不同茶葉中游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體

朱蔭，張悅，嚴(yán)寒，呂海鵬，林智

不同茶葉中游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體

朱蔭，張悅，嚴(yán)寒，呂海鵬，林智

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所/農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310008

【】游離氨基酸是茶葉的主要化學(xué)成分之一，與茶葉的滋味品質(zhì)密切相關(guān)。大多數(shù)氨基酸具有手性中心，因此存在滋味特性及生理活性均可能截然不同的L型和D型兩種對(duì)映異構(gòu)體。由于檢測(cè)技術(shù)的限制，過去的研究多集中在L型氨基酸上，而茶葉中D型氨基酸罕有系統(tǒng)的研究報(bào)道。因此，研究茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體，對(duì)茶葉化學(xué)理論體系的深化及滋味品質(zhì)的提升與調(diào)控具有重要的推進(jìn)作用。采用手性HPLC法、MTBSTFA硅烷衍生化法和酯化-PFP酰化法3種不同的分析方法對(duì)比茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的分離性能，結(jié)果表明采用酯化-PFP酰化法結(jié)合手性氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），可實(shí)現(xiàn)茶葉中丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、賴氨酸及色氨酸等15種重要游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的有效分離。繼而建立茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的高效衍生化及定性定量分析方法，并查明市售11種代表性白茶、烏龍茶及普洱茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的分布規(guī)律。衍生化條件為：將氨基酸反應(yīng)液在100℃下酯化105 min，繼而以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，在100℃下五氟丙?；?0 min。游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的回收率介于75.26%—123.6%（低濃度）、81.23%—121.8%（高濃度），RSD值介于2.09%—13.12%（低濃度）、1.48%—10.59%（高濃度）。茶樣分析結(jié)果表明，大部分氨基酸的1—2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體可以在茶樣中檢測(cè)出，且D-氨基酸普遍存在于茶樣中，尤其是D-蘇氨酸、D-天冬氨酸、D-半胱氨酸、D-苯丙氨酸、D-茶氨酸、D-谷氨酰胺及D-谷氨酸混合物在大部分茶樣中均有分布，而D-蛋氨酸、D-賴氨酸及D-色氨酸在所有茶樣中均未被檢測(cè)出。在具體含量分布上，除了L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺混合物之外，L-半胱氨酸（1.48—2.08 mg?g-1）、D-半胱氨酸（1.46—1.49 mg?g-1）、L-絲氨酸（0.15—1.80 mg?g-1）及D-天冬氨酸（1.02—1.14 mg?g-1）在白茶中的含量普遍較高；L-半胱氨酸（1.52—1.70 mg?g-1）、D-半胱氨酸（1.45—1.49 mg?g-1）、L-絲氨酸（1.03—1.50 mg?g-1）、L-蛋氨酸（1.03—1.52 mg?g-1）、L-酪氨酸（1.32—1.35 mg?g-1）及D-天冬氨酸（1.01—1.15 mg?g-1）在烏龍茶中具有較高含量。在普洱茶中，L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺混合物的含量（1.04 mg?g-1）與其他氨基酸相比并無顯著性差異，而L-蘇氨酸、L-色氨酸及L-絲氨酸含量較高，介于0.61—0.84 mg?g-1。在氨基酸總量上，各茶類呈現(xiàn)出白茶（最高為40.61 mg?g-1）>烏龍茶（最高為25.43 mg?g-1）>普洱茶（8.01 mg?g-1）的分布規(guī)律。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺混合物、L-色氨酸及L-天冬氨酸在部分白茶中的含量顯著高于烏龍茶，而L-酪氨酸與L-蛋氨酸則在烏龍茶中含量較高。D-氨基酸存在于大部分茶葉中，對(duì)茶湯滋味品質(zhì)存在潛在影響，但在本研究樣例中，D-氨基酸的含量分布在不同茶類間未表現(xiàn)出顯著性差異。

茶葉；游離氨基酸；對(duì)映異構(gòu)體；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；五氟丙酸酐

0 引言

【研究意義】氨基酸是茶葉中的主要化學(xué)成分之一，與茶葉的滋味及香氣形成均有密切的關(guān)系[1]。目前在茶葉中發(fā)現(xiàn)并鑒定的氨基酸約有26種，其中茶氨酸約占游離氨基酸總量的50%—60%，是茶湯鮮味的主要呈味因子；谷氨酸和天冬氨酸是茶葉中重要且含量高的一類氨基酸，是構(gòu)成茶葉鮮爽滋味的重要成分；苯丙氨酸、色氨酸、精氨酸等則呈現(xiàn)甜味口感，對(duì)茶湯滋味有益[2]。大部分天然氨基酸具有手性中心，存在D和L兩種構(gòu)型，它們的生理活性截然不同。研究發(fā)現(xiàn)，部分D構(gòu)型氨基酸有十分理想而特別的滋味，而其相應(yīng)的L構(gòu)型氨基酸卻有著令人不悅的滋味[3-5]。尤其是D-色氨酸、D-苯丙氨酸、D-組氨酸、D-酪氨酸及D-亮氨酸分別呈現(xiàn)出高于蔗糖35、7、7、6及4倍的甜味[3]。由此可知，如果茶葉中存在D構(gòu)型氨基酸，那它們對(duì)茶湯滋味的影響應(yīng)該與相應(yīng)的L構(gòu)型有較大差異，因此，茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體研究具有重要的研究價(jià)值。【前人研究進(jìn)展】近幾年來，隨著分析技術(shù)的飛速發(fā)展，茶葉中的D-氨基酸也引起了研究者的一定關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)在白茶[6]、綠茶[7]、烏龍茶及部分紅茶中[8]均存在較高含量的D-茶氨酸，茶葉萎凋、儲(chǔ)藏過程以及堿化處理可促進(jìn)D-茶氨酸的生成，且D-茶氨酸的比例與茶葉的等級(jí)存在一定的相關(guān)性[8-9]。另一方面，在檢測(cè)方法上，國內(nèi)外均已采用不同的分析手段對(duì)茶葉中茶氨酸對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行了研究，如高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）/大氣壓電離質(zhì)譜法[10]、配體交換色譜手性固定相法拆分法[11]、配體交換色譜手性流動(dòng)相法[12]及手性衍生-高效液相色譜法拆分法[13]等，均在不同程度上檢測(cè)出D-茶氨酸的存在。然而，相比D-茶氨酸，茶葉中其他重要D-氨基酸的研究進(jìn)展緩慢。近期，研究者采用離線二維液相色譜[14]及手性液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)[15]查明了茶葉中多種D-氨基酸的含量分布情況。除此之外，茶葉領(lǐng)域少有相關(guān)研究報(bào)道。手性固定相拆分法是手性色譜發(fā)展的前沿領(lǐng)域，也是手性色譜發(fā)展的關(guān)鍵和核心，其特點(diǎn)是使用方便，一般不需要高光學(xué)純的手性衍生試劑，制備分離便利。手性固定相拆分法在HPLC及氣相色譜法中均有所應(yīng)用，在液相色譜法中，最常使用的是手性配體交換型和環(huán)糊精型固定相，前者往往需要引入二價(jià)銅離子，分離效果受流動(dòng)相pH、金屬離子濃度等的影響大[16]；后者雖然有多種環(huán)糊精結(jié)構(gòu)可供選擇，但每種結(jié)構(gòu)分離效果單一，拆分適用范圍窄，需多種結(jié)構(gòu)的環(huán)糊精聯(lián)用才能達(dá)到較好分離效果，操作繁瑣復(fù)雜[17]。而近年來新發(fā)展的手性冠醚固定相適用范圍廣，操作方便快捷，無需引入額外的衍生劑或金屬離子，具有很強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性[18]。除了最廣泛使用的HPLC外，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography- mass spectrometry，GC-MS）也是常用的氨基酸分析方法，該方法具有柱效高、分析速度快、易于定量且具有可供參考的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫等優(yōu)點(diǎn)[19]。由于氨基酸含有氨基、羧基和羥基等極性基團(tuán)，因此首先需要將氨基酸衍生為易于汽化的衍生物，然后再進(jìn)行分離檢測(cè)。目前氨基酸柱前衍生主要有硅烷化[20]、酯化-?；瘍刹椒╗21]等方法。氨基酸的酯化和?；趾戏Q為兩步法，先將羧基用短碳鏈脂肪醇酯化，然后再用各種酸酐將N-(O,S)基團(tuán)乙酰化[22]，常用的衍生試劑有三氟乙酰、五氟丙酸酐（pentafluoropropionic anhydride，PFPA）、正丙醇、七氟丁酰和異丙醇等?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于各氨基酸對(duì)映異構(gòu)體與手性固定相的作用力差別迥異，且茶湯屬于復(fù)雜化學(xué)體系，很難在一個(gè)手性色譜體系中將眾多氨基酸對(duì)映異構(gòu)體完全分析，因此游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體研究具有較大的挑戰(zhàn)性。擬采用3種不同的手性分析方法對(duì)茶葉中常見游離氨基酸進(jìn)行對(duì)映異構(gòu)體分離，對(duì)可分離的對(duì)映異構(gòu)體數(shù)量、分離度、分析時(shí)間以及操作可行性等進(jìn)行綜合比較，繼而優(yōu)化茶葉中游離氨基酸的提取或衍生化方法，從而建立茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的理想分析方法?！緮M解決的關(guān)鍵問題】查明不同種類茶葉中游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體分布情況，以期為茶葉風(fēng)味品質(zhì)的形成機(jī)理研究、加工工藝的提高與定向調(diào)控等提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間

