca2+內(nèi)流；增加活性氧(Reactive Oxidative Species,ROS)的產(chǎn)生；以及突觸毒性，表現(xiàn)為神經(jīng)元興奮性降低和突觸放電減少[10]。寡聚體還損害自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，已經(jīng)報(bào)道了不同寡聚體的不同毒性機(jī)制，其中一些破壞了脂質(zhì)雙層，細(xì)胞通透性增加，從而導(dǎo)致離子內(nèi)流增加；而另一些則直接進(jìn)入細(xì)胞并導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集增加[10]。

2 Parkin和PINK1基因突變與α-syn三者通過影響線粒體自噬導(dǎo)致線粒體應(yīng)激反應(yīng)

Parkin基因，定位于染色體6q25.2-q27，含有12個(gè)外顯子，編碼的Parkin蛋白含465個(gè)氨基酸。目前發(fā)現(xiàn)Parkin基因突變會(huì)導(dǎo)致其功能喪失(見表2)，不能正常降解底物。Parkin敲除小鼠早期多巴胺能神經(jīng)退行性病變和運(yùn)動(dòng)缺陷的發(fā)生被促進(jìn)，但并未使病理惡化[11]。PINK1基因，定位于染色體1p36，包含8個(gè)外顯子，全長(zhǎng)1.8 kb，編碼的PTEN誘導(dǎo)激酶1，位于線粒體膜上，與Parkin基因編碼的E3泛素連接酶共同作用線粒體，參與線粒體自噬[12]。在 2008 年的一項(xiàng)研究中，觀察到解偶聯(lián)劑羰基氰化物間氯苯腙(CCCP)處理后，大量Parkin從胞漿移位到受損的線粒體，通過磷酸化激活Parkin，線粒體隨后通過自噬方式去除。最近，在Parkin基因敲除小鼠中也發(fā)現(xiàn)在其DA神經(jīng)元中，線粒體破碎，內(nèi)部結(jié)構(gòu)異常積累[13]。Parkin介導(dǎo)的受損線粒體清除途徑需要PINK1，涉及Parkin-α-syn相互作用和泛素化，這些發(fā)現(xiàn)將這3個(gè)關(guān)鍵的PD基因與線粒體應(yīng)激反應(yīng)中的線粒體結(jié)構(gòu)異常聯(lián)系起來。在PD患者中，α-syn過表達(dá)會(huì)引起線粒體復(fù)合體I活性下降和ROS生成增加，導(dǎo)致線粒體應(yīng)激。線粒體損傷時(shí)的膜電位(ΔΨm)減少，導(dǎo)致PINK1通過線粒體膜外的自動(dòng)磷酸化積累和激活，該磷酸化位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的研究表明，PINK1可以在殘基S228和S402處自動(dòng)磷酸化，而在果蠅中S346殘基上是唯一的PINK1自動(dòng)磷酸化位點(diǎn)[14]。磷酸化之后可進(jìn)一步阻止依賴ΔΨm的PINK1進(jìn)入線粒體內(nèi)部隔室，而此時(shí)，Parkin會(huì)迅速移位到線粒體，通過PINK1和Parkin泛素化調(diào)節(jié)線粒體自噬介導(dǎo)的線粒體消除作用，清除受損的線粒體[15]。PINK1還能通過誘導(dǎo)自噬作用將α-syn降解[3]。然而，慢性線粒體應(yīng)激或Parkin或PINK1基因突變引起的α-syn的長(zhǎng)時(shí)間或者無節(jié)制激活會(huì)導(dǎo)致線粒體過度分裂、線粒體功能衰竭，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和PD。α-syn、PINK1和Parkin三者共同作用于線粒體上，揭示了這些基因在線粒體的應(yīng)激反應(yīng)中的功能，在未來α-syn的特定功能進(jìn)一步被研究，能對(duì)PINK1/Parkin和PD方面的研究進(jìn)一步加深。

