熱效應(yīng)對(duì)小麥醇溶蛋白起泡性與結(jié)構(gòu)的影響

王立峰，朱潔，熊文飛，趙萌，袁建，鞠興榮

熱效應(yīng)對(duì)小麥醇溶蛋白起泡性與結(jié)構(gòu)的影響

王立峰，朱潔，熊文飛，趙萌，袁建，鞠興榮

南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，南京 210023

【】來源于小麥面筋的醇溶蛋白由于具有較強(qiáng)的表面疏水性能，其通過乙醇-水溶液反溶劑制備的膠體粒子展現(xiàn)突出的起泡能力和穩(wěn)定性。然而，小麥醇溶蛋白膠體粒子在熱效應(yīng)作用下的泡沫特性表現(xiàn)還未得到揭示。因此，為進(jìn)一步推動(dòng)小麥醇溶蛋白膠體粒子在真實(shí)食品體系中的應(yīng)用，研究了不同加熱溫度和加熱時(shí)間對(duì)小麥醇溶蛋白膠體粒子起泡能力和穩(wěn)定性的影響。將小麥醇溶蛋白在不同溫度下（50、70和90℃）分別處理15、30和60 min后，通過反溶劑法制備小麥醇溶蛋白膠體粒子，測(cè)定其起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。通過測(cè)定熱處理后膠體粒子的尺寸、表面電勢(shì)、蛋白溶解度的變化，借助原子力顯微鏡、SDS凝膠電泳、紅外光譜、熒光光譜、圓二色譜、紫外光譜、DSC及小角X光散射分析熱處理后的小麥醇溶蛋白表面形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律。經(jīng)熱處理后的小麥醇溶蛋白膠體粒子的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別提高了25%和85%。隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，小麥醇溶蛋白膠體粒子發(fā)生了部分聚集，粒子尺寸增加，顆粒尺寸主要分布在105—122 nm，ζ-電位降低，90℃時(shí)聚集程度更高；加熱溫度對(duì)蛋白溶解度無明顯影響，隨著加熱時(shí)間的增加，蛋白的溶解度有了顯著的提高；熱效應(yīng)使蛋白分子內(nèi)部的疏水氨基酸暴露，導(dǎo)致了表面疏水性的增加；二硫鍵含量減少，游離巰基含量并無顯著差異，其原因可能是醇溶蛋白在受熱過程中發(fā)生了SH/SS交換反應(yīng)。高溫處理改變了小麥醇溶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，90℃下的蛋白熒光強(qiáng)度降低，-折疊含量減少，無規(guī)則卷曲含量增加，蛋白結(jié)構(gòu)高度伸展，并伴隨著部分去折疊。DSC結(jié)果顯示小麥醇溶蛋白膠體粒子的最高能量從54.33 mW降低到3 mW左右，加熱后的譜圖比較平緩，蛋白質(zhì)的構(gòu)象隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)趨向于無定形態(tài)。熱效應(yīng)使小麥醇溶蛋白膠體粒子發(fā)生聚集，蛋白內(nèi)部疏水基團(tuán)的暴露使粒子表面疏水性增強(qiáng)；熱處理改善了小麥醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)柔性（尤其是90℃的處理），這更有利于形成穩(wěn)定的界面膜從而更好地穩(wěn)定泡沫，能夠有效改善小麥醇溶蛋白膠體粒子的泡沫特性，對(duì)于增強(qiáng)其在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有突出的實(shí)際意義。