本研究于2017—2018年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料與儀器

茶葉樣品為各地市場(chǎng)采集或自行制備，白茶樣品5個(gè)：白毫銀針（BHYZ）、白牡丹（BMD-1，BMD-2）2個(gè)、壽眉（SM）、印尼白毫銀針（YNBHYZ）；烏龍茶樣品5個(gè)：肉桂（RG）、大紅袍（DHP）、鐵觀音（TGY-1，TGY-2）2個(gè)、水仙（SX）；黑茶樣品1個(gè)：普洱（PE）。以上茶樣均用研磨機(jī)磨粉過40目篩后0—4℃下保存?zhèn)溆?，取等量混合樣用于分析方法建立、?yōu)化以及驗(yàn)證等。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品：D、L、DL-型天冬氨酸，精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、絲氨酸、纈氨酸、賴氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、鳥氨酸、組氨酸、精氨酸及L-茶氨酸購自北京百靈威科技有限公司，DL-茶氨酸購自成都博瑞特化學(xué)技術(shù)有限公司，2.5 μmol?mL-1的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品鹽酸混合溶液購自美國默克公司。

化學(xué)試劑：70%高氯酸水溶液（pH 2.0）、PFPA購自上海阿拉丁公司，異丙醇（i-PrOH）、乙腈（CH3CN）、二氯甲烷（CH2Cl2）、氯仿（CHCl3）、四氫呋喃（THF）及無水乙醇（EtOH）購自北京百靈威科技有限公司，含1%叔丁基二甲基氯硅烷的N-（特丁基二甲基硅）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA（1% TBDMSCl））、叔丁基甲基醚（tBuOMe）購自美國默克公司，乙酸乙酯（EtOAc）購自北京伊諾凱公司，70%鹽酸購自杭州昕誠生物科技有限公司，純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

儀器設(shè)備：Waters 600高效液相色譜-waters 717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器-waters 2487雙波長檢測(cè)器（美國Waters公司），Agilent 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），PL202-L-電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），MTH-100加熱恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司），2.0 mL液相進(jìn)樣瓶（美國Agilent公司），200 μL液相進(jìn)樣瓶內(nèi)插管（美國Agilent公司），20 mL特制回流冷凝試管（北京欣維爾玻璃儀器有限公司），10/100 mL容量瓶（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），10 μL—5 mL移液器（德國艾本德股份公司），15 mL/50 mL離心管（美國康寧公司），F(xiàn)D 5-10真空冷凍干燥機(jī)（美國西盟公司），5430R高速離心機(jī)（德國艾本德股份公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 手性HPLC法（無需衍生化） 高效液相色譜法分離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體混合標(biāo)準(zhǔn)品：等量準(zhǔn)確稱取各氨基酸消旋標(biāo)準(zhǔn)品約10.0 mg放置于100 mL容量瓶中，分別采用蒸餾水、0.1 mol?L-1鹽酸定容至100 mL，靜置后轉(zhuǎn)移至1.5 mL液相進(jìn)樣瓶中，分別采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)。

高效液相色譜法分離茶湯中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體：3.0 g混合茶粉溶于150 mL去離子水中，80℃浸提45 min，3×30 mL CHCl3萃取除去多酚、咖啡堿等物質(zhì)，離心10 min得粗提取液，C18 SPE柱（美國Waters公司）預(yù)處理得待測(cè)提取液。

HPLC分析條件：采用Waters 600高效液相色譜-waters 717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器-waters 2487雙波長檢測(cè)器進(jìn)行分析；分析條件為波長：200 nm；流動(dòng)相：1.0 mL?min-1HClO4水溶液（pH 2.0）；溫度：25?C；色譜柱：大賽璐CROWNPAK? CR(+)手性液相色譜柱（150 mm×3.0 mm×5 μm；日本大賽璐公司）；進(jìn)樣量：25 μL。

1.3.2 手性GC-MS法（MTBSTFA硅烷衍生化法） MTBSTFA硅烷衍生化氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品步驟：用0.1 mol?L-1鹽酸配制1 mmol?L-1氨基酸消旋體的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，吸取10 μL氨基酸混合溶液于2 mL的自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入40 μL的乙腈溶劑及40 μL MTBSTFA 衍生試劑（1% TBDMSCl），100℃下衍生化30 min后，冷卻至室溫，靜置待用。

MTBSTFA硅烷衍生化茶湯中的游離氨基酸步驟：取0.1 g混合茶粉樣，加入5 mL超純水于沸水浴中浸提5 min，5 000 r/min離心10 min得提取液，加入100 μL的CH3CN溶劑及100 μL MTBSTFA衍生試劑（1% TBDMSCl），100℃下衍生化30 min后，冷卻至室溫，靜置待用。

GC-MS測(cè)定條件：Agilent 7890A-5975C（美國Agilent公司），Chirasil-L-Val（25 m×0.22 mm×0.12 μm）手性氣相色譜柱；進(jìn)樣口溫度為250℃；分流進(jìn)樣，分流比為10﹕1，載氣為高純度氦氣，純度≥99.99%；柱箱溫度采用程序升溫：80℃保持3 min，然后以3℃?min-1升到200℃保持10 min，流速為1.2 mL?min-1，進(jìn)樣量為1.0 μL。MS條件：電子轟擊離子源，電子能量-70 eV，傳輸線溫度250℃；離子源溫度220℃；質(zhì)量掃描范圍（m/z）33—600 u。

