奧希替尼治療大鼠脊髓損傷的時間窗研究

李在望, 武晶晶， 王 倩， 涂景梅， 韓 晶

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)在各國均有較高的發(fā)病率，常常導(dǎo)致嚴(yán)重的不可逆的功能缺損，例如肢體癱瘓、二便困難、性功能障礙等[1]。脊髓損傷后軸突不能有效再生是導(dǎo)致脊髓損傷患者遺留有嚴(yán)重殘疾的重要原因，因此如何促進(jìn)損傷軸突的有效再生便成了治療脊髓損傷的關(guān)鍵[2]。SCI后，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)的大量活化，這導(dǎo)致靜息的星形膠質(zhì)細(xì)胞活化分泌大量的軸突再生抑制因子如硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)等，形成致密的膠質(zhì)瘢痕而抑制軸突的有效再生[3,4]；而小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可釋放大量炎癥因子導(dǎo)致神經(jīng)毒性炎癥損傷[5]。由此可見，SCI后EGFR活化導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞過度活化對軸突再生微環(huán)境起著不利的作用[3～5]。

但是另一方面，在SCI后的早期，活化膠質(zhì)細(xì)胞形成的膠質(zhì)瘢痕可以抑制病灶處的不良病理因素向正常組織擴(kuò)散，對促進(jìn)損傷軸突再生可能是有益的[6]。而活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞也可通過分泌膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[7]。同時，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可吞噬細(xì)胞碎屑和潰變的髓鞘，這對促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)同樣可能是有益的[8]。由此可見，早期的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化增生對軸突的修復(fù)可能有一定的積極作用[6,8]。因此，在SCI后何時干預(yù)膠質(zhì)細(xì)胞活化以最大程度的發(fā)揮其保護(hù)作用并盡可能抑制其損傷作用便是干預(yù)SCI的一個關(guān)鍵問題。

目前已有研究證實，EGFR抑制劑可以通過抑制EGFR活化而對脊髓損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)增生產(chǎn)生抑制作用而促進(jìn)了神經(jīng)功能的恢復(fù)[4,9]。但SCI后，何時啟動EGFR抑制劑干預(yù)一直存在較大爭議。奧希替尼是第三代EGFR抑制劑，能透過血腦屏障而作用于中樞神經(jīng)細(xì)胞[10]，而且給藥方便，故本研究以奧希替尼為干預(yù)藥物。本實驗擬通過在不同時間點應(yīng)用奧希替尼對脊髓損傷進(jìn)行干預(yù)，確定EGFR抑制劑奧希替尼干預(yù)SCI的最佳時間窗。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物:健康成年雌性SD大鼠(200 g～250 g)60只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司(實驗動物合格證號201822084);(2)主要試劑與材料：奧希替尼(購于Med Chem Express公司)，兔抗growth-associated protein 43(GAP-43)(購于Invitrogen公司)，鼠抗glyceraldehyde phosphate dehydrogenase(GAPDH)(購于英國Abcam公司)。

1.2 奧希替尼溶液的配制 奧希替尼(osimertinib)粉末溶于生理鹽水中，調(diào)配濃度為0.4 mg/ml。

1.3 大鼠脊髓損傷模型的制備及分組 200 g～250 g SD雌性大鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為6組(n=10)：損傷對照組(injury組)、5個不同干預(yù)時間點的奧希替尼治療組(0 d組、1 d組、3 d組、5 d組7 d組)。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)打擊器制作大鼠脊髓損傷模型。選擇T10應(yīng)用龍膽紫做標(biāo)記，碘伏消毒鋪無菌巾后行背部正中切口，逐層分離肌肉，切斷T9-T11棘突上的韌帶及部分肌肉，充分暴露T9-T11棘突和椎板，咬除T10棘突和椎板，充分暴露硬脊膜，應(yīng)用打擊器的鉗夾系統(tǒng)固定T9、T11棘突，調(diào)整好打擊棒的高度(打擊棒重量為10 g，其打擊頭部直徑為2 mm，其打擊高度為1.25 cm，下落打擊致傷能量為25 gcf)，使打擊棒與T10段脊髓垂直，按下打擊開關(guān)，打擊棒垂直自由落下，打在硬脊膜表面，致傷后迅速移去打擊棒，可見打擊處硬脊膜迅速形成血腫，雙下肢痙攣抖動，尾巴痙攣性擺動，視為造模成功。各組行肌肉和皮膚縫合。消毒、復(fù)溫后將大鼠放回籠中。奧希替尼組按照組別分別在相應(yīng)時間點給予奧希替尼溶液灌胃(2 ml/d)，對照組給予生理鹽水灌胃(2 ml/d)，給藥時長為SCI后2 w。