表1 PD相關(guān)基因的位置功能及發(fā)病年齡

表2 PD相關(guān)基因的變異類型

3 DJ-1基因突變通過影響溶酶體自噬導(dǎo)致α-syn降解異常

DJ-1基因定位于染色體1p36.23，含7個(gè)外顯子，編碼DJ-1蛋白，是含189個(gè)氨基酸的蛋白多肽鏈。早在2003年Bonifati等人，已經(jīng)確認(rèn)DJ-1(Park7)基因?yàn)樵绨l(fā)性常染色體隱性遺傳性PD。目前證實(shí)，DJ-1基因與PD相關(guān)的致病突變主要有9個(gè)(見表2)。DJ-1蛋白是一種20 kDa的具有多種功能的小蛋白，參與多種細(xì)胞過程，如抗氧化應(yīng)激、伴侶功能、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、蛋白酶活性和線粒體調(diào)節(jié)等[4]。由于其廣泛的功能，目前很難闡明它是如何與α-syn相互作用，以及如何介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元變性導(dǎo)致PD。最近的研究證實(shí)， DJ-1與α-syn相互作用，影響病理性α-syn的聚集過程，部分氧化的DJ-1具有一個(gè)粘附表面，它隔離了α-syn單體，阻斷了α-syn聚集的早期階段，也限制了α-syn纖維的伸長(zhǎng)。DJ-1將成熟的α-syn纖維改造成異構(gòu)體的有毒寡聚體，使其能夠更好的被清除，減輕其毒性作用[16]。此外，DJ-1缺乏通過加速溶酶體2A 型相關(guān)膜蛋白(LAMP2A)的降解，而溶酶體LAMP2A水平是伴侶介導(dǎo)的自噬(CMA)調(diào)節(jié)的主要靶點(diǎn)。當(dāng)DJ-1缺乏時(shí)，CMA功能相應(yīng)缺乏，導(dǎo)致α-syn的積累而發(fā)生PD[4]，這與先前Chenere等人的結(jié)論相反，他們?cè)隗w內(nèi)實(shí)驗(yàn)得到DJ-1沒有直接調(diào)節(jié)α-syn的功能，也沒有保護(hù)致病性α-syn的有害作用[17]。另外，Parkin、PINK1和DJ-1基因突變已被證明能夠引起多巴胺和Ca2+穩(wěn)態(tài)的破壞，導(dǎo)致多巴胺氧化醌的形成、線粒體功能障礙和相關(guān)的氧化應(yīng)激[18]。這些條件觸發(fā)了α-syn聚集，隨后惡性循環(huán)使神經(jīng)元死亡。

4 LRRK2基因突變導(dǎo)致多種結(jié)構(gòu)異常影響α-syn降解

LRRK2基因位于染色體12q12，含51個(gè)外顯子，全長(zhǎng)144 kb。LRRK2基因突變與常染色體顯性遺傳和特發(fā)性PD相關(guān)。LRRK2編碼一個(gè)大的(2527個(gè)氨基酸)多結(jié)構(gòu)域蛋白(富含亮氨酸重復(fù)蛋白2，LRRK2)。LRRK2除了有激酶結(jié)構(gòu)域(kinase)外，還具有第二個(gè)酶性GTPase結(jié)構(gòu)域(ROC/COR結(jié)構(gòu)域)[19]。近期研究LRRK2至少有8個(gè)致病的突變與PD相關(guān)，4個(gè)在GTPase/ROC結(jié)構(gòu)域(N1437H和R1441C/G/H)，3個(gè)在激酶結(jié)構(gòu)域(I2012T、G2019S和I2020T),一個(gè)在COR結(jié)構(gòu)域(Y1669C)(見圖1)。突變之間存在差異，因?yàn)榧っ附Y(jié)構(gòu)域的突變直接增加了激酶活性，而ROC-COR結(jié)構(gòu)域的突變則降低了GTPase的活性。其中G2019S突變最頻繁，其次是R1441C/G/H。G2019S LRRK2促進(jìn)了黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的α-突觸核病和變性已被廣泛報(bào)道[20,21]。LRRK2參與了許多細(xì)胞功能和途徑，包括囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸可塑性、高爾基體和線粒體功能以及免疫反應(yīng)[19]。除此之外，LRRK2在自噬中的作用也得到證實(shí)[22]。LRRK2的這一作用，可能是LRRK2位于GTPases效應(yīng)結(jié)合基序中心的一個(gè)高度保守的位點(diǎn)上，通過磷酸化Rab蛋白的一個(gè)亞群導(dǎo)致其功能喪失，包括Rab8A、Rab10和Rab12。Rab蛋白是膜運(yùn)輸、協(xié)調(diào)囊泡形成、囊泡沿肌動(dòng)蛋白和微管蛋白網(wǎng)絡(luò)運(yùn)動(dòng)以及膜對(duì)接和融合的主要調(diào)節(jié)因子，這些都是自噬和溶酶體生物學(xué)中的重要方面[23]，也是清除α-syn的重要途徑。另外，易受傷害的多巴胺神經(jīng)元中的LRRK2激酶活性通過涉及α-syn和線粒體損傷的氧化應(yīng)激機(jī)制異常增加，從而導(dǎo)致內(nèi)溶酶體功能障礙和磷酸化α-syn的積累[24]。LRRK2突變通過以上幾種可能的機(jī)制促進(jìn)PD。