1.3.3 手性GC-MS法（（酯化-PFP?；苌▋?yōu)化步驟） 標(biāo)準(zhǔn)品的衍生化：分別稱取各氨基酸消旋標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mol于100 mL容量瓶中，加0.1 mol?L-1鹽酸溶液至刻度線（即各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1.0 mol?L-1），搖勻，靜置；用移液槍取100 μL溶液置于15 mL離心管中，加入100 μL鹽酸/異丙醇溶液（4 mol?L-1），分別在40、60、80、100和120℃下恒溫反應(yīng)15、30、45、60、75、90、105和120 min（酯化步驟），反應(yīng)完畢后，將剩余的試劑旋干濃縮，-56℃下真空冷凍至絕對(duì)干燥狀態(tài)（24 h）；在反應(yīng)物中加入200 μL溶劑（分別采用CH2Cl2、CH3CN、EtOAc、EtOH、tBuOMe、THF等溶劑進(jìn)行篩選比較）并轉(zhuǎn)移至特制回流冷凝試管中，繼而向試管中加入100 μL PFFA，用回流冷凝管密封試管，分別在40、60、80、100和120℃下恒溫反應(yīng)10、20、30、40、50和60 min（?；襟E），反應(yīng)完畢冷卻至室溫后，用50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多余的試劑除去，最后用150 μL CH2Cl2溶解轉(zhuǎn)移至含200 μL內(nèi)插管的2.0 mL液相進(jìn)樣瓶中，靜置待用。

樣品衍生化：稱取茶粉樣1.0 g，加入50 mL沸純凈水，100℃浸提5 min后，用離心機(jī)低溫離心20 min；用移液槍取1 mL上層清液置于15 mL離心管中，加入100 μL鹽酸/異丙醇溶液（4 mol?L-1），100℃下恒溫反應(yīng)105 min，反應(yīng)完畢后，將剩余的試劑旋干濃縮，-56℃下真空冷凍至絕對(duì)干燥狀態(tài)（24 h）；在反應(yīng)物中加入200 μL THF并轉(zhuǎn)移至特制回流冷凝試管中，繼而向試管中加入100 μL PFPA，用回流冷凝管密封試管，100℃恒溫反應(yīng)10 min，反應(yīng)完畢冷卻至室溫后，用50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將多余的試劑除去，最后用150 μL THF溶解轉(zhuǎn)移至含200 μL內(nèi)插管的2.0 mL液相進(jìn)樣瓶中，靜置待用。每個(gè)茶樣均重復(fù)3次。

氨基酸衍生物的GC-MS測(cè)定條件同1.3.2。

1.3.4 茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的定性定量分析 根據(jù)游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和定性離子，提取出茶樣中相應(yīng)位置的特征離子峰，與標(biāo)準(zhǔn)品的離子峰豐度分布相似度在95%以上的色譜峰即可定性。采用外標(biāo)法對(duì)茶葉中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行定量分析，選取8個(gè)濃度梯度進(jìn)行衍生化后，繪制氨基酸衍生物濃度與定量離子峰面積間的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，將測(cè)得的茶樣中各氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的定量離子峰面積代入工作曲線即可得出相應(yīng)的濃度值。

1.3.5 茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的回收率測(cè)定 選取濃度線性范圍內(nèi)兩個(gè)不同等級(jí)濃度的游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別添加到混合茶粉樣中，衍生化后進(jìn)行手性GC-MS分析，測(cè)定加標(biāo)回收率?；厥章蕼y(cè)定公式如下：Recovery（%）=[（加標(biāo)茶樣中氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的濃度-茶樣中氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的濃度）/添加的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品濃度]×100。回收率試驗(yàn)重復(fù)測(cè)量3次，取平均值并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2013（美國微軟公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)初步處理（原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化處理）、繪制柱狀圖、計(jì)算含量及RSD值等。采用SPSS Statistics 20.0（美國IBM公司）、SIMCA-P v. 12.0（瑞典Umetrics公司）及MultiExperiment Viewer 4.8.1（美國Oracle公司）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體分析方法建立

2.1.1 手性HPLC法分離茶葉中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體 采用HPLC法對(duì)氨基酸的混合消旋體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行手性分離，僅有酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸的對(duì)映異構(gòu)體可以被分離，而其他氨基酸由于出峰時(shí)間過早，有較大程度重疊。此外，雖然茶氨酸與其他氨基酸具有較高的分離度，但其對(duì)映異構(gòu)體無法被分離（圖1-A）。對(duì)茶湯中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)結(jié)果顯示，通過該方法僅能檢測(cè)到茶氨酸（DL-混合體，81.01%）、L-酪氨酸（9.36%）、L-苯丙氨酸（4.59%）及少量D-酪氨酸（2.16%），其中茶氨酸的含量遠(yuǎn)高于其他氨基酸（圖1-B）。由此可知，氨基酸在液相系統(tǒng)中保留時(shí)間過短，大量小分子量的氨基酸色譜峰會(huì)嚴(yán)重重疊，無法判斷化合物歸屬。另外，該方法的靈敏度較低，能檢測(cè)到的氨基酸種類過少，因此，該方法不適用于茶葉中游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體分析。

2.1.2 手性GC-MS法（MTBSTFA硅烷衍生化法）分離茶葉中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體 采用MTBSTFA硅烷衍生化法對(duì)游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、茶氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、組氨酸及酪氨酸等15種氨基酸可被GC-MS鑒定出。但衍生化之后的氨基酸硅烷衍生物在手性氨基酸專用柱上并未獲得良好的分離效果，沒有任何氨基酸對(duì)映異構(gòu)體可以被分離（圖2）。因此，該方法也不適用于茶葉中游離氨基酸的對(duì)映異構(gòu)體分析。

2.1.3 手性GC-MS法（酯化-PFP?；苌ǎ┓蛛x茶葉中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體 采用酯化及PFP?；磻?yīng)將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生化，并通過手性GC-MS分離相應(yīng)對(duì)映異構(gòu)體。結(jié)果表明，丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、賴氨酸、色氨酸及谷氨酸等15種游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體可被成功分離，而茶氨酸以及谷氨酰胺在酯化后形成了與谷氨酸相同的酯化衍生物，因此其色譜峰與谷氨酸的色譜峰完全重合。此外，雖然仍有部分氨基酸存在重疊問題，但由于各氨基酸的特征離子峰不同，因此仍可以通過提取譜圖的特征峰離子從而獲得良好的分離度（圖3）。表1列出了該方法下游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的各項(xiàng)定性參數(shù)。

繼而采用該方法將混合茶葉樣品衍生化后通過手性GC-MS分析，并依據(jù)表1中各氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的定性參數(shù)進(jìn)行定性和相對(duì)定量。結(jié)果表明，在混合茶粉樣中可檢測(cè)到L-丙氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、D-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸、D-苯丙氨酸、L-谷氨酸（實(shí)為谷氨酸、谷氨酰胺及茶氨酸混合物）、D-谷氨酸（實(shí)為谷氨酸、谷氨酰胺及茶氨酸混合物）、L-酪氨酸、L-賴氨酸及L-色氨酸等，以上可檢測(cè)的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體均可以獲得良好的分離度。其中蘇氨酸L/D比值為1.49﹕1，苯丙氨酸L/D比值為37.22﹕1，茶氨酸、谷氨酰胺及谷氨酸混合物L(fēng)/D比值為306.8﹕1（圖1）。除此之外，蛋氨酸的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體并未被檢測(cè)到，推測(cè)與樣本自身屬性有關(guān)或其含量未達(dá)儀器檢測(cè)限。由此可見，該方法雖然比其他兩種方法更為繁瑣，但可以檢測(cè)出茶葉中常見的大部分游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體，分析方法的可行性較高。由于組氨酸、精氨酸及鳥氨酸等堿性氨基酸在該條件下無法獲得衍生化的產(chǎn)物，所以在后續(xù)工作中還會(huì)繼續(xù)優(yōu)化分析方法，以查明這些無法分離的游離氨基酸在茶葉中的對(duì)映異構(gòu)體分布。