1.4 后肢運動功能評估 在脊髓損傷后第1天、第1周、第2周、第3周、第4周固定時間點觀察各組大鼠行為學(xué)的改變。應(yīng)用BBB評分量表評定大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能缺損的情況，最小值為0分，表示未觀察到后肢運動，最大值為21分為觀察到后肢運動功能完全正常[11]。兩人雙盲獨立觀察記錄評分結(jié)果，以防止主觀因素的干擾。

1.5 殘余尿量統(tǒng)計 大鼠脊髓損傷后，每天人工按摩腹部促進(jìn)膀胱排尿兩次，并應(yīng)用帶有刻度的小燒杯記錄殘余尿量以評估排尿功能。

1.6 脊髓GAP-43蛋白測定 各組大鼠(每組5只)于傷后14 d時深度麻醉后處死，快速剝?nèi)p傷節(jié)段脊髓組織，加人裂解液冰上孵育并徹底勻漿，離心后留取上清，BCA(bicinchonininc acid)法測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白；全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；5%封閉液(1 g奶粉+20 ml含0.05%Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶，即TBST溶液)封閉2 h，分別加入一抗(兔抗GAP43，1∶500稀釋)；內(nèi)參為GAPDH，4 ℃孵育過夜。用TBST溶液洗滌10 min×3次；加入二抗(HRP標(biāo)記羊抗兔IgG，1∶1000稀 釋)，4 ℃過夜；TBST洗膜10 min×3次，加ECL發(fā)光顯示液在暗室中攝像，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0、Graphpad 6.01等軟件進(jìn)行分析、制圖。BBB評分及殘余尿量以重復(fù)測量方差分析進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，GAP-43應(yīng)用單因素方差分析，P<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同時間點奧希替尼干預(yù)后運動功能評分分析 通過在不同時間點應(yīng)用奧希替尼(EGFR抑制劑)干預(yù)脊髓損傷，并連續(xù)動態(tài)(每周)觀察記錄大鼠后肢運動功能評分(BBB評分)，以分析干預(yù)脊髓損傷最佳開始時間。研究結(jié)果顯示：0 d組、1 d組及3 d組后肢運動功能評分接近，3組間評分無差異(P>0.05);而0 d組、1 d組及3 d組3組的評分均明顯優(yōu)于5 d組、7 d組及對照損傷組(P<0.05)。5 d組及7 d組這兩組后肢功能評分與損傷組無明顯差異(P>0.05);而5 d組、7 d組和損傷組間大鼠后肢功能恢復(fù)無明顯差異(P>0.05)(見圖1、見表1)。由此可見，在SCI后0～3 d應(yīng)用EGFR抑制劑奧希替尼干預(yù)可獲得最佳運動功能治療效果。

2.2 不同時間點奧希替尼干預(yù)后殘余尿量分析 本研究應(yīng)用殘余尿量評估各組大鼠的排尿功能。其中，0 d組、1 d組及3 d組的殘余尿量分別較5 d組、7 d組及損傷組明顯減少，重復(fù)測量方差分析提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);而0 d組、1 d組及3 d組3組間殘余尿量很接近(P>0.05)。5 d組及7 d組這兩組殘余尿量均與損傷組無明顯差異(P>0.05)；而5 d及7 d兩組間殘余尿量無明顯差異(P>0.05)(見圖2、見表2)。研究結(jié)果提示：在SCI后急性期(0～3 d)，應(yīng)用EGFR抑制劑奧希替尼進(jìn)行干預(yù)是促進(jìn)排尿功能恢復(fù)的最佳時機(jī)。

2.3 不同時間點奧希替尼干預(yù)后GAP-43蛋白表達(dá)量分析 由于GAP-43表達(dá)增加與軸突生長和再生密切相關(guān)，因此，GAP-43成為神經(jīng)再生的常用指標(biāo)[12]。在本研究中，0 d組、1 d組及3 d組GAP-43的表達(dá)不僅高于5 d組及7 d組(P<0.05),而且明顯高于損傷組(P<0.01);而0 d組、1 d組及3 d組3組間GAP-43表達(dá)無差異(P<0.05)(見圖3)。這一結(jié)果表明：在SCI急性期(0～3 d)應(yīng)用奧希替尼干預(yù)后軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43表達(dá)水平最高。

表1 各組大鼠各時間點的BBB評分比較

表2 各組大鼠各時間點的殘余尿量比較

圖1 在不同時間點應(yīng)用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預(yù)脊髓損傷，觀察分組大鼠后運動功能恢復(fù)的差異。應(yīng)用重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示：0 d組、1 d組及3 d組這3組后肢功能評分均明顯高于其他各組(P<0.05)