圖1 LRRK2結(jié)構(gòu)域與致病突變的線性模型

5 VPS35基因突變通過影響逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物作用導(dǎo)致α-syn聚集

VPS35基因位于染色體16q11.2 位點(diǎn)，含17個(gè)外顯子，編碼蛋白長(zhǎng)29.6 kb空泡蛋白分選35(VPS35)。在2011年，Zimprich等人研究證實(shí)該基因突變與家族性PD有關(guān)，也是常見的散發(fā)性PD原因[25]。最近在3個(gè)奧地利家系的14 例具有PD患者的VPS35基因中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的常染色體顯性遺傳性帕金森病突變(p.Asp620Asn)，也證實(shí)了p.Asp620Asn突變體是晚發(fā)性帕金森病的病因[26]。 VPS35與VPS29和VPS26a是逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成部分，復(fù)合物的功能是與不同的分揀連接素相互作用，將貨物從內(nèi)體中分揀出來，并且能夠協(xié)調(diào)將其中某些蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)椒词礁郀柣w，逆轉(zhuǎn)錄復(fù)合物發(fā)生異常已經(jīng)確定為與PD過程有關(guān)[27]。在動(dòng)物PD模型中，VPS35和α-syn之間建立了直接聯(lián)系，在該模型中VPS35缺乏會(huì)導(dǎo)致a-syn積聚[28]。進(jìn)一步的研究表明，VPS35缺陷的DA神經(jīng)元或表達(dá)PD的D620N突變體的DA神經(jīng)元受到損害，加速了LAMP2A的降解，導(dǎo)致CMA自噬障礙，使α-syn聚集[8]。VPS35 D620N突變體還能導(dǎo)致復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ的酶活性降低和呼吸缺陷，其可能是D620N突變體導(dǎo)致患者成纖維細(xì)胞中的組裝復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ以及超復(fù)合物的水平顯著降低，導(dǎo)致生物能量缺陷[29]。然而，不能排除是否為VPS35 D620N突變體通過影響α-syn聚集間接影響復(fù)合物Ⅰ的可能性。VPS35缺失或突變可能導(dǎo)致多個(gè)分子/細(xì)胞通路的缺陷，這些缺陷共同促進(jìn)PD的發(fā)病。

6 總結(jié)與展望

綜上所述，無論是SNCA基因本身突變導(dǎo)致的異常α-syn聚集，還是parkin/PINK1和DJ-1突變與線粒體作用異常，以及LRRK2和VPS35異常突變導(dǎo)致自噬障礙，都能導(dǎo)致PD的發(fā)生。雖然他們?cè)诓煌耐緩缴献饔?，但都與一個(gè)中間物α-syn相聯(lián)系。雖然目前對(duì)α-syn及PD發(fā)生的相關(guān)機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究，但是，隨著今后人類對(duì)基因測(cè)序、基因識(shí)別等的進(jìn)一步發(fā)展，將對(duì)上述基因與α-syn的相互作用有進(jìn)一步的了解，為PD的診治提供更多的依據(jù)。