小麥醇溶蛋白；起泡性；結(jié)構(gòu)柔性；表面疏水性

0 引言

【研究意義】泡沫型食品（如冰淇淋、蛋糕、面包等）的質(zhì)構(gòu)調(diào)控通常需要借助兩親性表面活性劑來實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)的兩親性小分子活性劑（如蔗糖酯、單甘酯等）均通過化學(xué)合成制備，盡管具有較高的界面活性，但過多食用可能會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響[1-2]，因此在使用范圍和用量上均存在極大限制。近年來，尋找和發(fā)掘高性能純天然起泡劑用于調(diào)控泡沫型食品的品質(zhì)是普遍關(guān)注的焦點(diǎn)。蛋白質(zhì)因其天然的氨基酸結(jié)構(gòu)屬性，不僅是人體膳食的宏量營養(yǎng)素，且具有優(yōu)良的界面活性。因此，當(dāng)前被認(rèn)為是天然起泡劑的首選。例如大豆分離蛋白具有良好的起泡能力，可以有效的代替小分子表面活性劑，但其在加工過程中的穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定的限制[3]。因此，有必要進(jìn)一步發(fā)掘和制造新型食用膠體顆粒作為發(fā)泡劑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】小麥醇溶蛋白是工業(yè)小麥淀粉分離的副產(chǎn)物，對(duì)面筋的發(fā)泡性能起主要作用。小麥醇溶蛋白分子中心區(qū)域富含谷氨酰胺和脯氨酸，末端區(qū)域富含疏水性氨基酸。其分子中的兩親性表明它可能具有作為表面活性劑和穩(wěn)定泡沫的潛力。研究發(fā)現(xiàn)小麥醇溶蛋白具有良好的發(fā)泡特性[4]，但其在水中的低溶解性和低分散性限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。為解決這一問題，可采用反溶劑法將小麥醇溶蛋白制備成納米顆粒，以提高其在水中的分散性[5]。盡管小麥醇溶蛋白具有較好的起泡能力與泡沫穩(wěn)定性，但為了滿足食品加工的需求，進(jìn)一步提高其泡沫特性顯得很有必要。熱處理作為食品工業(yè)中常用的操作單元，是一種綠色高效的蛋白質(zhì)改性手段。已有研究表明預(yù)熱處理顯著提高了乳清蛋白在氣-水界面上的表面張力，熱誘導(dǎo)引起的乳清分離蛋白（WPI）的聚集增強(qiáng)了其泡沫穩(wěn)定性[6]。大豆分離蛋白在熱處理下的發(fā)泡能力和穩(wěn)定性也有一定的提高[7]。Phillips等[8]研究了在pH 4.0、5.0和7.0下加熱乳清濃縮蛋白對(duì)發(fā)泡性能的影響，pH 4.0和55℃是獲得穩(wěn)定泡沫的最佳條件，原因可能是-乳球蛋白的部分去折疊導(dǎo)致薄膜中蛋白質(zhì)間相互作用的增加?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】小麥醇溶蛋白膠體粒子通過反溶劑法可以很好地分散在水溶液中，但其在熱效應(yīng)作用下的泡沫特性表現(xiàn)還未得到揭示?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用反溶劑法耦合熱效應(yīng)制備小麥醇溶蛋白膠體粒子，通過測(cè)定其粒徑、電位、表面疏水性、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)等指標(biāo)研究熱處理對(duì)其起泡性及結(jié)構(gòu)的影響，以推動(dòng)小麥醇溶蛋白在泡沫型食品體系的應(yīng)用。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 材料與試劑

谷阮粉（市售），購于西安博聯(lián)特化有限公司，蛋白質(zhì)含量77%，水分含量8%。

無水乙醇、乙酸、溴化鉀、BCA蛋白測(cè)試試劑均為分析純，購于南京化學(xué)試劑公司；5,5-二硫基-雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）、Tris-甘氨酸（Tris-Gly）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、考馬斯亮藍(lán)、甘油、溴酚藍(lán)、-巰基乙醇均為生化試劑，購于Sigma-Aldric。

數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；AE150 pH測(cè)定儀，常州國華電器有限公司；Mze多功能酶標(biāo)儀，上海市離心機(jī)械研究所；AL204分析天平，德國梅特勒托利多；Nano-ZS納米粒度儀，英國馬爾文公司；UV-3900紫外可見分光光度計(jì)，日本日立公司；F-700熒光光譜儀，日本日立公司；Q2000差示掃描量熱儀，美國TA儀器；MOS-450圓二色譜儀，法國Bio-Logic公司；SAXSess小角X光散射儀，奧地利Anton-Paar公司；Multimode原子力顯微鏡，德國布魯克；高速剪切均質(zhì)機(jī)（360 W），寧波新芝。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥醇溶蛋白的提取 將谷朊粉樣品1﹕10溶于70%的乙醇溶液中，室溫下攪拌3 h，8 000 r/min離心20 min，取上清液于4℃下靜置一晚，再次于8 000 r/min離心20 min得上清液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，凍干備用。

1.2.2 小麥醇溶蛋白的熱處理 將凍干的小麥醇溶蛋白溶于70%（w/w）的乙醇溶液中，得到濃度為10 mg·mL-1的蛋白質(zhì)溶液，分別取20 mL蛋白質(zhì)溶液置于玻璃瓶中并密封，在50℃、70℃、90℃分別水浴加熱15、30和60 min。熱處理結(jié)束后立即將樣品放入冰水中冷卻至室溫備用，樣品編號(hào)50-15、50-30、50-60分別表示50℃加熱15、30和60 min，70-15、70-30、70-60和90-15、90-30、90-60為同樣的含義。