2.2 茶葉中游離氨基酸高效衍生化方法建立

酯化-PFP?；苌^程中涉及到兩步化學(xué)反應(yīng)（圖4-A，以L-苯丙氨酸的衍生化為例），首先采用異丙醇的鹽酸溶液將氨基酸的羧基衍生成異丙酯基，然后加入PFPA與異丙酯衍生物的NH2基團(tuán)（或氨基酸本身含有的OH、NH2、NHR、SH基團(tuán)）快速反應(yīng)，最后生成易汽化的氨基酸PFP衍生物。在反應(yīng)過程中，涉及到溶劑選擇、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間等條件參數(shù)，將對(duì)氨基酸的衍生化效率產(chǎn)生較大影響，因此需要對(duì)溶劑、反應(yīng)溫度及時(shí)間等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖2 游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（以蘇氨酸為例）硅烷化衍生物的總離子流圖

表1 游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體定性參數(shù)

[1]：保留時(shí)間在前的為D-氨基酸；[2]：定性離子中排在第一位的離子為定量離子

[1]: The enantiomer with earlier retention time was identified as D-amino acid; [2]: The qualitative ion of the first rank was determined as the quantitative ion

2.2.1 適宜氨基酸酯化溫度及時(shí)間選擇 當(dāng)反應(yīng)溫度低于40℃時(shí)，酯化反應(yīng)無法進(jìn)行，沒有任何產(chǎn)物生成；而在60—100℃時(shí)，反應(yīng)效率逐漸上升，在100℃時(shí)氨基酸異丙酯的產(chǎn)量最高；當(dāng)溫度升到120℃后，反應(yīng)效率急劇下降，推測(cè)溫度過高，生成的副產(chǎn)物增多（圖4-B）。因此，100℃為適宜的酯化溫度。在15—105 min時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)效率相應(yīng)增加，而當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長至120 min時(shí)，反應(yīng)效率大幅度降低（圖4-C）。因此，105 min為適宜的酯化時(shí)間。

2.2.2 氨基酸PFP?；磻?yīng)溶劑的篩選 在氨基酸?；襟E中，溶劑是影響酯化效率的關(guān)鍵因素之一。對(duì)于在溶劑中進(jìn)行的反應(yīng)，溶劑的改變，必然強(qiáng)烈地影響反應(yīng)物和過渡態(tài)的穩(wěn)定性，強(qiáng)烈地影響反應(yīng)過程、反應(yīng)速度、反應(yīng)活化能等[23]。因此，反應(yīng)溶劑的極性、沸點(diǎn)以及結(jié)構(gòu)對(duì)反應(yīng)效率的影響極大。通過試驗(yàn)觀察到，當(dāng)溶劑為CH2Cl2和tBuOMe時(shí)，溶劑迅速蒸發(fā)，反應(yīng)結(jié)束后基本無溶劑存在，當(dāng)溶劑為CH3CN及EtOAc時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后溶劑揮發(fā)至一半，而溶劑為THF及EtOH時(shí)，反應(yīng)溶劑基本未減少。不同溶劑的衍生化效率如圖4-D所示，當(dāng)以THF為反應(yīng)溶劑時(shí)，氨基酸的衍生化效率遠(yuǎn)高于其他溶劑，因此，THF為適宜的氨基酸PFP?；軇?。

2.2.3 氨基酸PFP酰化溫度及反應(yīng)時(shí)間篩選 氨基酸?；襟E中，氨基酸異丙酯的NH2基團(tuán)與PFPA發(fā)生劇烈而快速的反應(yīng)，最終形成易揮發(fā)的PFP產(chǎn)物。不同反應(yīng)溫度下氨基酸PFP衍生化效率差異較大，當(dāng)反應(yīng)溫度為100℃時(shí)，氨基酸PFP產(chǎn)物的含量達(dá)到最高，而當(dāng)溫度繼續(xù)上升后，反應(yīng)效率急劇下降（圖4-E）。對(duì)反應(yīng)時(shí)間的考察結(jié)果表明（圖4-F），PFP?；磻?yīng)時(shí)間與反應(yīng)效率在一定程度上呈反比，反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)效果最佳，推測(cè)生成的產(chǎn)物為易揮發(fā)化合物，若反應(yīng)時(shí)間過長，會(huì)導(dǎo)致化合物的大量揮發(fā)。因此，氨基酸PFP?；磻?yīng)的適宜反應(yīng)時(shí)間為10 min。

綜合以上結(jié)果，最終篩選出氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的高效衍生化方法為：各游離氨基酸在100℃下與4 mol?L-1異丙醇的鹽酸溶液反應(yīng)105 min，將反應(yīng)液充分干燥后，以THF為溶劑溶解氨基酸異丙酯衍生物并轉(zhuǎn)移至特制試管中，往試管中加入100 μL PFPA試劑，100℃下反應(yīng)10 min，將殘余溶劑濃縮后獲得易汽化的氨基酸五氟丙酰胺異丙酯衍生物。

圖3 混合茶樣中可檢測(cè)到的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體

A：氨基酸衍生化反應(yīng)步驟（以L-苯丙氨酸為例）；B：氨基酸酯化溫度；C：氨基酸酯化時(shí)間；D：氨基酸PFP反應(yīng)溫度；E：溶劑；F：氨基酸PFP反應(yīng)時(shí)間

2.3 茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體分析方法的回收率及精密度

在混合茶樣中添加較低濃度水平的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率介于75.26%—123.6%，RSD值介于2.09%—13.12%；添加較高濃度水平的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體標(biāo)準(zhǔn)品后，回收率介于81.23%— 121.8%，RSD值介于1.48%—10.59%（表2）。所獲得的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的回收率及分析方法的精密度均較為理想，說明分析方法的可靠性較強(qiáng)。

2.4 茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的定性定量分析

2.4.1 白茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的比例及含量 5個(gè)白茶樣品的定量分析結(jié)果如表3（白茶部分）所示，大部分氨基酸可以檢測(cè)到1—2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，但D-纈氨酸、D-亮氨酸、D-絲氨酸、D-蛋氨酸、D-酪氨酸、D-賴氨酸及D-色氨酸在所有白茶樣品中均未被檢測(cè)到。在各氨基酸的組成上，以各白茶中每種游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體含量的平均值為指標(biāo)，結(jié)果如圖5-A所示。L-茶氨酸、L-谷氨酰胺及L-谷氨酸混合物的含量遠(yuǎn)高于其他氨基酸，含量介于7.50—14.22 mg?g-1，表現(xiàn)為白毫銀針>印尼白毫銀針>白牡丹>壽眉的分布趨勢(shì)。L-天冬氨酸含量僅次于前者，介于1.58—15.58 mg?g-1，呈現(xiàn)出白毫銀針>壽眉>印尼白毫銀針>白牡丹的分布趨勢(shì)。L-半胱氨酸（1.48—2.08 mg?g-1）、D-半胱氨酸（1.46—1.49 mg?g-1）、L-絲氨酸（0.15—1.80 mg?g-1）及D-天冬氨酸（1.02—1.14 mg?g-1）等在白茶中的含量也普遍較高，但D-半胱氨酸及L-絲氨酸在白牡丹樣品1中未被檢出，D-天冬氨酸在白牡丹樣品2中未被檢出。此外，D構(gòu)型的蘇氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸（混合物）等在部分白茶中可被檢測(cè)出，但含量均不高于1.0 mg?g-1。由于白茶中含量普遍較高的L-茶氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸在滋味上均顯示鮮味特征，L-絲氨酸呈現(xiàn)甜味特征，與白茶表現(xiàn)的鮮醇滋味最為接近，因此，推測(cè)以上4種氨基酸是白茶的特征性氨基酸。