圖2 在不同時間點應(yīng)用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預(yù)脊髓損傷，比較各組大鼠殘余尿量的差異。應(yīng)用重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示：0 d組、1 d組及3 d組這3組殘余尿量均明顯少于其他各組(P<0.05)

圖3 在不同時間點應(yīng)用EGFR抑制劑( 奧希替尼)干預(yù)脊髓損傷，比較各組大鼠SCI后14 d軸突再生相關(guān)蛋白GAP表達(dá)的差異。A圖為各組GAP-43的Western blot的典型條帶及GAPDH的條帶；B圖為各組GAP-43相對表達(dá)量分析條圖*P<0.05，#P<0.01

3 討 論

脊髓損傷后的神經(jīng)功能缺損由原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩種機(jī)制所致，而繼發(fā)性損傷與SCI后過度膠質(zhì)增生引發(fā)的反應(yīng)性神經(jīng)毒性炎癥損傷密切相關(guān)[13]。機(jī)械暴力作用導(dǎo)致微血管內(nèi)皮損傷，引發(fā)血脊髓屏障(BSCB)破壞，外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子侵入脊髓神經(jīng)組織。外傷和炎癥因子的雙重作用引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增生[14]。在損傷后的炎癥微環(huán)境中，這兩種膠質(zhì)細(xì)胞相互應(yīng)答，引發(fā)炎癥反應(yīng)升級[15]。這不僅導(dǎo)致神經(jīng)元脫失和髓鞘破壞，還導(dǎo)致非損傷區(qū)的BSCB破壞，從而引起新一輪外周炎癥細(xì)胞和炎癥因子侵入脊髓組織，形成脊髓組織炎癥損傷的惡性循環(huán)(即正反饋損傷)[1,8,16]。因此，阻斷這種炎癥損傷的惡性循環(huán)是干預(yù)SCI的關(guān)鍵策略。而SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)過度活化增生是炎癥損傷的一個核心環(huán)節(jié)。SCI后導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞活化增生的機(jī)制尚未完全明確，但目前實驗已證實，SCI后小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞均出現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)的活化[3,4,9]。EGFR是位于細(xì)胞質(zhì)膜上的受體型酪氨酸蛋白激酶(tyrosine-protein kinase，TPK)，在細(xì)胞存活、生長、分化、增生等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，起著關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用[17]。EGFR信號通路是調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變后膠質(zhì)細(xì)胞活化增生的特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路[18]。

奧希替尼是第三代EGFR抑制劑，可透過血腦屏障，能有效抑制EGFR的活化[10]。在本實驗中，我們選擇奧希替尼作為干預(yù)SCI后過度膠質(zhì)增生的藥物。研究結(jié)果顯示在SCI的急性期(0～3 d)給予奧希替尼進(jìn)行干預(yù)，大鼠的運動功能及排尿功能恢復(fù)最佳，而且軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)也是最高的。研究結(jié)果表明應(yīng)用EGFR抑制劑奧希替尼干預(yù)SCI應(yīng)選擇在SCI的損傷早期進(jìn)行。

盡管有研究者認(rèn)為在SCI早期星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化可能對損傷修復(fù)起一定的保護(hù)作用[15]，但SCI后膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化可引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生反應(yīng)性毒性神經(jīng)炎癥損傷，同時還可引發(fā)病灶周圍正常脊髓組織的血脊髓屏障的破壞，導(dǎo)致炎癥進(jìn)一步擴(kuò)展，形成惡性循環(huán)[8,16]。因此，及時阻斷這種惡性炎癥損傷的級聯(lián)反應(yīng)對減輕脊髓繼發(fā)性損傷有著及其重要的意義。本研究結(jié)果提示SCI后盡早(前3 d)應(yīng)用EGFR抑制劑進(jìn)行干預(yù)才能獲得最佳治療效果，這與其它EGGR抑制劑干預(yù)中樞神經(jīng)損傷的時機(jī)選擇是一致的[3,4,9,19]。

總之，本實驗通過在不同時間點應(yīng)用EGFR抑制劑奧希替尼對脊髓損傷進(jìn)行干預(yù)，觀察SCI后大鼠運動功能及排尿功能恢復(fù)情況，并分析各時間點給藥后軸突再生相關(guān)蛋白GAP-43的表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示：EGFR抑制劑奧希替尼干預(yù)脊髓損傷的最佳時間窗在SCI的急性期(0～3 d)。