1.2.3 小麥醇溶蛋白納米顆粒的制備 將熱處理過的溶液以1﹕5（體積比）逐滴加入蒸餾水（含0.2%乙酸，w/v）中，制備后的樣品溶液pH為3.5，并保存于4℃冰箱中待用。

1.2.4 小麥醇溶蛋白溶解性的測(cè)定 使用BCA法測(cè)量溶液中蛋白質(zhì)的含量，使用BSA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將反溶劑后的蛋白溶液在10 000×下離心15 min，取上清液加入BCA試劑，37℃下震蕩30 min后測(cè)定其在562 nm處的吸光值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。蛋白質(zhì)溶解度為上清液中蛋白濃度/原樣品中蛋白濃度。

1.2.5 SDS-PAGE凝膠電泳 聚丙烯酰胺分離凝膠濃度為12%（w/v），濃縮凝膠濃度為5%（w/v）并含有4% SDS（w/v）。將蛋白質(zhì)溶于由10 mol·L-1Tris-HCl、10%（w/w）甘油、0.02%（w/w）溴酚藍(lán)、2%（w/w）SDS和5%（v/v）-巰基乙醇組成的緩沖溶液（pH 8.0），制備0.2 mg·mL-1的樣品溶液。樣品在100℃加熱3 min后，于1 500×離心10 min，用考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)上清液進(jìn)行染色，用甲醇﹕乙酸﹕水（50﹕10﹕40）（v/v/v）乙酸進(jìn)行脫色。

1.2.6小麥醇溶蛋白納米顆粒的電位和粒徑測(cè)定 使用納米粒度電位儀測(cè)量樣品（濃度為1%，w/v）的Zeta電位、平均粒徑和多分散指數(shù)（PDI），結(jié)果由儀器自帶軟件計(jì)算。所有測(cè)量均在25℃下進(jìn)行，重復(fù)3次。

1.2.7 起泡性測(cè)定 取15 mL樣品，記錄此時(shí)體積為V0，使用均質(zhì)機(jī)于8 000 r/min攪拌1 min，立即將泡沫轉(zhuǎn)移至量筒中，分別記錄下2 min（V1）和30 min（V2）時(shí)的泡沫體積，以計(jì)算蛋白質(zhì)的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性。

起泡能力（FC）=V1/V0′100% （1）

泡沫穩(wěn)定性（FS）=V2/V1′100% （2）

1.2.8 表面疏水性測(cè)定 使用8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）作為外源熒光探針[9]，測(cè)定方法參見文獻(xiàn)[10]。首先將ANS溶于10 mL去離子水，然后將蛋白質(zhì)溶液分別稀釋到2×10-5、4×10-5、6×10-5、8×10-5、1×10-4和1.2×10-4mg·mL-1，取4 mL稀釋后的樣品加入20 μL ANS溶液。溶液在285 nm處激發(fā)，用熒光分光光度計(jì)測(cè)量400—650 nm的發(fā)射光譜，發(fā)射和激發(fā)狹縫為5 nm，然后在25℃下測(cè)量熒光強(qiáng)度。根據(jù)得到的熒光強(qiáng)度對(duì)濃度作圖，得到的斜率即為表面疏水性指數(shù)H。

1.2.9 紫外可見吸收光譜 將第1.2.3節(jié)所制備的小麥醇溶蛋白溶液適當(dāng)稀釋（0.2 mg·mL-1），然后使用紫外可見分光光度計(jì)在200—700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.10 內(nèi)源熒光光譜 采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品內(nèi)源熒光光譜。發(fā)射波長(zhǎng)為300—500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm，發(fā)射和激發(fā)狹縫寬均為10.0 nm，電壓為550 mV，測(cè)量溫度恒定為25℃，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。樣品濃度0.01 mg·mL-1。

1.2.11 SH/SS含量測(cè)定 游離巰基測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[11]。2 mL天然和熱處理樣品溶液分別加入10 mL Tris-Gly緩沖液（0.09 mol·L-1Gly、0.086 mol·L-1Tris、8 mol·L-1尿素、0.004 mol·L-1EDTA）。取2 mL樣品溶液加入50 μL Ellman’s試劑（4 mg·mL-1DTNB），立即震蕩搖勻，15 min后在412 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（A412）?？値€基測(cè)定用含6 mol?L-1鹽酸胍的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1、pH 8.0）代替磷酸緩沖液，其他步驟相同。游離巰基計(jì)算公式如下：