表2 游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的回收率及RSD值（%）

表3 不同茶類中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體組成及含量表

在氨基酸總量上（圖5-B），嫩度最高的白毫銀針的氨基酸對(duì)映異構(gòu)體總和達(dá)40.61 mg?g-1，印尼白毫銀針的含量次之（31.67 mg?g-1），而白牡丹及壽眉樣品中氨基酸總量相差不大，介于21.28—23.15 mg?g-1。分析結(jié)果表明，氨基酸總量與鮮葉采摘嫩度呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性，與傳統(tǒng)的認(rèn)知較為吻合。

圖5 白茶中各游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的含量分布（A）與不同白茶中游離氨基酸總量分布（B）

2.4.2 烏龍茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的比例及含量 5個(gè)烏龍茶樣品的定量分析結(jié)果如表3（烏龍茶部分）所示，大部分氨基酸可以檢測(cè)到1—2個(gè)對(duì)映異構(gòu)體，但亮氨酸的兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體、D-異亮氨酸、D-絲氨酸、D-脯氨酸、D-蛋氨酸、D-賴氨酸及D-色氨酸在所有烏龍茶樣品中均未被檢測(cè)到。在各氨基酸的組成上，以各烏龍茶中各游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的平均含量數(shù)為指標(biāo)，結(jié)果如圖6-A所示。與白茶類似，L-茶氨酸、L-谷氨酰胺及L-谷氨酸混合物的含量最高，介于3.85—6.75 mg?g-1，呈現(xiàn)出水仙>鐵觀音>大紅袍>肉桂的分布趨勢(shì)。L-天冬氨酸含量（2.75—6.59 mg?g-1）僅次于前者，在大紅袍及鐵觀音中的含量顯著高于水仙樣品。L-半胱氨酸（1.52—1.70 mg?g-1）、D-半胱氨酸（1.45—1.49 mg?g-1）、L-絲氨酸（1.03—1.50 mg?g-1）、L-蛋氨酸（1.03—1.52 mg?g-1）、L-酪氨酸（1.32—1.35 mg?g-1）及D-天冬氨酸（1.01—1.15 mg?g-1）普遍在烏龍茶中具有較高含量，且不同烏龍茶樣品間含量沒有顯著性差異。此外，低含量的D-丙氨酸、D-纈氨酸、D-酪氨酸、D-蘇氨酸、D-苯丙氨酸及D-谷氨酸（混合物）在部分甚至全部烏龍茶中被檢測(cè)到。雖然在組成上，白茶中含量較高的幾種氨基酸（L-茶氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-絲氨酸）在烏龍茶中也相對(duì)較高，但它們?cè)跒觚埐柚械暮棵黠@低于白茶，所以烏龍茶的鮮爽滋味特征明顯弱于白茶。在氨基酸總量上（圖6-B），5個(gè)烏龍茶樣品的氨基酸總量相差不大，介于21.14— 25.43 mg?g-1，其中大紅袍與鐵觀音的氨基酸總量接近，水仙及肉桂的氨基酸總量接近，后兩者含量略低于前兩者。

圖6 烏龍茶中各游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的含量分布（A）與不同烏龍茶中游離氨基酸總量分布（B）

2.4.3 普洱茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的比例及含量 普洱茶的定量分析結(jié)果如表3（普洱茶部分）所示。在氨基酸組成上（圖7），D-異亮氨酸、D-亮氨酸、D-絲氨酸及D-半胱氨酸被檢測(cè)出，含量介于0.17—0.46 mg?g-1。與其他茶類不同的是，普洱茶中L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺的總含量與其他氨基酸相比并無顯著性差異，含量僅為1.04 mg?g-1。L-蘇氨酸、L-色氨酸及L-絲氨酸在普洱中的含量也相對(duì)較高，介于0.61—0.84 mg?g-1，而L-纈氨酸及L-異亮氨酸的含量較低，均不高于0.20 mg?g-1。在氨基酸總量上，普洱的氨基酸總量為8.01 mg?g-1，明顯低于白茶和烏龍茶。

2.4.4 不同茶類間游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的含量比較 為了深入了解不同茶類間游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的具體分布差異，對(duì)已獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。由于黑茶樣本過少（僅1個(gè)），未參與到數(shù)據(jù)分析中。由圖8-A可知，采用偏最小二乘法-判別分析法（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）[24]模型可成功區(qū)分白茶與烏龍茶樣品，且其良好的擬合參數(shù)（R2Y=0.901，Q2=0.629），證明了該模型的準(zhǔn)確性。為了避免“過擬合”現(xiàn)象，進(jìn)一步對(duì)PLS-DA模型進(jìn)行200次的交叉驗(yàn)證，結(jié)果表明該驗(yàn)證模型Q2回歸直線與Y軸的截距均小于零（2=0.267，Q2=-0.198），證明了PLS-DA模型的可靠性。由PLS-DA模型及Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)[25]可知，L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺混合物、L-酪氨酸、L-天冬氨酸、L-色氨酸及L-蛋氨酸的含量在白茶與烏龍茶中具有顯著差異性，被認(rèn)為是該模型的關(guān)鍵變量（關(guān)鍵變量值（variable importance in the projection，VIP）>1，<0.05）。為了更直觀體現(xiàn)以上化合物在茶樣中的分布情況，對(duì)這些氨基酸進(jìn)行聚類分析[26]，結(jié)果如圖8-B所示。L-茶氨酸、L-谷氨酸及L-谷氨酰胺混合物在白茶中的含量顯著高于烏龍茶，這與茶葉的鮮葉原料嫩度選擇密切相關(guān)，也是白茶鮮爽滋味形成的重要來源[27]；除此之外，L-色氨酸、L-天冬氨酸在部分白茶中的含量也顯著高于烏龍茶。與前面趨勢(shì)相反的是，L-酪氨酸與L-蛋氨酸在烏龍茶中的含量普遍高于白茶樣品，前者具有一定苦味，后者有硫磺甜味，可能是導(dǎo)致烏龍茶濃醇甘爽的重要原因之一[3]。

圖7 普洱茶中各游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的含量分布

圖8 基于白茶及烏龍茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體含量的PLS-DA模型（A）及關(guān)鍵差異性氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的含量分布熱圖（B）