游離巰基（free SH，μmol·g-1protein）=73.53A412/C （3）

式中，73.53=106/(1.36×104)，1.36×104是Ellman’s試劑的摩爾消光系數(shù)；A412為λ=412 nm下吸光值；C為蛋白濃度（mg·mL-1）。

二硫鍵的含量=（總巰基含量-游離巰基含量）/2（4）

1.2.12 差示掃描量熱（DSC） 稱量?jī)龈珊蟮臉悠罚?—5 mg）密封在鋁盤中，放入差示掃描量熱儀中測(cè)定，以空盤為參考樣品。溫度掃描范圍為20—300℃，掃描速率為10℃·min-1，得到試樣的DSC熱效應(yīng)曲線。相同條件下測(cè)定的兩個(gè)空鋁盤作為基線，在最終數(shù)據(jù)中扣除基線背景。

1.2.13 小角X光散射（SAXS） SAXS測(cè)量在以30 W操作的Nano STAR系統(tǒng)（Bruker，Germany）上進(jìn)行。使用CuKα輻射（λ=0.1542 nm）作為X射線源。使用V?nTeC-2000檢測(cè)器收集散射數(shù)據(jù)。將樣品在環(huán)境條件下保持4 h以達(dá)到平衡。將放有水的空樣品池用作背景。散射矢量q（?-1）定義為q=4πsinθ/λ（2θ，散射角）。測(cè)量10次，取平均值，除去溶劑背景基線，得到SAXS曲線。Kratky圖（2I（）vs）用于檢測(cè)樣品的折疊構(gòu)象[12]。

1.2.14 原子力顯微鏡(AFM) 采用原子力顯微鏡對(duì)顆粒形態(tài)進(jìn)行觀察，將3 μL小麥醇溶蛋白溶液（0.1 mg·mL-1）滴在新制備的云母片表面，并在室溫下干燥2 h，在顯微鏡下使用納米探針懸臂尖端在敲擊模式下收集形態(tài)圖像，頻率50—100 kHz，使用AMF儀器軟件（Nanoscope Analysis version 1.50，Bruker Corporation，Billerica，MA）進(jìn)行圖像分析。

1.2.15 圓二色譜 先用pH 3.5的去離子水稀釋蛋白樣品至0.1 mg·mL-1，采用MOS-450圓二色光譜儀（法國Bio Logic公司）進(jìn)行測(cè)定。將掃描參數(shù)設(shè)置為樣品池光程為2 mm，掃描波長(zhǎng)190—250 nm，分辨率0.5 nm，靈敏度100 mdeg·cm-1，掃描速度100 nm·min-1。試驗(yàn)在25℃下測(cè)定，試驗(yàn)值為4次掃描均值。

1.2.16 數(shù)據(jù)分析 使用Excel 2017和SPSS Inc公司的SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)分析，所有試驗(yàn)至少測(cè)量3次，結(jié)果為平均值。采用單因素方差分析（ANOVA）估計(jì)差異的顯著性（< 0.05）。使用Excel 2017軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 熱效應(yīng)對(duì)小麥醇溶蛋白泡沫能力的影響

如圖1所示，當(dāng)加熱溫度為50℃時(shí)，隨著熱處理時(shí)間的增加，起泡能力逐漸增強(qiáng)。但加熱溫度的進(jìn)一步增加對(duì)蛋白質(zhì)起泡能力的改善并未產(chǎn)生顯著影響（圖1-A）?？傮w上看，在50℃處理60 min即可達(dá)到最高的起泡能力。初步推測(cè)這種起泡性能的增強(qiáng)與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和理化特性的轉(zhuǎn)變相關(guān)。值得注意的是，與對(duì)照組相比，熱處理顯著提高了小麥醇溶蛋白的泡沫穩(wěn)定性（約85%）。原因可能是熱處理使蛋白質(zhì)產(chǎn)生了聚集，這些聚集體會(huì)吸附在空氣/水界面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高泡沫的穩(wěn)定性[13]。

2.2 加熱對(duì)小麥醇溶蛋白溶解度的影響

小麥醇溶蛋白的溶解性會(huì)對(duì)其功能特性產(chǎn)生一定的影響。如圖2所示，加熱溫度對(duì)小麥醇溶蛋白溶解度的影響并不明顯，小麥醇溶蛋白的溶解度在加熱初期并無明顯變化。而隨著加熱時(shí)間的增加，小麥醇溶蛋白的溶解性有了顯著的提高，這可能是由于蛋白質(zhì)在不同加熱時(shí)間下的變性程度不同所致。已有研究表明適當(dāng)?shù)臒崽幚頃?huì)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開，暴露其結(jié)構(gòu)內(nèi)的疏水基團(tuán)，從而顯著改善蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)[14]。