3 討論

由上述分析結(jié)果可知，盡管含量較低，但D-氨基酸普遍存在于不同種類茶葉中，相比L-氨基酸在茶樹生命體內(nèi)有著廣泛的分布，其代謝通路及在加工過程中的形成轉(zhuǎn)化途徑目前已有了較為廣泛的研究報(bào)道，目前關(guān)于茶葉中D-氨基酸的來源目前尚無明確說法，因此茶葉中D-氨基酸的形成轉(zhuǎn)化途徑有著重要的研究意義。來自其他相近植物或食品的研究表明，D-氨基酸可以以天然形式存在于發(fā)酵型食品中（如酸奶、酒、奶酪、醬油等）[28-30]，它們往往在乳酸發(fā)酵過程中形成，尤其是D-天冬氨酸、D-丙氨酸及D-谷氨酸等的含量在發(fā)酵后得到大幅度提高[31]。不僅如此，植物或食品加工過程中pH調(diào)節(jié)、處理時(shí)間、熱處理和加熱時(shí)間等均會(huì)促進(jìn)L-氨基酸的消旋化反應(yīng)（如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸等）[32-33]，從而生成相應(yīng)的D-構(gòu)型氨基酸。此外，還有研究表明，D-氨基酸可能是食品加工過程美拉德反應(yīng)的葡萄糖-L-氨基酸中間體的Amadori或Heyns重排產(chǎn)物，其數(shù)量及含量同樣深受pH、加熱條件、水分等加工因素影響[33-34]，且該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，直至美拉德反應(yīng)末期，氨基酸不可逆地轉(zhuǎn)化為環(huán)狀化合物或多聚物后方可結(jié)束。由此可見，茶葉中D-氨基酸的來源有多種可能性，可能天然產(chǎn)生于茶樹的次生代謝過程，與茶樹品種、產(chǎn)地、生長環(huán)境等自身屬性相關(guān)；也可能在茶葉加工過程中產(chǎn)生，如經(jīng)高溫殺青、長時(shí)間高溫干燥后通過美拉德反應(yīng)生成，或L-氨基酸在長時(shí)間萎調(diào)、大量失水后經(jīng)消旋化反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來。然而，近期的研究表明，在所測(cè)的茶樹鮮葉（福鼎大白茶、中茶108）中未檢測(cè)到D-氨基酸，說明茶葉中D-氨基酸更可能生成于采摘后的階段[15]，但因樣本量具有局限性，且暫無其他報(bào)道，所以也不能完全排除該來源，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。D-氨基酸還與茶葉的儲(chǔ)藏時(shí)間密切相關(guān)，隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的增加，D/L的含量也會(huì)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，也被證實(shí)是茶葉中D-氨基酸的重要來源[15]。值得注意的是，由于化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，不同氨基酸的反應(yīng)活性也不盡相同，如D-天冬氨酸易受加工過程的苛刻條件影響，D-丙氨酸易形成于食品的天然發(fā)酵過程中，而D-谷氨酸在以上兩種過程中均可以生成[35]，因此還需要根據(jù)不同化合物的性質(zhì)進(jìn)行模擬試驗(yàn)并具體分析，相關(guān)內(nèi)容在下一步工作中將系統(tǒng)研究。

另一方面，前人的研究報(bào)道表明，D-氨基酸可能與食品或植物的等級(jí)、儲(chǔ)藏時(shí)間、加工工藝等密切相關(guān)[6-9,31,33,36]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)部分D-氨基酸具有一定的特異性分布，具有作為判別特定茶類標(biāo)志性化合物的應(yīng)用潛力，如D-酪氨酸僅在大紅袍樣本被檢測(cè)到，且其含量也相對(duì)較高。在今后的延續(xù)性工作中，將擴(kuò)大樣本量，針對(duì)性地對(duì)不同類別、不同茶樹品種、不同環(huán)境因素茶葉中的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體分布進(jìn)行研究，以期為茶葉的品種或產(chǎn)地溯源、質(zhì)量認(rèn)證及真?zhèn)伪嫖龅葢?yīng)用領(lǐng)域提供理論參考依據(jù)。

此外，雖然本研究可以有效分離茶葉中高達(dá)15種常見的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體，且是該方法應(yīng)用于茶葉領(lǐng)域的首次報(bào)道，但該分析方法還是存在一定的局限性。首先在氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的分離上，由于茶葉中游離氨基酸種類繁多，各氨基酸的化學(xué)性質(zhì)各異，而氨基酸又需要通過衍生化后才可被儀器檢測(cè)識(shí)別，因此很難在同一個(gè)色譜體系中將所有氨基酸對(duì)映異構(gòu)體分離開。研究中發(fā)現(xiàn)，谷氨酸、谷氨酰胺及茶氨酸的衍生化產(chǎn)物均為五氟丙酰谷氨酸異丙酯，推測(cè)可能是在第一步酯化反應(yīng)時(shí)，谷氨酰胺及茶氨酸的酰胺基團(tuán)在酸性條件下發(fā)生了醇解反應(yīng)，生成了與谷氨酸相同的衍生化雙酯類產(chǎn)物。因此，采用本方法雖然可以分離出相應(yīng)的對(duì)映異構(gòu)體，但獲得的谷氨酸對(duì)映異構(gòu)體實(shí)為谷氨酸、茶氨酸及谷氨酰胺的混合物，僅可獲得三者的總含量信息，它們之間的比例關(guān)系無法得知，很大程度上限制了該方法的進(jìn)一步應(yīng)用。而且部分堿性氨基酸如組氨酸、精氨酸、鳥氨酸等，在衍生化步驟的強(qiáng)酸性環(huán)境下易分解成其他化合物，從而導(dǎo)致衍生化反應(yīng)失敗，因此也無法用本方法進(jìn)行分離。在接下來的研究工作中，將繼續(xù)開發(fā)更適合的衍生化及手性分析方法，以期分離出茶葉中更多數(shù)量的游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體，從而獲得更深層次的研究成果。其次，在氨基酸衍生化方法的優(yōu)化環(huán)節(jié)，由于本研究僅采用單因素試驗(yàn)進(jìn)行氨基酸衍生化方法的優(yōu)化，未考慮到不同參數(shù)間可能的相互作用，所篩選出來的各個(gè)參數(shù)還有進(jìn)一步的優(yōu)化空間，后續(xù)將采用正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化設(shè)計(jì)，以期進(jìn)一步降低氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)對(duì)茶葉中痕量氨基酸的精確定性定量；另一方面，本研究僅提供了廣譜性的分析方法作為參考，并非是針對(duì)所有茶類的唯一高效分析方法，在后續(xù)具體茶類的系統(tǒng)分析工作中，應(yīng)根據(jù)各茶類中氨基酸的分布特點(diǎn)，對(duì)衍生化及氨基酸測(cè)定方法的參數(shù)進(jìn)行選擇和優(yōu)化。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用酯化-五氟丙酸酐?；ńY(jié)合手性GC-MS技術(shù)時(shí)，可實(shí)現(xiàn)茶葉中高達(dá)15種重要游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的有效分離。繼而建立了茶葉中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的高效衍生化及定性定量分析方法，并查明了市售11種代表性白茶、烏龍茶及普洱茶中游離氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的分布規(guī)律。分析結(jié)果表明，在白茶中，L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、L-絲氨酸及D-天冬氨酸普遍較高；L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、L-絲氨酸、L-蛋氨酸、L-酪氨酸及D-天冬氨酸普遍在烏龍茶中具有較高含量；L-蘇氨酸、L-色氨酸及L-絲氨酸在普洱茶中的含量相對(duì)較高。在氨基酸總量上，各茶類呈現(xiàn)出白茶>烏龍茶>普洱茶的明顯規(guī)律性。多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，L-茶氨酸、L-谷氨酰胺及L-谷氨酸混合物、L-色氨酸及L-天冬氨酸在部分白茶中的含量顯著高于烏龍茶，而L-酪氨酸與L-蛋氨酸呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步提高茶葉滋味品質(zhì)化學(xué)的研究水平，可為后續(xù)茶葉風(fēng)味品質(zhì)形成機(jī)理研究及茶葉滋味品質(zhì)的提高與定向調(diào)控等應(yīng)用領(lǐng)域奠定重要的科學(xué)理論基礎(chǔ)。

[1] 林智, 尹軍峰, 呂海鵬. 茶葉深加工技術(shù). 北京: 科學(xué)出版社, 2020: 7.