2.3 加熱對(duì)小麥醇溶蛋白納米顆粒電位和粒徑的影響

顆粒的粒徑尺寸主要分布在105—122 nm，PDI值較小，顆粒較為集中。當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)，隨著加熱時(shí)間的增加，顆粒的尺寸呈上升趨勢(shì)（圖3-A）。這表明較高溫度的熱處理會(huì)誘導(dǎo)小麥醇溶蛋白發(fā)生聚集。另一方面，蛋白質(zhì)的Zeta電位可以反應(yīng)蛋白質(zhì)表面電荷的情況[15]。如圖3-B所示，小麥醇溶蛋白膠體粒子的Zeta電位是在pH 3.5下測(cè)得，表明小麥醇溶蛋白帶正電荷（與小麥醇溶蛋白等電點(diǎn)6.5符合），隨著加熱溫度及時(shí)間的升高，Zeta電位有下降趨勢(shì)，表明蛋白表面電荷減少，熱處理溫度為90℃時(shí)更為明顯。高溫會(huì)使蛋白構(gòu)象發(fā)生伸展，引起分子表面帶電氨基酸的重排，導(dǎo)致表面電荷的變化。表面電荷減少，粒子的靜電相互作用增大。通過靜電相互作用產(chǎn)生的吸引力會(huì)引起粒子的聚集，導(dǎo)致粒徑的增大[16]。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。下同 Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05). The same as below

圖2 不同熱處理溫度對(duì)小麥醇溶蛋白溶解度的影響。

2.4 加熱對(duì)小麥醇溶蛋白表面疏水性和巰基含量的影響

蛋白質(zhì)中氨基酸殘基非極性側(cè)鏈之間的疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力，可以通過測(cè)定非極性物質(zhì)ANS與蛋白質(zhì)疏水基結(jié)合量的多少來間接揭示[17]。圖4-A為ANS熒光探針法測(cè)得的不同顆粒表面疏水指數(shù)H。結(jié)果顯示，在50℃時(shí)，H數(shù)值變化不明顯；當(dāng)溫度上升到70℃時(shí)，H顯著提高，并且隨著加熱時(shí)間的增加持續(xù)升高。與對(duì)照組相比，90℃加熱60 min導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性提高了約1倍，通常蛋白質(zhì)的去折疊和疏水性殘基的暴露是表面疏水性增大的原因[18]。該現(xiàn)象意味著90℃熱處理的蛋白暴露了更多的疏水基團(tuán)，形成表面活性顆粒，更有利于蛋白在水氣界面的吸附，并進(jìn)一步發(fā)生相互作用，形成穩(wěn)定的界面膜從而更好地穩(wěn)定泡沫[19]。熱處理過程中的小麥醇溶蛋白的游離巰基基本穩(wěn)定（圖4-B），隨著溫度的升高，二硫鍵含量降低，小麥醇溶蛋白在不同溫度下表現(xiàn)出了分子間二硫鍵的聚合（圖4-C），游離巰基含量的微弱變化可能是由于醇溶蛋白中發(fā)生了SH/SS交換反應(yīng)。在較高溫度下，二硫鍵的存在是醇溶蛋白折疊的主要原因[20]。

圖3 不同熱處理對(duì)小麥醇溶蛋白顆粒尺寸/PDI（A）和表面電勢(shì)（B）的影響

圖4 不同熱處理對(duì)小麥醇溶蛋白表面疏水性（A）、自由巰基含量（B）和二硫鍵（C）的影響

2.5 原子力顯微鏡成像觀察分析

本研究選取熱處理溫度為90℃時(shí)，對(duì)其構(gòu)象變化進(jìn)行進(jìn)一步的表征。原子力顯微鏡（AFM）可用于樣品的成像與表征，具有成像范圍小、速度慢、受探頭影響較大等諸多特點(diǎn)[21]。如圖5-A所示，熱處理后的小麥醇溶蛋白膠體粒子的顆粒尺寸有所減小，并隨著時(shí)間的增加，蛋白出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，與圖3-A的結(jié)果一致。這是由于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團(tuán)隨著加熱時(shí)間的增加逐漸暴露并相互作用，分子相互靠近從而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。