LIN Z, YIN J F, Lü H P. Tea Deep-Processing Technology. Beijing: Science Press, 2020: 7. (in Chinese)

[2] 宛曉春. 茶葉生物化學(xué). 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003: 32-35.

WANG X C. Tea Biochemistry. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 32-35. (in Chinese)

[3] Solms J. Taste of amino acids, peptides, and proteins. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1969, 17(4): 686-688.

[4] WIESER H, JUGEL H, BELITZ H-D. Relationships between structure and sweet taste of amino acid. Z Lebensm Unters Forsch,1977, 164: 277-282.

[5] KATO H, RHUE M R, NISHIMURA T. Role of free amino acids and peptides in food taste//Flavor Chemistry: Trends and Developments. TERANISHI R, BUTTERY R G, SHAHID F, American Chemical Society: Washington, DC, 1989: 158-174.

[6] ZHAO Y s, LI P, GE L, WANG Y, MO T, ZENG X P, WANG X D. Effect of electrolyzed reduced water on chiral theanine and polyphenols in tea. Food Chemistry, 2012, 134 (4): 1761-1766.

[7] FIORI J, PASQUINI B, CAPRINI C, ORLANDINI S, FURLANETTOS, GOTTI R. Chiral analysis of theanine and catechin in characterization of green tea by cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography and high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 2018, 1562: 115-122.

[8] EKBORG-OTT K H, TAYLOR A., ARMSTRONG D W. Varietal differences in the total and enantiomeric composition of theanine in tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1997, 45(2): 353-363.

[9] HORANNI R, ENGELHARDT U H. Enantiomeric analysis of theanine in different teas () using Marfey’s reagent. European Food Research and Technology, 2015, 240: 61-70.

[10] DESAI M J, ARMSTRONG D W. Analysis of derivatized and underivatized theanine enantiomers by high-performance liquid chromatography/atmospheric pressure ionization-mass spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry, 2004, 18: 251-256.

[11] 李銀花, 李娟, 劉仲華, 黃建安. 配體交換色譜手性固定相法拆分與定量茶氨酸對(duì)映體. 福建分析測(cè)試, 2010, 19(1): 10-13.

LI Y H, LI J, LIU Z H, HUANG J A. Separation and quantitation of theanine enantiomer on ligand exchange chromatography with chiral stationary phase, Fujian Analysis & Testing, 2010, 19(1): 10-13. (in Chinese)

[12] 李銀花, 劉仲華, 黃建安. 配體交換色譜手性流動(dòng)相法拆分和定量茶氨酸對(duì)映體. 茶葉科學(xué), 2006, 26(4): 280-284.

LI Y H, LIU Z H, HUANG J A. Separation and quantitation of theanine enantiomers on ligand exchange chromatography with chiral mobile phase. Journal of Tea Science, 2006, 26(4): 280-284. (in Chinese)

[13] 李銀花, 劉仲華, 黃建安. 手性衍生-高效液相色譜法拆分和定量測(cè)定茶氨酸對(duì)映體. 色譜, 2007, 25(5): 719-722.

LI Y H, LIU Z H, HUANG J A. Separation and quantification of theanine enantiomers using high performance liquid chromatography coupled with chiral derivatization. Chinese Journal of Chromatography, 2007, 25(5): 719-722. (in Chinese)

[14] WANG X Y, WU H H, LUO R Y, XIA D H, JIANG Z J, HAN H. Separation and detection of free D- and L-amino acids in tea by off-line two-dimensional liquid chromatography. Analytical Methods, 2017, 9(43): 6131-6138.

[15] XU Y, LIU Z Y, Liu Z Y, FENG Z H, ZHANG L, WAN X C, YANG X G. Identification of D-amino acids in tea leaves. Food Chemistry, 2020, 317: 126428.

[16] 祝馨怡, 蔡迎春, 陳立仁, 李永民.-氨基酸在-苯丙氨酸手性配體交換色譜固定相上的分離研究. 化學(xué)試劑, 2003, 25(2): 65-68.

ZHU X Y, CAI Y C, CHEN L R, LI Y M. Study on the separation of-amino acid using-phenylalanine chiral ligand exchange chromatography as the stationary phase. Chemical Reagent, 2003, 25(2): 65-68. (in Chinese)

[17] GRüNER B, HOLUB J, PLE?EK J, VANěK T, VOTAVOVá H. High-performance liquid chromatographic enantiomeric resolution in the ten-vertex carborane series: Comparison of acyetl- and native- cyclodextrin bonded chiral stationary phases. Journal of Chromatography A, 1998, 793(2): 249-256.

[18] 方駿, 夏小慶, 吳勇勇. 使用手性冠醚的高效液相色譜法研究伯胺類藥物的手性分離. 中國藥物化學(xué)雜志, 2003, 13(1): 48-50.

FANG J, XIA X Q, WU Y Y. Study on chiral separation of amino drugs by HPLC utilizing crown ethers. Chinese Journal of Medicinal Chemistry, 2003, 13(1): 48-50. (in Chinese)

[19] KARL B, HALKET J M. Handbook of Derivatives for Chromatography (2nd). Chichester: John Wiley & Sons, 1993.

[20] SHEN X Z, DENG C H, WANG B, DONG L. Quantification of trimethylsilyl derivatives of amino acid disease biomarkers in neonatal blood samples by gas chromatography-mass spectrometry. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2006, 384(4): 931-938.

[21] 何紅波, 張威, 解宏圖, 侯松嵋, 張旭東. 測(cè)定土壤氨基糖和氨基酸手性異構(gòu)體中氮同位素比值的氣相色譜-質(zhì)譜方法. 土壤學(xué)報(bào), 2009, 46(2): 289-298.

HE H B, ZHANG W, XIE H T, HOU S M, ZHANG X D. A Gc/Ms method to assess 15n ratios in soil amino sugars and amino acid enantiomers. Acta Pedologica Sinica, 2009, 46(2): 289-298. (in Chinese)

[22] 邢其毅, 裴偉偉, 徐瑞秋, 裴堅(jiān). 基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)（第3版）. 北京: 高等教育出版社, 2005.

XING Q Y, PEI W W, XU R Q, PEI J. Basic Organic Chemistry (3rd ed). Beijing: Higher Education Press, 2005. (in Chinese)

[23] 丁永勝, 牟世芬. 氨基酸的分析方法及其應(yīng)用進(jìn)展. 色譜, 2004, 22(3): 210-215.

DING Y S, MOU S F. Development of analytical methods for amino acids and their applications. Chinese Journal of Chromatography2004, 22(3): 210-215. (in Chinese)

[24] 陳勤操, 戴偉東, 藺志遠(yuǎn), 解東超, 呂美玲, 林智. 代謝組學(xué)解析遮陰對(duì)茶葉主要品質(zhì)成分的影響. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(6): 1066-1077.