A：對(duì)照組 Control；B：90-15；C：90-30；D：90-60

2.6 加熱對(duì)小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的影響

如圖6-A所示，首先采用SDS-PAGE凝膠電泳法分析天然和熱處理后的蛋白亞基組成的變化，結(jié)果顯示天然和熱處理蛋白亞基間未展現(xiàn)出顯著差異。為了進(jìn)一步闡明熱處理對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的影響，采用紫外吸收光譜、熒光光譜及圓二色譜對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。通常情況下，在紫外吸收光譜中，蛋白質(zhì)在250 nm和290 nm處的峰值主要是由于苯丙氨基酸殘基及兩種芳香氨基酸的存在（酪氨酸和色氨酸）[22]。結(jié)果顯示（圖6-B），熱處理后蛋白波長(zhǎng)的吸收峰值明顯升高，并有輕微的紅移，這說明蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。此外，利用熒光光譜對(duì)蛋白構(gòu)象變化進(jìn)行進(jìn)一步的探究。在熒光光譜中，發(fā)色基團(tuán)所處微環(huán)境極性的升高或降低會(huì)導(dǎo)致熒光信號(hào)強(qiáng)度的減少或增加以及最大發(fā)射波長(zhǎng)的紅移或藍(lán)移現(xiàn)象[23]。如圖6-C所示，所有樣品在345 nm處顯示出峰，熱處理后的蛋白與天然蛋白相比，熒光強(qiáng)度明顯減弱，波長(zhǎng)并沒有明顯的變化，這說明蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸在微環(huán)境中極性不斷增強(qiáng)。進(jìn)一步證實(shí)了熱處理會(huì)改變小麥醇溶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

為了定量分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)小麥醇溶蛋白熱處理前后進(jìn)行圓二色譜分析（圖6-D）。結(jié)果顯示，90℃處理60 min時(shí)，蛋白中-螺旋含量比對(duì)照增加0.7%，而-折疊減少4.4%，說明-折疊轉(zhuǎn)換成了-螺旋和-轉(zhuǎn)角。同時(shí)，無規(guī)則卷曲的增加及-轉(zhuǎn)角的出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了蛋白質(zhì)有序結(jié)構(gòu)的減少。

2.7 小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的小角X射線散射分析

高于蛋白變性溫度的熱處理通常引起蛋白的部分去折疊和隨之發(fā)生的蛋白聚集。通過小角X射線散射（SAXS）進(jìn)一步表征了熱處理前后小麥醇溶蛋白的微觀結(jié)構(gòu)。所有樣品的散射曲線都呈現(xiàn)相似的形狀，并且在較大的值范圍內(nèi)所有曲線都急劇下降，最終收斂（圖7-A）。另一方面，小q范圍內(nèi)散射強(qiáng)度（I（））和散射矢量（）之間的冪數(shù)關(guān)系指數(shù)可用作粒子聚集的分形維數(shù)（df）[12]，df與聚集體的緊密程度有關(guān)，df越高表示結(jié)構(gòu)越緊密[24]。與天然小麥醇溶蛋白相比，90℃熱處理30 min時(shí)df值增大，證明了蛋白質(zhì)的聚集。從SAXS數(shù)據(jù)得出的Kratky圖通常更好地區(qū)分散射強(qiáng)度，以闡明蛋白質(zhì)折疊構(gòu)象和致密性[3]。小麥醇溶蛋白在90℃下熱處理60 min后，其峰值明顯下降（圖7-B），表明蛋白質(zhì)在較高溫度下結(jié)構(gòu)有所改變。

2.8 小麥醇溶蛋白DSC分析

DSC可以根據(jù)圖譜中的吸放熱過程提供蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的信息，測(cè)定其構(gòu)象變化的熱效應(yīng)。用差示掃描量熱儀分析90℃下小麥醇溶蛋白的熱力學(xué)特性，得到的結(jié)果如表1。結(jié)果顯示，小麥醇溶蛋白的變性溫度在187℃左右，并且隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，變性溫度先下降后上升；對(duì)照組的熔化溫度在196.67℃，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，融化溫度上升明顯。說明熱處理改變了小麥醇溶蛋白的變性和融化溫度。由于融化溫度的上升，DSC的能量峰值也在升高。但其所達(dá)到的最高能量從54.33 mW降低到3 mW左右，加熱后的譜圖比較平緩。熱焓的變化說明小麥醇溶蛋白晶體性狀的改變，加熱時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白質(zhì)的構(gòu)象越趨向于無定形態(tài)。蛋白質(zhì)分子吸收的熱量隨溫度的變化主要?dú)w因于蛋白質(zhì)的變性，因此焓的變化與蛋白變性和結(jié)構(gòu)的展開有關(guān)[25]。

A：SDS-PAGE電泳；B：UV光譜；C：內(nèi)源熒光光譜；D：圓二色譜

圖7 不同熱處理下小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的SAXS散射強(qiáng)度曲線（A）和Kratky圖（B）

表1 不同熱處理后小麥醇溶蛋白的DSC結(jié)果

3 討論

熱處理后的小麥醇溶蛋白膠體粒子的泡沫特性得到顯著提高，起泡能力和泡沫穩(wěn)定性均增強(qiáng)。Zhu等[26]研究表明，熱處理后的天然WPI有助于泡沫的形成，而產(chǎn)生的聚合物可以有效地穩(wěn)定泡沫，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)溫和的熱處理可以改善乳清蛋白的起泡性能。另有研究表明，乳清蛋白的纖維化與同等的非纖維熱變性蛋白相比，可顯著提高起泡能力和泡沫穩(wěn)定性[27]，這與本研究的結(jié)果一致。

熱處理溫度的逐漸升高有利于蛋白小顆粒的聚集，當(dāng)溫度達(dá)到90℃時(shí)，顆粒的尺寸顯著增加，蛋白聚集程度更高，原子力顯微鏡也證實(shí)了這一結(jié)果。熱誘導(dǎo)的蛋白聚集會(huì)使泡沫穩(wěn)定性得到增強(qiáng)[28]。乳清蛋白在100℃以下時(shí)觀察到了溶液中可溶性聚集體的出現(xiàn)，平均粒徑為160 nm左右，而不可溶聚集體的數(shù)量也隨著溫度的升高而增加，當(dāng)溫度為90℃時(shí)達(dá)到最大值[29]。熱處理蛋白中未聚集的單體和聚集體的比例對(duì)泡沫穩(wěn)定性有較大的影響[28]，Davis等[30]將在中性條件下80℃加熱處理所得乳清蛋白聚集體與天然蛋白以不同比例混合后，測(cè)定其表面張力，發(fā)現(xiàn)聚集體起到穩(wěn)定泡沫的作用。但是需要控制聚集體的大小，聚集體的尺寸過大，不利于泡沫穩(wěn)定性的改善[6]。本研究中所有粒子的尺寸在150 nm左右，加熱產(chǎn)生的適當(dāng)聚集體可以有效改善小麥醇溶蛋白的泡沫穩(wěn)定性。

熱變性會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等許多構(gòu)象的變化，以及分子間作用力的改變，如氫鍵、疏水相互作用等。小麥醇溶蛋白膠體粒子在熱處理后二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。本研究中，小角X射線散射（SAXS）結(jié)果證實(shí)90℃熱處理后的小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了部分去折疊，DSC中熱焓的變化也說明蛋白質(zhì)分子更趨于無定形態(tài)分布。紫外吸收光譜中峰值的紅移及熒光猝滅的發(fā)生也證實(shí)了這一點(diǎn)。堿熱處理后谷蛋白的小角X射線散射（SAXS）結(jié)果證實(shí)了加熱過程中谷蛋白聚集體尺寸的減小，谷蛋白結(jié)構(gòu)柔性得到增強(qiáng)[31]。熱處理后的谷蛋白聚集體尺寸的減少與本研究結(jié)果相反，原因可能是蛋白質(zhì)的差異性所造成。在Kieffer等[32]的研究中，熱處理后蛋白的CD光譜分析中峰值的增加說明了其-螺旋的增加，其原因是蛋白的處理溫度較低，蛋白變性的程度是穩(wěn)定可逆的。而另有研究發(fā)現(xiàn)[33]，熱處理后乳清蛋白的-折疊增加，-轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲減少，但-螺旋結(jié)構(gòu)沒有變化。95℃加熱15 min條件下制備的大豆蛋白納米顆粒，其蛋白分子內(nèi)疏水殘基暴露，增加了表面疏水性，色氨酸殘基的λmax紅移進(jìn)一步證實(shí)了疏水殘基暴露在了更極端的環(huán)境中[33]。這些結(jié)果與本研究一致。90℃的熱處理引起了小麥醇溶蛋白構(gòu)象的高度伸展，結(jié)構(gòu)柔性增強(qiáng)，分子內(nèi)部的疏水氨基酸暴露導(dǎo)致其表面疏水性的增加，而游離巰基含量并無顯著差異。前人已經(jīng)證實(shí)加熱會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生二硫鍵斷裂，在冷卻的過程中游離的二硫鍵會(huì)發(fā)生重排現(xiàn)象[34]。當(dāng)熱處理溫度低于70℃時(shí)，醇溶蛋白的巰基含量幾乎沒有受到影響[32]。