CHEN Q C, DAI W D, LIN Z Y, XIE D C, Lü M L, LIN Z. Effects of shading on main quality components in tea ((L) O. Kuntze) leaves based on metabolomics analysis. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(6): 1066-1077. (in Chinese)

[25] ZHU Y, SHAO C, LV H, ZHANG Y, DAI W D, GUO L, TAN J F, PENG Q H, LIN Z. Enantiomeric and quantitative analysis of volatile terpenoids in different teas (). Journal of Chromatography A, 2017, 1490: 177-190.

[26] SINGH S K, KOLE P C, MISRA A K, ROY S, ARYA L, VERMA M, BHARDWAJ R, SUNEJA P, VERMA M R, BHAT K V, SINGH R. Characterization of(Linn.) Britt based on morphological, biochemical and STMS markers. Industrial Crops and Products, 2017, 109, 773-785.

[27] 陳宗懋, 楊亞軍. 中國茶經(jīng). 上海: 上海文化出版社, 2011.

CHEN Z M, YANG Y J. The Classic of Chinese Tea. Shanghai: Shanghai Cultural Publishing House, 2011. (in Chinese)

[28] BRüCKNER H, HAUSCH M. D-amino acids in dairy products: detection, origin and nutritional aspects. I. Milk, fermented milk, fresh cheese and acid curd cheese. Milchwissenschaft, 1990, 45: 357-360.

[29] ERBE T, BRüCKNER H. Chromatographic determination of amino acid enantiomers in beers and raw materials used for their manufacture. Journal of Chromatography A, 2000, 881 (1-2): 81-91.

[30] GOGAMI Y, OKADA K, OIKAWA T. High-performance liquid chromatography analysis of naturally occurring D-amino acids in sake. Journal of Chromatography B, 2011, 879(29): 3259-3267.

[31] MARCONE G L, ROSINI E, CRESPI E, POLLEGIONI L. D-amino acids in foods. Applied Microbiology and Biotechnology, 2020, 104(2): 555-574.

[32] PALLA G, MARCHELLI R, DOSSENA A, CASNATI G. Occurrence of D-amino acids in food: detection by capillary gas chromatography and by reversed-phase high-performance liquid chromatography with L-phenylalaninamides as chiral selectors. Journal of Chromatography A, 1989, 475(1): 45-53.

[33] GENCHI G. An overview on D-amino acids. Amino Acids, 2017, 49: 1521-1533.

[34] P?TZOLD R, NIETO-RODRIGUEZ A, BRüCKNER H. Chiral gas chromatographic analysis of amino acids in fortified wines. Chromatographia, 2003, 57(Suppl. l): 207-211.

[35] PRANDI B, FACCINI A, LAMBERTINI F, BENCIVENNI M, JORBA M, DROOGENBROEK B V, BRUGGEMAN G, SCH?BER J, PETRUSAN J, ELST K, SFORZA S. Food wastes from agrifood industry as possible sources of proteins: a detailed molecular view on the composition of the nitrogen fraction, amino acid profile and racemisation degree of 39 food waste streams. Food Chemistry, 2019, 286: 567-575.

[36] ALI H, P?TZOLD R, BRüCKNER H. Determination of L- and D-amino acids in smokeless tobacco products and tobacco. Food Chemistry, 2006, 99(4): 803-812.

Enantiomeric Analysis of Free Amino Acids in Different Teas

ZHU Yin, ZHANG Yue, YAN Han, Lü HaiPeng, LIN Zhi

Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Tea Biology and Resource Utilization of Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008

【】Free amino acids are the main chemical compositions in teas, and they are closely related to the taste quality of tea. In account of the existence of stereogenic centers, most amino acids contain two enantiomers (D and L configurations) with obviously different taste characteristics and biological activities. However, due to the limitation of detection technology, the studies of L-amino acids were focused in the previous work, and the D-amino acids have been rarely studied. Therefore, the study on the enantiomers of free amino acids in teas is very important for deepening the theoretical system of tea chemistry and is beneficial for improving and controlling of tea taste quality. 【】In this study, the separation performance of free amino acid enantiomers (Chiral HPLC, Silanization of mtbstfa and Esterification PFP acylation) was compared by using three different analytical methods. A total of 15 pairs of amino acids, including alanine, valine, threonine, isoleucine, leucine, proline, serine, cysteine, aspartic acid, methionine, phenylalanine, glutamic acid, tyrosine, lysine and tryptophan, were effectively separated by using esterification- pentafluoropropionic acylation combined with chiral gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Furthermore, the efficient derivatization, qualitative and quantitative analysis approaches were established, and the distribution regularities of amino acids enantiomers in 11 representative commercial white, oolong and pu-erh teas were investigated. 【】The derivatization conditions were showed as follows: the reaction mixture was esterified at 100oC for 105 min, and then further acylated by pentafluoropropionic anhydride using tetrahydrofuran as the solvent at 100oC for 10 min. Recoveries of the free amino acid enantiomers were ranged from 75.26% to 123.6% (low concentration) and from 81.23% to 121.8% (high concentration), and the corresponding RSDs were ranged from 2.09% to 13.12% (low concentration) and from 1.48% to 10.59% (high concentration). The analysis results indicated that 1-2 enantiomers of most amino acids could be detected, and D-amino acids were frequently distributed in most tea samples, especially D-threonine, D-aspartic acid, D-cysteine, D-phenylalanine, and the mixture of D-theanine, D-glutamic acid and D-glutamine. On the contrary, D-methionine, D-lysine and D-tryptophan were unable to be detected in all samples. As for the detailed content distributions, in addition to the mixture of L-theanine, L-glutamic acid and L-glutamine and L-aspartic acid, L-cysteine (1.48-2.08 mg?g-1), D-cysteine (1.46-1.49 mg?g-1), L-serine (0.15-1.80 mg?g-1) and D-aspartic acid (1.02-1.14 mg?g-1) presented higher contents in white teas, L-cysteine (1.52-1.70 mg?g-1), D-cysteine (1.45-1.49 mg?g-1), L-serine (1.03-1.50 mg?g-1), L-methionine (1.03-1.52 mg?g-1), L-tyrosine (1.32-1.35 mg?g-1) and D-aspartic acid (1.01-1.15 mg?g-1) were abundant in oolong teas. In pu-erh teas, no significant differences on the contents between the mixture of L-theanine, L-glutamic acid and L-glutamine (1.04 mg?g-1) and other amino acids, and L-threonine, L-tryptophan, and L-serine presented relatively high content levels ranging from 0.61 to 0.84 mg?g-1. The content distribution of the total amino acids were presented the following tendency: white tea (up to 40.61 mg?g-1) > oolong tea (up to 25.43 mg?g-1) > pu-erh tea (8.01 mg?g-1). Moreover, multivariate statistical analysis results indicated that the mixture of L-theanine, L-glutamic acid and L-glutamine, L-tryptophan, L-aspartic acid, L-tyrosine and L-methionine showed significant content differences, and the first three enantiomers were abundant in white teas, and other compounds were rich in oolong teas.【】D-amino acids could be detected in most teas, indicating their potential impact on the taste quality of tea infusion. However, no significant differences on the content distribution of D-amino acids were observed among different kinds of teas used in our study.

tea; free amino acids; enantiomers; gas chromatography-mass spectrometry; pentafluoropropionic anhydride

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.012

2020-05-19；

2020-09-27

國家自然科學(xué)基金（31701702）、浙江省自然科學(xué)基金（LQ15C160007）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-19）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

朱蔭，Tel：0571-87967281；E-mail：zhuy_scu@tricaas.com。通信作者林智，Tel：0571-86650617；E-mail：linzhi@caas.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）