反溶劑法耦合熱處理改善了小麥醇溶蛋白在水中的分散性，同時(shí)具有良好的泡沫特性。影響小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)變化的信息，對(duì)于更好地解釋熱效應(yīng)對(duì)小麥醇溶蛋白泡沫特性的改善具有極大的幫助。表面疏水性的增加是提高蛋白質(zhì)起泡性質(zhì)的重要原因，而熱效應(yīng)下產(chǎn)生的適當(dāng)聚集體能有效地改善泡沫穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

利用反溶劑法耦合熱效應(yīng)的方法制備小麥醇溶蛋白膠體粒子，結(jié)果表明熱處理可以破壞小麥醇溶蛋白質(zhì)聚集體內(nèi)部的二硫鍵，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的一級(jí)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)了蛋白質(zhì)的聚集，增加了蛋白質(zhì)的表面疏水性和結(jié)構(gòu)柔性。這些變化，使小麥醇溶蛋白的起泡能力和泡沫穩(wěn)定性分別提高了25%和85%。因此，反溶劑法耦合熱效應(yīng)是一種有效改善小麥醇溶蛋白功能特性的方法，在泡沫食品體系中具有較強(qiáng)的應(yīng)用潛力。

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Insight into the Impact of Heat Treatment on the Foamability and Structure of Gliadin Colloidal Particles

WANG LiFeng, ZHU Jie, XIONG WenFei, ZHAO Meng, YUAN Jian, JU XingRong

College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023

【】Gliadin derived from wheat gluten has strong surface hydrophobic properties, and the gliadin colloid particles prepared by ethanol-water solution anti-solvent exhibit outstanding foaming ability and stability. However, the foam properties of gliadin under the action of heat have not been revealed yet. Therefore, in order to further promote the application of gliadin particles in real food systems, the effects of different heating temperatures and heating times on the foaming ability and stability of gliadin particles were studied in this paper. 【】After treating the gliadin at different temperatures (50, 70 and 90℃) for 15, 30 and 60 minutes, the gliadin particles were prepared by the anti-solvent method, and the foaming ability and foam stability were measured. By measuring the size, zeta potential, protein solubility, atomic force microscopy, infrared spectroscopy, fluorescence spectroscopy, circular dichroism, ultraviolet spectroscopy, DSC and small-angle X-ray scattering of the heat-treated wheat gliadin particles, the changing law of its surface morphology and microstructure were analyzed. 【】The results showed that the foaming ability and foam stability of the heat-treated wheat gliadin particles increased by 25% and 85%, respectively. With the increase of the heating temperature and the extension of the heating time, the gliadin particles had partially aggregated; the particle size increases, and it mainly distributed around 105-122 nm, and the zeta potential decreases; the degree of aggregation became greater at 90℃. The heating temperature had no obvious effect on protein solubility, but the solubility of protein has been significantly improved with the increase of heating time; the thermal effect exposed the hydrophobic amino acids inside the protein molecule, resulting in an increase in surface hydrophobicity; the content of disulfide bonds decreases, and the content of free sulfhydryl groups had no significant difference. The reason might be that the SH/SS exchange reaction of the prolamin occurs during the heating process.High temperature treatment changed the secondary structure of wheat gliadin. The fluorescence intensity of the protein at 90℃ decreased, the β-sheet content decreased, while the irregular curl content increased, and the protein was highly stretched, accompanied by partial unfolding. DSC results showed that the highest energy of wheat gliadin particles decreased from 54.33 mW to about 3 mW, the spectrum after heating was relatively flat, and the protein conformation tended to be amorphous with the extension of heating time.【】The thermal effect caused the wheat gliadin particles to aggregate, and the exposure of the hydrophobic groups in the protein enhanced the hydrophobicity of the particle surface. Heat treatment improved the structural flexibility of the wheat gliadin (especially the 90℃ treatment), which was more conducive to the formation of stability. The interfacial film could better stabilize the foam and effectively improve the foam characteristics of the wheat gliadin colloid particles, which had outstanding practical significance for enhancing its application in the food industry.

gliadin; foamability; structural flexibility; surface hydrophobicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2021.04.013

2020-06-23；

2020-10-14

江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（JATS[2020]468）、國家優(yōu)質(zhì)糧食工程（南京）技術(shù)創(chuàng)新中心項(xiàng)目

王立峰，E-mail：wanglifeng_8@nufe.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）